Đề tài Chiết, tinh chế và ứng dụng của Enzyme

nuôi trong thùng lên men sản xuất 52 giờ hay hơn nữa. Thời gian nuôi Bac.diastalicus ( để thu chế sản phẩm superbiolase dùng trong công nghiệp bia và công nghiệp dệt) trong thùng nhân giống kéo dài 15 giờ, còn trong thùng sản xuất tới 48 giờ với lượng giống cho vào là 10% so với thể tích môi trường dinh dưỡng. Đối với Endomycopsis sp. Thời gian nuôi để có lượng amylase cực lớn phải tới 80 giờ. 2.6.4.3. Thu nhận enzym pectinase từ VSV Enzym pectinase là enzym xúc tác sự phân hủy của các polymer pectin. Sự phân hủy pectin trong tự nhiên thườn xảy ra khi trái cây chín. Những enzym này vì vậy có một vai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả. . Thu nhận chế phẩm pectinase từ canh trường bề mặt Môi trường sử dụng để nuôi cấy VSV để thu nhận pectinase thường là cám gạo, hay cám mì, bã củ cải hoặc thóc mầm…Nguồn dinh dưỡng bổ sung thường là các muối ammonim, phosphoric… Độ ẩm môi trường phải nằm trong khoảng 60%. Nấm mốc A.awamori thường được nuôi cấy ở 300C trong thời gian 40h, sau đó giảm xuống 240C và nuôi trong 48-52h. Sản phẩm sau khi lên men được sấy khô thành chế phẩm enzym thô và đem tinh chế. Để thu được chế phẩm pectinase tinh khiết thì chế phẩm enzym thô phải được trích ly bằng phương pháp kết tủa nhờ dung môi hữu cơ hay muối ammonium sulfate. Dung môi hữu cơ sử dụng để kết tủa enym pectinase có thể là rượu ethanol (72,5-75%) hoặc isopropanol (55-57%). Muối ammonium sulfate sử dụng có độ bão hòa 0.79. Khi kết tủa bằng rượu ethanol, chế phẩm enzym thu đựoc có độ tinh khiết khoảng 90%, con nếu bằng muối thì độ tinh khiết đạt khoảng 75%. Nhiệt độ kết tủa tối ưu đối với rượu là 2-50C, thời gian tiếp xúc với rượu càng ngắn càng tốt. Sau đó, ly tâm để tách kết tủa khỏi dung dịch, sấy kết tủa trong thiết bị sấy chân không hay sấy thăng hoa rồi nghiền nhỏ và đem bảo quản. 2.6.4.4 Thu nhận chế phẩm enzym từ canh trường bề sâu a. Phương pháp yếm khí: Sự tích tụ enzum trong môi trường được bắt đầu khi sự phát triển của VSV gần đạt đến pha ổn định, khi môi trường bị acid hóa mạnh và khi lượng phospho vô cơ được sử dụng hoàn toàn.pH của môi trường nuôi cấy thường đạt từ 6-7.2 là thích hợp. Đối với nấm mốc,pH kiềm hãm sự tổng hợp sinh khối và sự tích lũy enzym pectinase.pH=4 ức chế hoàn toàn sự tích lũy enzym pectinase. Khi pH dịch về phía acid, ngay cả khi pH nằm trong khoảng 4,5-5,0 tuy sự tạo thành sinh khối khôngbị ảnh hưởng nhưng sự tạo thành enzym pectinase bị kìm hãm. Tuy nhiên, pH của các trường nuôi cấy A.niger và A.awamori có thể dịch về 3,5-3,8 và 2,9-3,2 theo thứ tự. Vật liệu gieo cấy có thể là sợi nấm 24.32 và 48h tuổi với hàm lượng từ 2-10h. Đối với A. niger và A. awamori, vật liệu gieo cấy là sợi nấm được ủ sơ bộ trong môi truờng dinh dưỡng cho đến khi bắt đầu nứt nanh bào tử. Thời gian ủ sơ bộ thường là 38-42h. Lượng sợi nấm đem gieo cấy thường là 2%. Trong quá trình nuôi cấy, hàm lượng các chất hòa tan trong môi trường thường giảm từ 6% xuống còn 1,5-1,8%. Để thu chế phẩm khô, cần tách sợi nấm ra khỏi canh trường lỏng. Cô đặc chân không canh trường lỏng đến khi hàm lượng chất khô đạt 5-8% rồi sấy