Bài giảng Tạo giống bằng công nghệ tế bào - Bài 3: Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật - Phan Lữ Chính Nhân

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật ThS. Phan Lữ Chính Nhân THU NHẬN MẪU MÔ CẮT NHỎ (chọn lọc mẫu mô quan tâm, cắt bỏ phần mô chết) Cắt nhỏ (mảnh nhỏ để nuôi) Nuôi mẫu mô sơ cấp Thu nhận tế bào mới Thu mảnh mô thứ cấp Tách tế bào bằng cơ học (nghiền, ép) NUÔI SƠ CẤP Cấy chuyền DÒNG TẾ BÀO Tách tế bào bằng enzym (ủ) Trypsin lạnh Trypsin ấm Ly tâm Collagenas e Tái huyền phù Hai kiểu nuôi cấy sơ cấp KIỂU 1: NUÔI CẤY MẢNH MÔ SƠ CẤP Là việc nuôi cấy các mảnh mô in vitro. Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào từ mảnh mô sẽ phát triển lan ra từ vùng mô trung tâm. KIỂU 2: NUÔI CẤY SƠ CẤP TẾ BÀO ĐƠN Là việc nuôi cấy các tế bào đơn đƣợc tách ra từ mảnh mô. Trong quá trình nuôi, từng mỗi tế bào sẽ phát triển tăng sinh thành nhiều tế bào mới. NUÔI CẤY MẢNH MÔ SƠ CẤP (mảnh mô ung thư vú) Thu nhận tế bào đơn nhân tủy xương chuột Nuôi cấy chọn lọc tế bào Tua (DC) từ tủy xương chuột NUÔI CẤY SƠ CẤP HUYỀN PHÙ TẾ BÀO ĐƠN (thu từ máu cuống rốn) Quy trình nuôi cấy sơ cấp Nuôi cấy Xử lí mẫu Nuôi cấy tế bào đơn: Tách mô thành tế bào đơn Nuôi cấy mảnh mô: Cố định mảnh mô Thu nhận mẫu Thu nhận mẫu • Các mẫu thu nhận có thể bao gồm bất kì mô sống nào của cơ thể. • Trƣớc hết phải làm sạch mô tại vị trí lấy mẫu bằng cồn, cho mô vào dung dịch PBS, nhanh chóng chuyển về phòng thí nghiệm. • Tùy loại mẫu mô cũng nhƣ thời gian cần thiết vận chuyển về phòng thí nghiệm: có kế hoạch vận chuyển chúng trong điều kiện thích hợp. Bảo quản mẫu Bảo quản mẫu Xử lí mẫu đối với nuôi cấy huyền phù tế bào đơn Các tế bào động vật trong khối mô liên kết chặt chẽ với nhau nhờ các cầu nối hình thành giữa các tế bào với nhau. Biện pháp: – (1) tác dụng một lực cơ học để bẻ gãy những cầu nối. – (2) dùng enzym để phân hủy các cầu nối nói trên. Cắt nhuyễn Ép nhuyễn Tách bằng màng lọc Biện pháp cơ học Phương pháp cắt nhuyễn Sử dụng lục sơ học bẻ gãy các cầu nối liên bào: dùng kéo, dao cắt nhuyễn các mảnh mô. Huyền phù vào dịch PBS, để lắng, thu dịch trong Phương pháp ép nhuyễn Ép nhuyễn mô: dùng 2 phiến lame ép chặt mảnh mô để thu tế bào đơn đối với những mô có liên kết yếu. Phương pháp tách bằng màng lọc Tách bằng màng lọc tế bào (Cell strainer): kích thƣớc lỗ trên màng từ 70–100 µm, chỉ cho những tế bào đơn có kích thƣớc tƣơng ứng qua màng. Tách mô thành tế bào đơn bằng enzym • Quy trình trypsin ấm • Quy trình trypsin lạnh Quy trình trypsin ấm Quy trình trypsin lạnh Cắt mẫu mô [2 – 3mm], rửa nhiều lần với PBS vô trùng Thay PBS bằng trypsin 0.25% Ủ trong 40C, 6- 18 giờ Loại bỏ trypsin ủ ống chứa mẫu mô trong 36,50C, 20 – 30 phút Thêm môi trƣờng, sục nhẹ nhành cho đến khi mô rời ra Nếu các mảnh mô chƣa rời ra có thể thêm môi trƣờng để dễ huyền phù hoặc dùng màng lọc Thu dịch huyền phù tế bào, xác định mật độ, tiến hành nuôi Tách tế bào bằng phương pháp khác • Phƣơng pháp ly tâm theo gradient tỉ trọng • Phƣơng pháp tách tế bào dựa vào marker bề mặt Phương pháp ly tâm theo gradient tỉ trọng Phương pháp tách tế bào dựa vào marker bề mặt tế bào Xử lí mẫu đối với nuôi cấy mảnh mô Đặt mảnh mô vào dụng cụ nuôi Mảnh mô nổi Cố định mảnh mô Mảnh mô sống Thành công Phương pháp cố định mảnh mô • Lammel • Huyết thanh • Tăng kết dính và lật ngược bình nuôi Nuôi cấy (1)ủ trong tủ nuôi cấy, 370C (2) Thay môi trường mới sau một thời gian tùy loại tế bào (1) Ly tâm thu tế bào đơn (2) Tái huyền phù trong môi trường nuôi (3) Cho vào bình nuôi cấy Sau khi cố định mảnh mô, bổ sung môi trường nuôi cấy Cấy chuyền • Hút bỏ môi trƣờng nuôi cấy cũ. • Rửa bề mặt giá thể nuôi (có tế bào bám dính). • Tách các tế bào bám khỏi bề mặt dụng cụ nuôi. • Pha loãng các tế bào bằng môi trƣờng mới. Cấy chuyền tế bào bám dính Loại bỏ môi trường khỏi bình nuôi Rửa bề mặt bình nuôi với PBS (free Ca2+ Mg2+) Bổ sung dung dịch trypsin/EDTA 0.25% (1- 2ml/bình) Ủ trong tủ ấm 370C Khi tế bào co tròn, nổi lên tiến hành bổ sung một lượng môi trường có chứa huyết thanh Rửa loại bỏ trypsin bằng cách ly tâm 3000 vòng/phút Tái huyền phù và pha loãng theo tỉ lệ đề nghị là 1:4 Nuôi cấy tế bào trong các flask nuôi cấy hay các spinner có thể đƣợc duy trì bằng cách pha loãng tƣơng đƣơng của huyền phù tế bào bằng môi trƣờng tƣơi: (1) Giữ flask thẳng đứng, dùng pipette huyền phù vài lần để tách cụm các tế bào. (2) Hoặc tách một lƣợng huyền phù để đếm, hoặc chuyển 200µl thành 1mL huyền phù vào bình nuôi chứa 10mL môi trƣờng Cấy chuyền tế bào huyền phù Spinner bioreactor THU NHẬN MẪU MÔ CẮT NHỎ (chọn lọc mẫu mô quan tâm, cắt bỏ phần mô chết) Cắt nhỏ (mảnh nhỏ để nuôi) Nuôi mẫu mô sơ cấp Thu nhận tế bào mới Thu mảnh mô thứ cấp Tách tế bào bằng cơ học (nghiền, ép) NUÔI SƠ CẤP Cấy chuyền DÒNG TẾ BÀO Tách tế bào bằng enzym (ủ) Trypsin lạnh Trypsin ấm Ly tâm Collagenas e Tái huyền phù 34 Thu nhận cơ quan Cell line Cấy chuyền Cấy chuyền Nuôi sơ cấp Nuôi mô Cắt nhỏ Thành tế bào đơn Nuôi sơ cấp 35 Tách rời tế bào Tách bằng tác nhân khác (EDTA) Tách bằng enzym Trypsin Trypsin ấm Trypsin lạnh Collagenase Papain Elastas Tách bằng enzyme MỘT SỐ ENZYME PHÂN CẮT THƯỜNG DÙNG Trypsin: Chymotrypsin Collagenase Papain Elastase • pH6-9, tối ưu 8-9 • Nồng độ dùng: 0,01%-0,5% • Ca2+ được xem như chất bảo vệ Trypsin • Bị kìm hãm bởi FBS hoặc Di-Isopropyl- Fluorophosphat(DFP) • Không đặc hiệu cho loại protein: Cắt liên kết –COOH của lysin/arginin và –NH2  có thể gây hư hai cho tế bào • pH 7-9, thích hợp 8-9 • Cắt liên kết peptide tạo bởi –COOH acid amin thơm với – NH2 • Tính đặc hiệu kém hơn trypsin • Bị ức chế bởi DFB • • Hoạt động tốt: pH7-8, < 450C • Cắt liên kết peptide dạng poly-L prolin; gồm 4 loại đặc trưng tắt từng loại mô chuyên biệt ít làm hư hại tế bào • pH 4,5-8,5 • Bị kìm hãm bởi chất oxy hoá • Phân huỷ elastin • Sử dụng kết hợp với enzyme khác TẠO DÒNG TẾ BÀO KHÁI NIỆM- ĐẶC TÍNH MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP XÂY DỰNG ĐƢỜNG CONG TĂNG TRƢỞNG VÀ ĐO SỰ PHÁT TRIỂN 39 40 41 Tiêu chí lựa chọn dòng tế bào cho thí nghiệm • Loài • Đặc điểm chức năng • Hữu hạn hay liên tục • Bình thường hay chuyển dạng • Điều kiện và đặc tính tăng trưởng Mô Phân tách Tế bào đơn Nuôi sơ cấp Pha loãng tới hạn Vòng nhẫn Tách tế bào tự động Clone phát triển Douglas C. McFarland Methods in Cell Science 22: 63–66 (2000). 