Đề tài Cây dừa cạn Catharanthus roseus và nhóm hợp chất Vinca alkaloid

đếm số lượng bạch cầu trước mỗi liều. Việc sử dụng thường bị hạn chế bới tác dụng độc về thần kinh. Liều dùng: Tiêm tĩnh mạch mỗi tuần một lần trong bệnh bạch cầu lymphô cấp tính của trẻ dưới 12 tuổi, bắt đầu 0,03 - 0,075 mg/kg cho trẻ em 10 tuổi và 0,05 - 0,15 mg/kg cho trẻ em 1 tuổi, 1 liều trong tuần đầu,tiếp theo bởi những trị số gia tăng hàng tuần 0,025 mg/kg cho tới 1 liều tối đa 0,15mg/kg. Sau đó dùng 1 thuốc khác để duy trì, ở những bệnh nhân từ 12 – 20 tuổi, tiêm tĩnh mạch 1,5 – 4,5mg/m2 diện tích bề mặt cơ thể một lần trong 1 tuần cùng với prednisone (uống 40mg/m2, 1 lần trong mỗi ngày), cho tới khi đạt sự thuyên giảm bệnh. Dùng những thuốc khác để duy trì. Người lớn: 0,025 – 0,075 mg/kg, mỗi tuần 1 lần, tùy theo những tác dụng phụ và hiệu quả điều trị mà điều chỉnh liều khi cần thiết. Điều kiện lưu trữ: giữ ở 2-80C, bảo quản lạnh, không làm đông, tránh ánh sáng. CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH Phương pháp chiết tách dùng chất lưu siêu tới hạn Khái niệm chiết suất siêu tới hạn: Là quá trình phân tách một hay một số chất từ hỗn hợp (dược liệu, hỗn hợp nguyên liệu) bằng cách sử dụng chất lỏng CO2 siêu tới hạn như một dung môi. Khi ở trạng thái này CO2 có đặc tính về độ tan tương tự như một chất lỏng đồng thời có khả năng khuếch tán và  độ nhớt gần với chất khí, nhờ vậy chúng có khả năng khuếch tán và hòa tan nhanh các hoạt chất trong nguyên liệu. Gore (1891) là người đầu tiên phát hiện ra khả năng hòa tan tốt của Naphtalen và Camphor trong CO2 lỏng. Sau đó  Andrews (1875) đã nghiên cứu về đặc tính của CO2 ở trạng thái siêu tới hạn. Tuy nhiên, tới đầu những năm 1970 công nghệ chiết xuất các hợp chất tự nhiên bằng dung môi CO2 siêu tới hạn (SC-CO2) mới thực sự phát triển và đi vào ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm như: loại cafein trong cà phê và chè xanh, chiết xuất dầu vừng đen, chiết polyphenol từ chè xanh, loại bỏ cholesterol trong thực phẩm, loại alcol trong đồ uống, chiết xuất phẩm màu, chiết xuất các hoạt chất chống oxy hóa, chiết xuất tinh dầu, hương liệu từ thực vật sử dụng trong mỹ phẩm, thực phẩm…  3.1.2 Ưu điểm của SC-CO2 trong chiết xuất hoạt chất tự nhiên: CO2 có điểm tới hạn thấp (nhiệt độ gần như ở nhiệt độ phòng, áp suất thấp) vì vậy các hoạt chất ít bị oxy hoá hay phân huỷ bởi nhiệt độ và oxy hoà tan,  ngoài ra vấn đề thiết kế hệ thống chiết xuất đảm bảo đủ áp lực siêu tới hạn cũng dễ dàng hơn nên khả năng ứng dụng cho quy mô sản xuất công nghiệp cũng thuận lợi. Sản phẩm sau khi chiết không còn tồn dư dung môi vì CO2 dễ dàng chuyển sang trạng thái khí và bay hơi toàn bộ sau khi giảm áp suất, nhiệt độ xuống dưới điểm tới hạn. Vì vậy, chiết xuất theo phương pháp này rất phù hợp đối với các sản phẩm dùng làm thực phẩm, thuốc, mỹ phẩm. Khả năng chiết xuất chọn lọc do: Độ tan của SC-CO2  thay đổi khi áp suất và nhiệt độ đạt siêu tới hạn thay đổi vậy nó sẽ hoà tan chọn lọc các chất khác nhau ở nhiệt độ, áp suất tương ứng. Thông thường các tinh dầu dễ bay hơi có thể được chiết ở áp suất dưới 100bar, trong khi các chất béo được chiết ở áp suất cao hơn.   