khô trên thiết bị sấy phun. Điều kiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt đi vào phải đạt 165-180% và đi ra đạt 60-70%. Thời gian lưu của chế phẩm enztm trong thiết bị sấy phun phải không quá 7 giây và nhiệt độ chế phẩm sau khi sấy phải không quá 400C. Chế phẩm thu được cần phải được đóng gói kín để tránh hút ẩm. Có thể thu chế sản phẩm pectinase tinh khiết bằng cách kết tủa enzym trong dịch lọc canh trường với ethanol theo tỷ lệ 4:1, với aceton theo tỷ lệ 2:1 và isopropanol theo tỷ lệ 1,3:1 hoặc với muối ammonium sulfate (50-80% trong muối kết). Nếu kết tủa bằng ethanol, hoạt độ pectinase trong kết tủa sẽ vào khoảng 88-89% so với họat độ của dịch canh trường ban đầu. Nếu kết tủa bằng muối ammonium sulfate, cần tách muối ra khỏi enzym bằng phươn pháp thẩm tích (với nước hoặc dung dịch đệm), sau đó sấy khô. Khi độ bão hòa của (NH4)2SO4 bằng 0,5 thì sẽ kết tủa được đoạn có hoạt độ pectinase thấp (đoạn này chiếm 0,25% trọng lượng khô), nhưng nếu kết tủa bằng (NH4)2SO4 có độ bão hòa 1,0 thì sẽ kết tủa được đoạn chỉ chiếm 0,11% nhưng lại có hoạt độ pectinase cao. b. Phương pháp yếm khí: Môi trường: Bã củ cải: 2%; (NH4)2HPO4: 0,75%, KH2P04:0,1%; CaCO3: 0,3%; nước chiết ngô: 0,5%. Clostridium pectinofermentants 15 có khả năng tổng hợp pectinase một cách mạnh mẽ ở pha tăng đồng thời với sự tích lũy sinh khối. Sự tích lũy enzym sẽ tối đa tương ứng với pha ổn định của sự sinh trưởng qua 55-60h. pH ban đầu cuả môi trường dinh dưỡnglà 6,5-7,0. Vật liệu gieo cấy ban đầu được chuẩn bị ở dạng canh trường bào tử và được cấy với lượng 4% theo thể tích,Quá trình nuôi cấy được tiến hành ở nhiệt độ 350C. Cl. Felsineum cũng có thể được nuôi cấy yếm khí để thu pectinase. Thành phần môi trường gồm có:Lactose:20%; pectin củ cải: 1%; (NH4)2HPO4: 0,4%; K2HPO4 : 0.3%; NaCl: 0,1%; MgSO4: 0.025 %; FeSO4: dạng viết; CaCO3: 0,5%; dịch nấm men tự phân: 0.05%; ascorbic acid: 0,5%. Có thể tiến hành thu chế phẩm từ dịch lọc canh trường bằng cách kết tủa enzym với dung môi hữu cơ hoặc với muối ammonium sulfate. Nếu kết tủa bằng dung môi hữu cơ,pH của dung dịch đã xử lý là 6,5-6,8. Nếu kết tủa bằng 2-2,5 thể tích aceton thì họat độ của enzym trong kết tủa đạt 93-95% so với hoạt độ ban đầu. Khi kết tủa bằng ammonium sulfate có độ bão hòa bằng 0,2 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa pectinesterase và pectintranseliminase; khi độ bão hòa là 0,9-1 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa pectintranseliminase và exopolygalacturonase. Phương pháp hiện đại trong chuẩn bị chế phẩm enzym pectinase thưòng theo các bước cơ bản sau đây: - Khử muối bằng phương pháp lọc gel (Biogel P100) - Tách protein bằng phương pháp trao đổi anion (DEAE Bilogel A), hay trao đổi cation (CM Bilogel A) - Tách enzym pectinase bằng alginate liên kết ngang - Tinh sạch bằng FPLC Aliginate liên kết ngang hoạt động bằng cách kết hợp ái lực, ảnh hưởng tĩnh điện và thay thế pectate liên kết ngang. 2.6.4.5 Thu nhận enzym cellulase từ VSV VSV sinh tổng hợp cellulase Trong điều kiện tự nhiên, cellulase bị phân hủy vởi VSV cả trong điều kiện hiếu khí và yếm khí. Các loài VSV thay phiên nhau phân hủy cellulase đến sản phẩm cuối cùng là glucose. Số lượng các loài VSV tham gia sinh tổng hợp các enzym cellulase có trong điều kiện tự nhiên rất phong phú. Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn và trong một số trường hợp còn thấy cả nấm men.Một số loài VSV được nghiên cứu: Altenaria tennuis, Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Penicillium Spp, Trichoderma reesei, Actinomycees spp… . Phương pháp thu nhận enzym cellulase VSV có khả năng sin tổng hợp cellulase thuộc ba nhóm: nấm sợi, xạ khuẩn và vi khuẩn. Trong công nghiệp sản xuất sản xuất enzym cellulase hiện nay, người ta chủ yếu nuôi cấy sợi nấm sợi và xạ khuẩn, còn vi khuẩn ít được ứng dụng trong sản xuất. Để thu nhận enzym cellulase từ nấm sợi và xạ khuẩn, người ta thường nuôi cấy theo phương pháp bề mặt bằng môi trường xốp (còn gọi là môi trường bán rắn). Cả xạ khuẩn và nấm sợi đều phát triển rất tốt trong môi trường có độ ẩm là 60-65%, có cơ chất là cellulase. Thành phần môi trường nuôi cấy cạ khuẩn và nấm sợi rất đa dạng, trong đó vừa phải đủ chất dinh dưỡng, vừa phải có cơ chất là cellulase và phải có độ xốp nhất định để không khí có thể lưu thông từ bên ngoài môi trường vào trong khối môi trường.Cả hai nhóm xạ khuẩn và nấm sợi đều là những VSV hiếu khí nên trong quá trình nuôi thường xuyên phải được cung cấp oxy. Điểm khác biệt lớn nhất trong khi nuôi nấm sợi và xạ khuẩn là xạ khuẩn phát triển mạnh trong môi trường kiềm và môi trường acid yếu, còn nấm sợi phát triển ở môi trường acid. Do đó, khi chế tạo môi trường cần lưu ý tạo pH môi trường ban đầu cho xạ khuẩn từ 6,2-7,6, còn pH môi trường ban đầu cho nấm sợi từ 4,5-5,5. Thời gian phát triển và sinh tổng hợp enzym cellulase củ xạ khuẩn và nấm sợi cũng khác nhau.Xạ khuẩn thường có thời gian phát triển và sinh tổng hợp cellulase dài hơn nấm sợi thông thường, nấm sợi phát triển từ 36 giờ đến 48 giờ đã cho hoạt tính enzym cellulase rất cao. Trong khi đó, xạ khuẩn phải mất ít nhất là 72 giờ mới tổng hợp cellulase nhiều. Điểm khác cuối cùng là khả năng chịu nhiệt của cả hai nhóm VSV này, các loài xạ khuẩn thường chịu nhiệt tốt hơn các loài nấm sợi. Enzym cellulase của xạ khuẩn cũng hoạt động ở nhiệt độ cao hơn enzym cellulase của nấm sợi. Sau khi nuôi cấy trong những điều kiện kỹ thuật tối ưu, người ta thu được chế phẩm cellulase ở dạng thô. Chế phẩm này chứa nước, sinh khối VSV, thành phần môi trường và enzum. Công việc tiếp theo là áp dụng các phương pháp hóa, lý tách nước, sinh khối VSV sẽ thu được enzym dạng bán tinh khiết. Enzym bán tinh khiết còn chứa nước, protein không hoạt động và enzym. Bằng phương pháp hóa ký, ta sẽ loại được nước, protein không hoạt động. Khi đó ta thu được chế phẩm enzym tinh khiết. Hiện nay, enzym cellulase được ứng dụng rất rộng rãi trong công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm gia súc. Đặc biệt các chế phẩm cellulase thô được ứng dụng nhiều trong xử lý ô nhiễm môi trường. Chế phẩm enzym cellulase tinh khiết được ứng dụng trong kỹ thuật di truyền. trong kỹ thuật tạo tế bào trần (protoplast), người ta thường dùng chế phẩm enzym cellulase tinh khiết để phá vỡ thành tế bào thực vật. Ứng