43 Giếng tế bào gốc C h u ỗ i p h a Lo ãn g lầ n 1 Chuỗi pha Loãng lần 2 45 Nhuộm crystal violet 47 VÒNG NHẪN (Cloning ring) 48 Phân lập Clones (Huyền phù) 50 Quy trình nuôi cấy sơ cấp tế bào ADSC Bước 1: Xử lí sơ bộ mẫu • Nếu mỡ hút, cho trực tiếp vào bình dạng phễu • Nếu dạng khối mỡ nguyên thì phải cắt nhuyễn rồi cho vào bình dạng phễu 100mL mỡ Bước 2: Rửa mẫu bằng WB1 (2 lần) • Thêm 50mL WB1 • Ly tâm 400g trong 5 phút 100mL mỡ + 50mL WB1 Sau ly tâm loại bỏ dịch rửa • Cho toàn bộ 30mL (SE+WB3) vào, ủ ở 370 C, 30 phút • Lắc đều sau mỗi 5 phút 370C Bước 3 : Phân tách mẫu Trước khi ủ Sau khi ủ 30 phút Ly tâm 800g trong 10 phút Trƣớc ly tâm Sau ly tâm Phần mỡ vàng óng chiếm > 70% Loại bỏ dịch nổi và mô mỡ thừa,thu cặn tế bào Dịch nổi + mỡ thừa Cặn tế bào Thêm 30mL WB3 vào, lắc đều Ly tâm 800g 5 phút, loại dịch nổi, thu cặn tế bào Bước 4: Rửa tế bào với WB3 Thu cặn tế bào sau ly tâm Sau ly tâm Cặn tế bào Cặn tế bào Nuôi cấy Mục đích khác Tế bào thu từ mô mỡ được nuôi cấy trong môi trường không huyết thanh Sau 48 giờ Sau 96 giờ Ứng dụng trị loét chân do tiểu đường Quy trình nuôi cấy sơ cấp tế bào thần kinh Bước 1: xử lí sơ bộ mẫu Chọn chuột thai khoảng 14 ngày tuổi Giết chuột thai đột ngột bằng cách kéo giãn cột sống Sát khuẩn chuột thai bằng cồn 960C Mổ khoang bụng, và thu nhận hai nhánh tử cung chứa thai chuột Ngay lập tức chuyển hai nhánh tử cung vào PBS 5X đã đƣợc làm ấm ở 37oC. Bước 2: thu nhận tế bào Loại bỏ tử cung, màng phôi và mỡ bám xung quanh thai chuột. Cho thai chuột vào becher rửa bằng PBS 10X khoảng 3 – 4 phút. Chuyển thai chuột sang đĩa Petri, và thu nhận đầu chuột thai. Rửa sạch đầu chuột thai bằng PBS 5X khoảng 2 – 3 phút trong becher Chuyển đầu chuột thai sang đĩa Petri, mổ hộp sọ nhẹ nhàng để thu nhận não chuột. Cắt nhuyễn mô não và chuyển não chuột vào ống ly tâm 15ml. Sau đó, huyền phù hóa liên tục mô cắt nhuyễn bằng Pipet pasteur Tiến hành lọc dung dịch huyền phù với màng lọc tế bào đơn Thu nhận dung dịch chứa tế bào đơn và đem li tâm ở tốc độ 2500 vòng/phút Đổ bỏ hoàn toàn dịch phía trên, thu cặn dưới đáy Facol chứa tế bào đơn Nuôi cấy sơ cấp tế bào thần kinh a) d) c) b) Nuôi cấy sơ cấp tế bào tủy răng Tế bào sơ cấp (nuôi tế bào rời) d2 d4 d5 d7 d2 d7 d12 d15 d19 d21 Tế bào sơ cấp (nuôi mảnh mô) Quy trình thu và phân tách tế bào tủy xương người Quy trình thu và phân tách tế bào tủy xương người Quy trình thu và phân tách tế bào tủy xương người Quy trình thu và phân tách tế bào tủy xương người Quy trình thu và phân tách tế bào tủy xương người Quy trình thu và phân tách tế bào tủy xương người Quy trình thu và phân tách tế bào tủy xương người