Dung môi SC-CO2  sẽ phân cực hơn khi được hoà trộn với các dung môi phụ trợ phân cực như: methanol, ethanol vì vậy khả năng hoà tan các hợp chất sẽ đa dạng hơn. Tuy nhiên các dung môi phụ trợ có thể làm thay đổi điểm tới hạn của CO2 do đó trong thực nghiệm cần phải khảo sát tỷ lệ dung môi phụ trợ thích hợp để ít ảnh hưởng đến điểm tới hạn.   Thời gian chiết xuất ngắn: Do chất lỏng siêu giới hạn có hệ số khuếch tán cao hơn chất lỏng, trong khi độ nhớt thấp, sức căng bề mặt nhỏ nên khả năng khuếch tán của dung môi vào trong tế bào nhanh hơn vì vậy thời gian chiết được rút ngắn hơn chất lỏng thông thường. Không thay đổi hoặc mất hương thơm, màu sắc  tự nhiên ban đầu của hoạt chất.  Không tạo ra mùi ,vị lạ do SC-CO2 là chất trơ, không mùi vị và bay hơi hoàn toàn khi thay đổi trạng thái siêu tới hạn. CO2 không ăn mòn thiết bị, không gây cháy nổ trong quá trình vận hành, an toàn, thân thiện với môi trường, giá thành rẻ, dễ kiếm, ngoài ra có thể tái sử dụng trong thời gian dài. Trong trường hợp của vinca alkaloid, vindoline được tách chiết nhờ SFE. Theo như một nghiên cứu nhằm tối ưu hóa trong quá trình thực hiện, một lượng đáng kể vindoline (58% lượng chất khô) đã được tách chiết từ lá của Catharanthus roseus sử dụng SFE dưới điều kiện nhiệt độ là 350C và áp suất 300 bar. [6] Hình 15: Sơ đồ quá trình chiết tách bằng SFE Phương pháp chiết tách dùng bình chiết Soxhlet [6] (Soxhlet extraction) Quá trình chiết các ankaloid được thực hiện trên máy Soxhlet gồm có: bình cầu, trụ chiết, ống sinh hàn và bếp điện. Nguyên liệu được nghiền nhỏ, cho vào túi giấy lọc hoặc dùng ống hình trụ để cho mẫu vào. Cho túi nguyên liệu vào trụ chiết, lắp trụ chiết vào bình cầu, cho dung môi vào bình chiết đến ngập túi nguyên liệu, lắp ống làm lạnh, ngâm nguyên liệu trong dung môi một vài giờ. Đặt máy Soxhlet vào nồi cách thủy. Ta sẽ thu được alkaloid. Hình 16: Bình Soxhlet Phương pháp chiết tách solid – liquid [6] Phương pháp solid-liquid là quá trình loại bỏ một hoặc nhiều chất tan từ một chất rắn bằng cách sử dụng dung môi lỏng. Phương pháp chiết tách này được sử dụng trong công nghiệp hóa chất khi mà các phương pháp cơ học và nhiệt không thể áp dụng. Chất chiết từ cây C.roseus là một hỗn hợp phức tạp của các alkaloid với một phạm vi phân cực rộng. Quy trình của phương pháp chiết tách solid-liquid truyền thống cho Catharanthus alkaloid bắt đầu từ việc ngâm nguyên liệu trong môi trường acid, chủ yếu dựa trên đặc tính tổng hợp của chúng. Các alkaloid sẽ hình thành dạng muối khi ngâm trong môi trường acid để cải thiện độ tan và tăng sự ổn định tại giá trị pH thấp. Thêm vào đó, proton trong dung dịch acid sẽ hỗ trợ trong việc bẻ gãy các liên kết nên sẽ giải phóng analyte dễ dàng hơn. Phương pháp tách chiết bằng nước nóng [6] (hot water extraction-HWE) HWE là một trong những phương pháp dùng để tinh sạch các hợp chất hữu cơ tự nhiên. Phương pháp này đang ngày càng được nghiên cứu và áp dụng. Đó là dùng nước nóng đang ở dạng lỏng, điều kiện nhiệt độ và áp suất có thể khác nhau từ 1000C-3740C và 1 bar -219 bar. Tuy nhiên quá trình thường