dụng enzym cellulase phá vỡ tế bào thực vật không làm tổn thương các cơ quan bên trong tế bào, đảm bảo sự nguyên vẹn các nhân tố di truyền. Do đó, phương pháp này đã nhanh chóng thay thế các phương pháp cơ học và hóa học. 2.6.4.6. Thu nhận enzym lipase từ VSV VSV tổng hợp lipase Trong thiên nhiên có nhiều loài VSV có khả năng sinh tổng hợp lipase. Chúng bao gồm cả nấm sợi, nấm men và vi khuẩn. Nấm sợi có khả năng sinh tổng hợp lipase bao gồm: Asperrgillus spp, Muscor spp, Rhizopus spp, Penicillium spp, Geotrichumspp. Nấm sợi có khả năng sinh tổng hợp lipase bao gồm: Trorulopsis spp, Candia spp. Vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp lipase bao gồm: Pseudomonas spp, Achromobacter spp, Staphylococcus spp. Thu nhận enzym lipase Trong công nghiệp, người ta thường sản xuất lipase chủ yếu bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt. Trong môi trường có bổ sung chất béo như một cơ chất cảm ứng. Tuy nhiên, hàm lượng chất béo cho vào môi trường với số lượng rất nhỏ (khoảng<1%) vì chất béo thường không hòa tan với nước, nếu sử dụng số lượng lớn sẽ ảnh hưởng rất lớn đến tính chất môi trường. Chế phẩm thô thu nhận được sẽ được xử lý để tách enzym khỏi môi trường nuôi cấy và tiến hành loại các tạp chất, cuối cùng là làm kết tủa, tinh chế và thu nhận enzym tinh khiết. Enzym lipase được ứng dụng nhiều trong sản xuất các chất tẩy rửa, trong sản xuất phomai. 2.6.4.7 Thu nhận enzym glucose iso merase Enzym glucose iso merase còn gọi là D-glucoseket toisomerase Enzym này được ứng dụng rất nhiều trong công nghệ sản xuất dịch đường glucose. VSV tham gia tổng hợp glucose iso merase Hiện nay, các nhà khoa học đã phát hiện rất nhiều VSV có khả năng sinh tổng hợp enzym glucose iso merase. Các loài VSV đó được liệt kê trong bảng 6.17. Trong đó các chủng thuộc Bacillus và Streptomyces được ứng dụng nhiều trong sản xuất glucose isomerase theo quy mô công nghiệp. Hãng Novo của Đan Mạch sản xuất enzym glucose iso merase cũng bằng Bacillus coagulans ở các nước châu Âu, Mỹ, Nhật và Nam Triều Tiên. Thu nhận enzym glucose iso merase Lượng siro glucose/fructose được sản xuất trên thế giới rất lớn. trong đó, glucose/fructose được sản xuất nhiều nhất ở Mỹ, Đức, Nhật, và một số nước châu Âu, Đức và Mỹ là những nước sản xuất glucose-fructose lớn nhất (hàng năm Đức sản xuất khoảng 10.000-20.000 tấn glucose/fructose). Nhu cầu về glucose/fructose trên thế giới rất lớn, vì thế người ta sản xuất enzym glucose isomerase với số lượng nhiều để áp dụng cho nhu cầu trên. Ở các nước châu Âu, Mỹ, Nhật và Nam Triều Tiên, người ta sản xuất enzym glucose isomerase chủ yếu bằng vi khuẩn Bacillus coagulans. Vi khuẩn này được nuôi bằng phương pháp chìm trong môi trường nuôi cấy thích hợp,chúng có khả năng sinh tổng hợp enzym trong 24 giờ nuôi cấy. Trong môi trường nuôi cấy ngưòi ta thường cho muối cobalt và magie. Hai loại muối này kích thích quá trình sinh tổng hợp glucose-isomerase. Ngoài bacillus coagulans, nhiều nước còn sản xuất glucose-isomerase từ Actinoplans missouriensis. VSV này có ưu điểm là chúng có khả năng phát triển ở rất nhiều loại môi trường khác nhau và khả năng sinh tổng hợp glucose-isomerase cũng rất mạnh. Để thu nhận glucose-isomerase từ loài Streptomyces, người ta thương nuôi chúng trong những bình lên men có pH 8,5. Trong số các chủng thuộc loài Streptomyces, người ta thường nuôi ở nhiệt độ rất cao ( nhiệt độ nuôi trong khoảng 60-700C). Các thiết bị lên men thường được thiết kế và chế tạo có dung tích 22m3. Sau 24h nuôi cấy, người ta tiến hành ly tâm, thu dịch chứa enzym ngoại bào và sau đó là áp dụng những phương pháp tinh chế để thu nhận enzym tinh khiết. CHƯƠNG 3: ỨNG DỤNG CỦA ENZYME 3.1 Các hướng ứng dụng Hiện nay có 2 hướng ứng dụng của enzyme trong các ngành công nghiệp nhẹ, công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp và y tế. 3.1.1Hướng thứ nhất: Sử dụng có định hướng các enzyme có trong tế bào sống của vi sinh vật (VSV). Theo hướng này, việc sử dụng enzyme đồng nghĩa với việc sử dụng tế bào VSV trong quá trình sản xuất. Trong trường hợp này có thể coi tế bào VSV là một chất mang enzyme. Enzyem tồn tại trong tế bào VSV, thực hiện các phản ứng sinh hoá trong và ngoài tế bào VSV. Chất mang này có tính chất là chúng không chỉ giữ enzyme mà còn có khả năng tạo ra những enzyme này. Sự tạo thành enzyme liên tục trong tế bào VSV, đảm bảo cho việc tồn tại chúng liên tục trong điều kiện tự nhiên. Mặt khác, có thể coi tế bào VSV như một nhà máy sản xuất các vật chất hữu cơ hoàn chỉnh, khi đó enzyme như những công cụ hữu hiệu để thực hiện tất cả các công đoạn sản xuất với độ chính xác cao và theo một trật tự nhất định để tạo ra sự hoạt động hài hoà của bộ máy sống này. Tuy nhiên, ứng dụng enzyme theo kiểu này có những đặc điểm rất riêng biệt cần quan tâm để điều khiển chúng sao cho chúng hoạt động có hiệu quả. Ứng dụng enzyme trong tế bào chỉ sống của VSV chỉ có ý nghĩa khi sản phẩm có sự tham gia của phản ứng enzyme là sản phẩm không tinh khiết. Đây là hỗn hợp các sản phẩm tạo thành trên cơ sở có sự tham gia của hàng loạt enzyme, vì trong tế bào sự sống tồn tại hàng loạt các enzyme tham gia những phản ứng sinh hoá khác nhau, sản phẩm của phản ứng này là nguyên liệu hay cơ chất cho phản ứng kế tiếp. Như vậy trong quá trình tiến hành phản ứng sẽ tạo ra phức hợp nhiều chất khác nhau, các chất này luôn ở trạng thái động và sẵn sàng tham gia các phản ứng sinh hoá trong và ngoài cơ thể. Do đó, nếu ta quan tâm thu nhận một loại sản phẩm có độ sạch tuyệt đối thì không thể sử dụng theo hướng này. Ứng dụng enzyme trong tế bào sống của VSV đặc biệt có ý nghĩa đối với quá trình lên men truyền thống ( sản xuất rượu từ nguồn tinh bột, sản xuất tương, chao, pho mai, nước chấm, nước mắm, làm dưa chua), các quá trình ủ (ủ phân hữu cơ, ủ thức ăn gia súc). Trong những quá trình này, sản phẩm cuối cùng thường là hỗn hợp nhiều chất , trong đó có thể tồn tại một hay hai chất chiếm số lượng lớn, những chất này được tạo thành trên cơ sở số lượng lớn, hoạt tính enzyme tham gia tạo ra chúng có trong tế bào sống vượt trội hơn so với những enzyme khác. Tất cả các quá trình này, nếu xảy ra trong điều kiện không biến động nhiều, sẽ tạo ra sự hài hoà giữa các sản phẩm trao đổi chất. Nhưng nếu có một biến động nào đó trong quá trình phản ứng, lập tức