được thực hiện trong khoảng nhiệt độ 100-1800C trên những áp lực bão hòa tương ứng 2-30bar để các pha lỏng được duy trì. Khi hơi nước đi qua mẫu, nó mang các hợp chất hòa tan được trong nó đi theo, sau đó chúng được ngưng tụ để thu được chất mong muốn. Hình 17: Sơ đồ một bộ chưng cất lôi cuốn hơi nước Sắc ký lỏng cao áp hiệu năng cao [4] Cùng với sự ra đời của các vật liệu hiệu quả cao, cũng như sự tiến bộ về trang thiết bị cho phép thực hiện đầy đủ năng lức của các vật liệu này, kỹ thuật HPLC đã phát triển vô cùng mạnh mẽ và vững chắc hơn so với các phưong pháp sắc ký khác. Định nghĩa: HPLC là kỹ thuật tách hỗn hợp trên cột đựoc nhồi bằng các hạt có kích thứoc ≤ 10 µm. Trong đó, ngừoi ta dùng một bơm có áp suất cao ≈ 300atm để đẩy pha động qua cột với tốc độ dòng khoảng vài ml/phút và cho phép phân giải nhanh một lựong mẫu nhỏ khoảng 20µg. Ưu điểm: Trong sắc ký khí, các hỗn hợp đựoc khảo sát trong pha hơi, vì vậy cần phải tạo một chất hơi ổn định từ hỗn hợp cần phân tích, hoặc chuyển các chất trong hỗn hợp thành các dẫn chất bền với nhiệt. Chỉ có khoảng 20% các hợp chất hoá học thích hợp cho sắc kí khí mà không cần phải biến đổi mẫu thành một dạng khác, số còn lại đều không bền với nhiệt và không bay hơi. Hơn nữa, các chất có các nhóm chức rất phân cực hay có thể ion hoá thừong có khuynh hứong kéo đuôi, không thích hợp khi áp dung sắc ký khí. Vì thế HPLC là một kĩ thuật tốt hơn đối với các đại phân tử, các loại chất vô cơ và ion hoá, các hợp chất thiên nhiên không bền, các hỗn hợp thuốc và các chất hoá sinh. Trong sắc kí khí chỉ có một pha (pha tĩnh lỏng hay rắn) là sẵn sàng tưong tác với các phân tử của mẫu. Vì pha động là một chất khí, tất cả hơi của mẫu đều tan trong chất khí này. Trong HPLC, cả pha tĩnh lẫn pha động có thể tương tác một cách chọn lọc với mẫu. Các tương tác như tạo phức hay liên kết hydrogen không có trong pha động của sắc ký khí có thể xảy ra trong pha động của HPLC. Nhiều loại tương tác chọn lọc khác nhau này cũng có thể được gia tăng bởi sự biến đổi hoá học thích hợp của bề mặt silica, vì thế HPLC là một kĩ thuật linh hoạt hơn sắc ký khí và thường có thể thực hiện được trên các phân tử tách khó hơn. Nhược điểm: Xét cả về đầu tư trang thiết bị lẫn phí tổn vận hành, HPLC là một kĩ thuật đắt tiền, hơn cả sắc ký khí. 3.5.2 Cấu tạo và hoạt động của máy sắc ký lỏng cao áp HPLC: Thiết bị cơ bản máy HPLC bao gồm: Bình chứa pha động Bơm tạo áp lực cao và hệ thống tạo ra việc rửa giải đẳng môi hay rửa giải tiệm tiến ( pump + gradient system) Bộ phận tiêm mẫu (injection unit) để đưa mẫu vào cột. Cột đựoc nhồi với pha tĩnh có hiệu quả cao. Cột có thể đựơc đặt trong một bộ phận điều nhiệt. Bộ phận phát hiện và hệ thống xử lý dữ liệu Máy ghi (recorder) hoặc máy vi tính để ghi hoặc lưu giữ sắc kí đồ Pha tĩnh trong HPLC là các phân tử có kích thứoc rất nhỏ, đựoc gọi là chất nhồi vi tiểu phân, chúng thường đồng dạng, có hình cầu hoặc hình dạng bất định, đừong kính 10, 5, hay 3 µm. Cơ chế phân tách có thể đựoc thực hiện bằng các nhóm hoá học liên kết vào bề mặt của các tiểu phân silica để tạo ra các pha liên kết. Hiện nay, pha liên kết thông dụng nhất đựoc sử dụng trong HPLC là ODS, trong đó nhóm ankyl 18 carbon được gắn vào bề mặt của các tiểu phân silica. Khi được nhồi vào cột, kích thước nhỏ của các vi tiểu phân dẫn đến sự đề kháng đáng kể với sự chảy của dung môi, vì thế pha động phải được bơm qua cột bằng một áp lực cao. Cột và toàn bộ hệ thống cột phải chịu được áp suất sử dụng và cũng phải đề kháng về mặt hoá học với các dung môi pha di động, chúng thường phải được chế tạo bằng thép không gỉ. Pha động được bơm qua cột với vận tốc vài ml/phút. Nêu thành phần pha động không đổi, phưong pháp được gọi là rửa giải đẳng môi. Ngược lại, nếu thành phần của pha động có thể được làm thay đổi theo một cách định trước trong lúc phân tách, phương pháp được gọi là rửa giải tiệm tiến. Rửa giải tiệm tiến thích hợp cho các mẫu thử nghiệm chứa các chất có độ phân cực khác nhau nhiều, cần đến sự thay đổi độ phân cực của hỗn hợp dung môi trong quá trình tách. Sau khi qua cột, các chất tan tách ra được ghi nhận bằng một bộ phận phát hiện lắp đặt trong hệ thống. Thông tin đưa ra của bộ phận phát hiện là một tín hiệu điện, sự biến đổi của tín hiệu này được biểu hiện trên một máy đo thế năng, một dụng cụ tích phân vi tính, hoặc một màn hình của máy tính. Phần lớn các bộ phận phát hiện phổ biến trong HPLC là bộ phận phát hiện chọn lọc, chúng không thể đáp ứng với tất cả chất tan có trong hỗn hợp. Do vậy, sẽ có một số chất tan không được phát hiện trong HPLC, chúng cần phải được chuyển thành một dạng khác có thể phát hiện được sau khi ra khỏi cột, phương pháp này gọi là phương pháp tạo dẫn chất sau cột ( post-column derivatisation). CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO TẾ BÀO C.roseus Nuôi cấy mô và ý nghĩa của nuôi cấy mô [2] Giới thiệu Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương thức nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô trùng. Môi trường có các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, các hormone tăng trưởng và đường. Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên cơ sở lý luận khoa học về tính toàn năng và khả năng phân hóa, phản phân hóa của tế bào thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan (sự phát sinh cơ quan) từ các mô như: lá, thân, hoa hoặc rễ Tính ưu việt của nuôi cấy mô tế bào thực vật So với các phương pháp nhân giống tự nhiên khác thì phương pháp nuôi cấy mô đã là một động lực thúc đẩy công nghệ sinh học và nông nghiệp phát triển vì phương pháp này có những ưu điểm sau: Không phụ thuộc vào thời tiết, thời vụ, quá trình được thực hiện trên diện tích không lớn, ở bất kì địa thế nào, có thể kiểm tra khống chế các hướng nghiên cứu theo ý muốn. Tạo được một số lượng lớn cây con trong một thời gian ngắn với tính đồng nhất cao về mặt di truyền, phù hợp với nhu cầu thị trường. Là phương pháp phục tráng giống cây bị nhiễm bệnh, thoái hóa để tạo giống cây khỏe mạnh. Giúp bảo quản giống cây dễ dàng bằng cách tạo ra các thể phôi hay bảo quản lạnh. Tạo ra các dòng đột biến, các dòng siêu sản xuất, tăng tần số đột biến trong di truyền đột biến ở thực vật bậc cao. Nuôi cấy mô dung hợp protoplast có thể kết hợp