có sự đảo lộn sự cân bằng này và làm chất lượng sản phẩm cuối cùng thay đổi. Ứng dụng enzyme trong tế bào sống của VSV để sản xuất ra các sản phẩm trao đổi chất có liên quan chặt chẽ đến phương pháp cố định tế bào, enzyme có trong tế bào, tế bào lại được cố định, như vậy về cơ bản ta tạo được một màng sinh học. Các chất dinh dưỡng đi qua màng lọc sinh học và các sản phẩm của quá trình chuyển hoá sẽ đi ra khỏi màng lọc sinh học. Phương pháp tạo tế bào cố định gần giống phương pháp tạo enzyme cố định. Sau khi tiến hành cố định tế bào vào những chất mang, các chất mang đã cố định các tế bào trên đó sẽ được đưa vào trong một cột hay một thiết bị phản ứng hình trụ Không khí ra VSV chứa enzyme đã được cố định trên chất mang Hệ thống thổi khí ra Dòng sản phẩm ra Bình phản ứng hệ thống cố định tế bào điển hình Như vây, chất dinh dưỡng hay cơ chất sẽ được đưa từ phần trên của thiết bị và chảy qua các tế bào cố định trong hệ thống. Các chất này sẽ tham gia các phản ứng enzyme trong tế bào và sản phẩm thoát ra khỏi tế bào xuống phần đáy của thiết bị. Người ta thu nhận các sản phẩm từ phần đáy thiết bị này. Ứng dụng enzyme trong tế bào VSV theo hướng thứ nhất này không chỉ có ý nghĩa trong công nghệ sản xuất các sản phẩm lên men truyền thống, các quá trình ủ mà còn có ý nghĩa rất lớn trong xử lý nước thải công nghiệp, nước thải sinh hoạt và nước thải bệnh viện. 3.2.2. Hướng thứ 2: Hướng này sử dụng enzyme không kiên quan đến tế bào sống của VSV. Ở đây các loại enzyme được tách ra khỏi tế bào được tinh chế hoặc không tinh chế. Nếu sử dụng enzyme theo hướng thứ nhất, người ta quan tâm đặc biệt đến tế bào VSV phải là những tế bào sống, và chúng chỉ có tác dụng tham gia chuyển hoá vật chất khi chúng có khả năng phát triển trên cơ chất. Khi đó enzyme mới định tổng hợp và tham gia phản ứng. Nếu tế bào VSV phát triển kín hoặc không phát triển thì quá trình chuyển hoá sẽ không xảy ra hoặc xảy ra rất chậm. Nếu sử dụng enzyme theo hướng thứ 2, người ta không quan tâm đến tế bào VSV đó sống hay chết. Khi đó, người ta đã có một khối lượng VSV chứa nhiều enzyme và có hoạt tính cao. Công việc ứng dụng này chỉ bao gồm việc tạo điều kiện thuận lợi cho enzyme hoạt động, chứ không phải tạo điều kiện cho VSV phát triển. Sinh khối VSV chứa enzyme trong trường hợp này được gọi là chế phẩm enzyme thô ( trong đó bao gồm cả enzyme, sinh khối VSV, nước và thành phần môi trường). Nhiều trường hợp, người ta sử dụng chế phẩm enzyme thô này để tiến hành các quá trình thuỷ phân.( ví dụ như trong sản xuất rượu theo phưong pháp Mycomant, hạt trong sản xuất bia bằng nguyên liệu thay thế malt). Nếu enzyme tách khỏi sinh khối, nước và thành phần môi trường ta có enzyme hoàn toàn sạch. Các enzyme tinh chiết theo kiểu này thường được dùng để sản xuất những sản phẩm sạch. Chế phẩm enzyme tinh khiết có liên quan đến rất nhiều enzyme cố định. Do đó việc ứng dụng enzyme cố định trong quá trình sản xuất nằm trong hướng ứng dụng thứ 2. 