nhiều tính trạng mong muốn trong chọn giống cây trồng. Giảm chi phí vận chuyển từ nơi này đến nơi khác giúp việc trao đổi giống giữa nơi này đến nơi khác được dễ dàng. Tạo ra các sản phẩm tự nhiên như ở các cây bình thường như dược phẩm, thuốc nhuộm, hương liệu… Một số kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật. Nuôi cấy cơ quan Có thể sử dụng kỹ thuật này để nuôi cấy các bộ phận của cây như lá, rể…Tuy nhiên hướng ứng dụng này không được áp dụng rộng rãi. Kỹ thuật nuôi cấy cơ quan thường được áp dụng trong nước như: cắt lá, cành từ lô ống nghiệm đã tái sinh cây, cấy chuyền sang các lô ống nghiệm tiếp theo. Nuôi cấy mô phân sinh (meristem) Mô phân sinh thường là các mô đỉnh chồi và cành có kích thước 0.1mm ÷ 1cm. Các mô phân sinh dùng để nuôi cấy thường tách từ các mầm non, các chồi mới hình thành hoặc các cành non. Đối với nuôi cấy mô phân sinh sự cân bằng giữa các chất điều hòa sinh trưởng rất quan trọng. Muốn kích thích tạo chồi cần bổ sung cytokinine hoặc tổ hợp cytokinine với auxin. Muốn tạo rễ thì bổ sung các auxin như NAA, IAA,... Nuôi cấy mô phân sinh được sử dụng để loại virus tạo cây sạch virus và nhân giống in vitro. Nuôi cấy mô phân sinh còn được sử dụng để nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan, tạo cây đa bội qua xử lý colchicin. Kỹ thuật này được dùng rất nhiều trong công tác phục tráng cây trồng bị nhiễm virus nên còn được gọi là phương pháp tạo cây sạch bệnh. Phương pháp này có từ năm 1937, tuy nhiên đến năm 1949 Linesset và Cornuet mới bắt đầu tiến hành nuôi cấy đỉnh sinh trưởng ở cây thuốc lá. Sau đó, Morel và Martin đã nuôi cấy thành công đỉnh sinh trưởng cây thược dược (1952) và Cymbidium (1960). Nuôi cấy mô sẹo (callus) Mô sẹo là một khối tế bào không có tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt ( vết thương, xử lý với các chất điều hòa sinh trưởng thực vật…) Để nuôi cấy mô sẹo, người ta có thể sử dụng hầu hết các cơ quan đang còn sống của thực vật như: thân, lá, cuống…Tuy nhiên, người ta thường sử dụng các mẫu cấy còn non để quá trình cảm ứng của mẫu xảy ra dễ dàng hơn. Nuôi cấy mô sẹo được áp dụng trong nhiều trường hợp: Nhân giống in vitro đối với loài thực vật mà phương pháp nhân giống bằng đỉnh sinh trưởng có hiệu quả không cao. Làm nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào đơn, thu nhận các hợp chất thứ cấp. Nghiên cứu các quá trình hình thành cơ quan. Nuôi cấy huyền phù tế bào Huyền phù tế bào là một môi trường lỏng được lắc liên tục, trong đó có sự hiện diện của những tế bào soma cô lập hoặc những cụm nhỏ các tế bào có khả năng sinh phôi có thể tái sinh thành một thực vật nguyên vẹn ( Henshaw và cộng sự, 1965; Torres 1989). Sự tạo huyền phù tế bào có khả năng sinh phôi trong môi trường lỏng được lắc liên tục và sự tái sinh thực vật từ huyền phù tế bào này là hai giai đoạn quan trọng cần thiết cho phép thực hiện sự nhân giống in vitro ở mức độ công nghiệp. Ngoài ra các giai đoạn này cũng cần thiết cho việc sử dụng các tác nhân vật lý, hóa học nhằm tuyển chọn các đặc tính thích hợp để phục vụ cho nhu cầu sống cầu sống của con người mà đặc biệt là các kỹ thuật chuyển gen như bắn DNA, dung hợp tế bào…cũng như mọi thao tác ở mức tế bào. Tạo phôi soma – tạo hạt nhân tạo Trong môi trường nuôi cấy thích hợp thì mô cấy hay tế bào có thể phát triển thành phôi vô tính. Phôi được bọc bằng lớp vỏ bọc chứa nội nhũ nhân tạo thành hạt nhân tạo. Có hai cách tạo phôi vô tính là: phát sinh phôi trực tiếp và phát sinh phôi gián tiếp. Sự ghi nhận đầu tiên về nuôi cấy phôi là công trình của Charles Bonnet ở thế kỷ XVIII. Ông tách phôi Phascolus và Fagopyrum trong trong đất và nhận được cây nhưng là cây lùn. Từ đầu thế kỷ XX các công trình nuôi cấy phôi dần được hoàn thiện hơn. Từ các công trình nghiên cứu trước đó, Knudson (1922) đã nuôi cấy thành công phôi cây lan trong môi trường chứa đường và khám phá ra một điều là nếu thiếu đường thì phôi không thể phát triển thành protocorm. Raghavan (1976, 1980) đã công bố rằng phôi phát triển qua hai giai đoạn dị dưỡng và tự dưỡng. Ở giai đoạn dị dưỡng (tiền phôi) cần có các chất điều hoà sinh trưởng để phát triển. Trong giai đoạn tự dưỡng sự phát triển của phôi không cần chất điều hoà sinh trưởng. Đối với nuôi cấy phôi, như đã biết đường đóng vai trò rất quan trọng. Trong nhiều trường hợp thì đường sucrose cho kết quả tốt hơn các đường khác. Ngoài ra một số chất tự nhiên như nước dừa, nước chiết malt, casein thuỷ phân, là những chất rất cần trong nuôi cấy phôi. Các chất kích thích sinh trưởng như GA3, auxin, cytokinine thường được dùng nhiều trong nuôi cấy phôi Các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi nuôi cấy in vitro. Thường phôi nuôi cấy cần nhiệt độ và ánh sáng thấp hơn phôi phát triển tự nhiên. Nuôi cấy hạt phấn và bao phấn đơn bội Nguyên liệu cho phương pháp này là bao phấn hoặc hạt phấn tách rời, tình trạng vật lý của cây và kiểu gen ảnh hưởng đáng kể đến sự thành công của việc nuôi cấy bao phấn. Ngoài ra, trạng thái của hạt phấn cũng rất quan trọng. Nuôi cấy tế bào trần Tế bào trần (protoplast) là tế bào đã bị loại bỏ vách cứng, chỉ còn lại màng tế bào bao bọc xung quanh. Người ta có thể tiến hành lai, dung hợp giữa các dạng tế bào trần với nhau, sau đó lại tái tạo màng và vách tế bào. Việc dung hợp tế bào trần giúp tạo các cơ thể lai mà phương pháp lai hữu tính không thể tiến hành được. Chất điều hòa sinh trưởng [2] Thuật ngữ chất điều hoà sinh trưởng thực vật (Plant growth regulator, PGR) đã được dùng rất nhiều bởi các công ty nông dược để chỉ các chất điều hoà sinh trưởng tổng hợp. Định nghĩa của Van Overbreek và cộng tác viên (1954) vẫn còn được dùng đến ngày nay. “Chất điều hoà sinh trưởng thực vật là những hợp chất hữu cơ khác với những chất dinh dưỡng, với một hàm lượng nhỏ kích thích, ức chế, hoặc bổ sung bất kỳ một quá trình sinh lý nào trong thực vật”. Trong sinh lý thực vật khái niệm về chất kích thích sinh trưởng bao gồm các hợp chất có tác dụng điều tiết các hoạt động sinh trưởng và phát triển của thực vật. Nhóm hợp chất này bao gồm các hormone tự nhiên (auxin, gibberellin, cytokinin, acid abscicic, ethylene, các hợp chất phenol điều tiết sinh trưởng, hormone ra hoa). Auxin Bản chất hóa học của auxin tự nhiên trong tế bào thực vật là acid