3.2 Ứng dụng enzyme trong công nghệ thực phẩm 3.2.1Một số enzyme quan trọng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm 3.2.1.1 Oxidoreductase Oxidoreductase (enzyme loại nhóm oxy) là loại enzyme ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến, bao gồm các loại thông dụng như: glucose oxidase, catalase, lipoxygenase. Oxidoreductase được khuyến cáo sử dụng trong việc nâng cao hương vị của sản phẩm. Glucose oxydase Enzyme này được sản xuất từ Aspergillus niger, A. oryzae và Penicillin notatum. Chúng tham gia oxy hoá glucose thành acid gluconic khi có mặt của oxy theo phương trình sau: Glucose + O2 +H2O δ-gluconolactone + H2O2 H2O Gluconic acid Dưới tác dụng của catalase H2O2 sẽ bị phân huỷ thành oxy và nước. Việc loại glucose được sử dụng trong quá trình sản xuất bột trứng, nhằm ngăn chặn tác động của phản ứng Mailard đến màu và mùi vị cảu sản phẩm. Tương tự như vậy khi sử dụng glucose oxidase để sản xuất một số sản phẩm từ thịt và protein, enzyme sẽ làm tăng việc tạo màu vàng đồng cho sản phẩm và làm giảm xu hướng hoá nâu. Trong quá trình sản xuất khoai tây lát chiên, cũng cần sử dụng enzyme này để làm giảm lượng glucose dư thừa, nhằm ngăn chặn việc hoá nâu sản phẩm. Quá trình làm giảm oxy trong quá trình sản xuất các sản phẩm đóng gói kín cũng rất hữu ích. Khi lượng oxy giảm thì hiện tượng oxy hóa chất béo và oxy hoá các chất màu tự nhiên cũng sẽ giảm. Ví dụ, khi nhúng cua và tôm trong dung dịch gluco oxidase và catalase thì sẽ hạn chế được quá trình chuyển đổi màu từ hồng sang vàng. Glucose oxidase hoạt động trong khoảng pH 2.7-8.5. Nếu nâng nhiệt độ lên 80oC trong 2 phút chúng sẽ bị biến tính. Enzyme này được áp dụng nhiều trong bảo quản nước quả, trong sản xuất mayonnais. Catalase Đây là loại enzyme được tổng hợp từ VSV. Nó đóng vai trò quan trọng trong quá trình bổ trợ cho việc phân giải H2O2 2H2O2 2H2O + O2 Hydrogen peroxidase được tạo thành khi sử dụng glucose oxidase để xử lý thực phẩm. Ngoài ra, với một số quy trình sản xuất, H2O2 cũng được sử dụng. Việc bổ sung catalase vào sẽ phân giải lượng H2O2 dư thừa. .Lypoxygenase Enzyme này có tác động đến quá trình tẩy trắng bột và cải thiện tính chất lưu biến của bột khi nhào. Enzyme này thu nhận từ bột đậu. Chúng tham gia oxy hóa acid béo, pH hoạt động từ 6,5-9,0 Aldehyde dehydrogenase Trong quá trình sản xuất các sản phẩm từ đậu nành, các chất bay hơi(hexanal..) sẽ làm gây mùi “đậu”. Việc làm giảm lượng các chất được thực thi nhờ quá trình oxy hóa các acid béo không no bão hòa bởi enzyme aldehyde dehydrogenase. Enzyme này chuyển đổi các goc aldehyde thành cacboxylic. Với lượng acid hình thành từ quá trình chuyển đổi chưa làm ảnh hưởng đến mùi vị sản phẩm. Butanediol dehydrogenase Enzyme này chiết xuất từ một số vi khuẩn như Aerobacter có khả năng làm giảm các diketone, làm giảm hàm lượng diacetyl, chất 2,3-butanediol hình thành không gây mùi khó chịu cho sản phẩm. OH OH CH3-CO-CO-CH3 + NADH + H+ CH3-CH-CH-CH3 + NAD+ 3.2.1.2 Hydrolase Proteinase Protease có khả năng thuỷ phân protein thành acid amin, peptid mạch ngắn, pepton. Protease có tầm quan trọng sống còn với toàn bộ sinh giới, chiếm gần 25% tổng số gene mã hoá cho nó. Protease cần thiết cho sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ cấp độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật, thực vật, động