indol acetic (IAA) và nó là dạng auxin đầu tiên, chủ yếu và quan trọng nhất trong tất cả các loại thực vật. Trong thực vật nó không chỉ tồn tại ở dạng tự do mà còn ở dạng liên kết không có hoạt tính sinh học như IAA-glucose, IAA-myoinositol, IAA-glucan, IAA-aspartate…Các dẫn suất khác của indol cũng thể hiện hoạt tính của auxin là indol tryptamine, indol acetaldehyde, indol pyruvate, indol ethanol. Auxin được tổng hợp ở tất cả các thực vật bậc cao, tảo, nấm, vi khuẩn và chủ yếu ở định chồi ngọn rồi di chuyển xuống các bộ phận non của cơ thể thực vật: lá, rễ và các mô dự trữ…Auxin gồm có auxin tự nhiên và auxin tổng hợp (IBA, NAA, 2,4-D…) Auxin có nhiều vai trò khác nhau trong đời sống thực vật, liên quan tới hàng loạt các quá trình sinh lý: tốc độ sinh trưởng, trạng thái ngủ, sự ra hoa, sự kết trái, sinh trưởng quả, sự chín của quả, sự rụng quả và rụng lá, tạo củ, sự lão hóa…Đương nhiên, do hormone thực vật tác động lên sinh trưởng thông qua mối tương quan nồng độ giữa các loại hocmone khác nhau, nên các quá trình trên đây không chỉ ảnh hưởng của auxin mà còn của các hormone khác. Tùy thuộc vào nồng độ tác dụng mà các mô thực vật có các kiểu phản ứng khác nhau đối với auxin. Phản ứng chủ yếu và nhanh chóng nhất đối với xử lý auxin là làm tăng độ kéo dài của tế bào thông qua tác dụng trực tiếp lên sự giãn nở của vách tế bào. Các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin gồm một vài hợp chất đã được sử dụng từ rất lâu trong công nghiệp. Chỉ sau một thời gian ngắn sau khi IAA được tìm thấy trong tự nhiên, nó đã được tổng hợp và trở thành một hợp chất có giá trị. Nhưng IAA không có lợi để dùng trong nông nghiệp bởi nó dễ dàng bị phân hủy thành các hợp chất mất hoạt tính dưới ảnh hưởng của ánh sáng và vi sinh vật. Một trong những tác dụng của auxin là kích thích sự hình thành rễ của những lát cắt thân. Một số hợp chất tổng hợp nhân tạo có vai trò tương tự như IAA, trong đó có IBA. IBA là hợp chất có hoạt tính auxin yếu nhưng nó có khả năng ổn định và vô hiệu hệ enzyme làm mất hoạt tính của auxin. Cytokinin Phần lớn cytokinin là dẫn xuất của purine. Loại cytokinin đầu tiên phát hiện được và cũng là dạng phổ biến nhất là zeatin tách từ hạt ngô. Ngoài ra còn có hàng loạt cytokinin khác như kinetin, dihydrozeatin, benzyladenin, chlorephenylurea…, trong đó kinetin không có mặt trong tự nhiên, mà ngừơi ta thu nhận bằng cách xử lý nhiệt ADN. Chứng minh về khả năng ngăn cản sự vàng lá của benzyladenin (BA) là một phát hiện thu hút nhiều nhà sinh lý học từ những năm 1950. Những năm 1960, các nhà nghiên cứu thấy rằng BA có thể kích thích nhiều quá trình, BA được sử dụng trong nuôi cấy mô để kéo dài chồi và phát sinh phôi với các nồng độ khác nhau tùy theo đối tượng thực vật nuôi cấy và mục đích nuôi cấy. Cytokinin có mặt trong mọi thực vật, với hàm lượng cao nhất trong phôi và trong quả đang phát triển. Hoạt tính của chúng được tăng cường khi chúng tương tác với myo-inositol, nhưng có thể bị mất khi kết hợp trong thành phần của các glycoside. Cũng như auxin, cytokinin tham gia điều hòa các phản ứng trong cây, đồng thời làm tăng các quá trình trao