vật. So với protease động vật và thực vật, protease VSV có những đặc điểm khác biệt. Hệ protease VSV là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về mặt cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. Nó cũng là phức hệ nhiều enzyme khác nhau nên protease VSV thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng. Protease động vật và thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase exopeptidase, riêng VSV lại có khả năng sinh 2 loại trên do đó protease của VSV có tính đặc hiệu cơ chất. Chúng có khả năng thuỷ phân 80% các lien kết peptide trong phân tử protein. a)Pancreatic protenase Trong công nghiệp sản xuất người ta thường sản xuất chế phẩm hỗn hợp giữa trypsin và chymotrypsin. Chế phẩm này thường được sản xuất từ tuyến tuỵ Trong chế phẩm này có cả peptidase khác, enzyme amylase, lipase. Chế phẩm này hoạt động mạnh ở pH 8,5-9,0, nhiệt độ từ 30-400C. Tuy nhiên người ta có thể sử dụng pH 7,5 và nhiệt độ 45-50oC để thực hiện các phản ứng. Một số enzyme thường được sử dụng là: Pepsin: Được thu nhận từ màng nhầy dạ con của heo con và bê. Pepsin thường được sử dụng chung với renin trong sản xuất phô mai và làm thuốc tiêu hoá. Hỗn hợp này hoạt động mạnh ở pH 2-4 và nhiệt độ 50oC. Renin: Thường được sản xuất từ bao tử của cừu. Đây là loại enzyme có hoạt tính đạc biệt rất cao. Nguời ta thường phối trộn với pepsin theo tỷ lệ 1:1 trong công nghiệp chế biến sữa. Papain: Người ta thu nhận enzyme này bằng cách sấy khô mủ cây đu đủ carica papaya. Trong mủ quả đu đủ có chứa papain, chymopapain và một lượng nhỏ protease khác. Enzyme này được ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bánh, trong sản xuất bia và trong chế biến thịt. Ngoài ra còn sử dụng trong y tế để làm lạnh các vết thường ngoài da. Papain thô có hoạt độ khoảng 400-600 mUI/g, papain tinh khiết có hoạt độ khoảng 100.000 UI/g, pH tối ưu 7,0-8,0, nhiệt độ tối ưu khoảng 55-60oC,. Papain bị mất hoạt tính khi pH 3,0 với sự có mặt của oxy. Bromelin: Được sản xuất từ vỏ và chồi của quả dứa. Chế phẩm enzyme này có hoạt độ vào 5000-10000 UI/g. Tuy nhiên chế phẩm bromelin thường không ổn định bằng papain. Ficin: Enzyme này thường có nhiều trong nhựa của cây sung. Đặc tính enzyme ficin gần giống papain. Ficin được ứng dụng nhiều trong công nghệ chế biến sữa. b)Proteinase của vi khuẩn Người ta sản xuất proteinase từ vi khuẩn và nấm sợi. Proteinase từ vi khuẩn: được chia thành 2 loại: + Proteinase kiềm: Chế phẩm này có khoảng pH hoạt động 7-11, trong trung tâm hoạt động của chúng có serine. Chế phẩm này ở dạng bột và dạng hạt có hoạt tính 1-6 đơn vị Anson/g. Chế phẩm enzyme này dạng kết tinh có hoạt tính 25-30 đơn vị Anson/g. Chế phẩm này còn có tên gọi là enzyme tấy rửa vì được ứng dụng nhiều trong snr xuất các chất tẩy rửa. + Proteinase trung tính: Đây là các metalloenzyme, chúng có pH hoạt động 6-9. Chế phẩm này ở dạng khô có hoạt tính 0,2-0,5 đơn vị Anson/g. Chế phẩm này thường được ứng dụng nhiều trong da, bia và trong công nghiệp sản xuất protein thuỷ phân. Proteinase từ nấm sợi: Proteinase từ nấm sợi thuộc proteinase acid, kiềm và cả trung tính. Các proteinase acid và trung tính được