đổi acid nucleic và protein. Cytokinin điều chỉnh sinh trưởng bằng nhiều cách: Điều chỉnh tốc độ tổng hợp ADN khi phân chia tế bào. Làm chậm sự lão hóa của lá. Góp phần phá vỡ trạng thái ngủ của hạt, kích thích hạt nảy mầm, kích thích ra hoa và sinh trưởng của quả. Gây nên sự hình thành chồi mầm trong nhiều mô, bao gồm mô sẹo trong nuôi cấy mô. Trong cây, cytokinin vận động từ rễ đến chồi thông qua xylem khá dễ dàng, nhưng chúng hầu như không linh động trong lá, ngoại trừ một phần được dẫn truyền định hứơng thông qua cuống lá. Gibberellin Là một nhóm các chất điều hòa sinh trưởng thực vật gồm hơn 80 hợp chất khác nhau. Các hợp chất này có điểm giống nhau ở cấu trúc hóa học đó là sườn gibbane. Gibberellin có liên quan đến nhiều quá trình sinh lý trong cây. Tuy nhiên ở những chi, loài với những yếu tố khác nhau sẽ quyết định gibberellin đặc hiệu hiệu quả nhất. Gibberellin ảnh hưởng đến nhiều quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật như sự phát triển thân, sự nảy mầm của hột, miên trạng, trổ hoa, phân hóa giới tính, trinh quả sinh, đậu trái và lão hóa. Ảnh hưởng trên sự phát triển của thực vật sống: Các gibberellin đã biết đều có khả năng kích thích sự vươn dài của thân hay sự phân chia tế bào. Sự kích thích vươn dài của GA thể hiện rất rõ trên những cây non hoặc bộ phận non, ở cây đã trưởng thành hay cơ quan đã già thì ảnh hưởng sẽ kém đi. Nhìn chung, GA kích thích sự sinh trưởng của nhiều loài cây đặc biệt là những cây lùn. Ảnh hưởng lên tính trạng lùn: Có nhiều biến dị thiếu sinh tổng hợp GA đã được phát hiện. Đây là tính trạng đơn gene, kích thước của cây biến dị có thể chỉ bằng một phần năm cây bình thường và sự lùn chủ yếu là do lóng bị ngắn lại. Các dạng đột biến lùn như đột biến bắp lùn (Zea Mays L.) d1 và d5 và lúa lùn (Oryza Sativa L.) Tan-ginbozu và Waito-C. GA nội sinh kiểm soát hoạt động của bắp và lúa là GA1. Việc xử lý GA ngoại sinh làm cho các cây này cao trở lại bình thường. Ảnh hưởng lên sự nảy mầm của hột và miên trạng: Hiện nay GA được biết là những chất có khả năng kích thích nảy mầm và phá vỡ miên trạng trên nhiều loại cây trồng. GA có thể kích thích hoạt động của các enzyme thủy phân hydrolase trong hột ngũ cốc. GA ngoại sinh tác động lên lớp aleurone của hột ngũ cốc và kích thích sự sản sinh enzyme α-amylase để tác động lên sự phân hủy tinh bột thành đường đơn. Tác động này có tác dụng kích thích nảy mầm và phá vỡ miên trạng. Ảnh hưởng lên sự trổ hoa: Gibberellin có khả năng thúc đẩy quá trình trổ hoa trong nhiều loài thực vật. Đối với những cây cần yêu cầu ngày dài hay trải qua điều kiện lạnh trước trổ hoa thì khi xử lý GA trong những điều kiện không cảm ứng chúng sẽ tượng hoa và trổ hoa. Ảnh hưởng này có liên quan đến sự kích thích quá trình phân chia tế bào và vươn dài tế bào. Ảnh hưởng lên sự phân hóa giới tính, trinh quả sinh, đậu trái và lão hóa: GA có thể làm thay đổi giới tính của hoa tương tự như auxin, cytokinin và ethylene. Tuy nhiên, GA có hiệu quả ngược với auxin và ethylene. GA làm tăng số hoa đực trên dưa leo. GA cũng gây nên hiện tượng trinh quả sinh và tạo nên trái không hột. GA cũng giúp c