Đề tài Hoàn thiện công nghệ xử lý nước quả bằng phương pháp công nghệ sinh học dùng cho sản xuất rượu vang chất lượng cao

chảy ra khi ép phụ thuộc vào sự cấu tạo của mô quả, quá trình xử lý sơ bộ, l−ợng pectin hoà tan trong quả... Với các loại quả nh− cam, chanh, dứa... thì phần n−ớc quả rất dễ thoát ra khỏi phần thịt quả khi ép. Trái lại, những loại quả nh− dâu, táo mèo, mận... nếu ép bằng các ph−ơng pháp truyền thống thì rất khó đạt đ−ợc hiệu suất ép tối đa. Để nâng cao hiệu quả ép n−ớc quả ng−ời ta có thể sử dụng một số ph−ơng pháp xử lý tr−ớc khi ép nh− sau: [21], [31] - Nghiền cơ học: D−ới tác dụng cơ học, các tế bào bị xé nhỏ. Hiệu quả nghiền đạt đ−ợc khi phần lớn tế bào bị phá huỷ. Mức độ nghiền phụ thuộc từng loại quả. 60 Ph−ơng pháp này không lấy đ−ợc hoàn toàn n−ớc quả khi ép nh−ng đơn giản nên đ−ợc ứng dụng rộng rãi. - Đun nóng: D−ới tác dụng của nhiệt độ cao, protit của chất nguyên sinh bị đông tụ và tính thấm của tế bào tăng lên, do đó dịch quả sẽ thoát ra dễ dàng. Ng−ời ta th−ờng đun nóng quả ở nhiệt độ 80 ữ 85 0C. Nếu nhiệt độ thấp hơn thì quá trình đông tụ kéo dài, nếu nhiệt độ cao quá làm mất chất thơm của quả, thay đổi vị, biến màu, gây tổn thất vitamin. - Làm lạnh đông: Tế bào thực vật bị chết khi làm lạnh đông vì ảnh h−ởng chung của sự mất n−ớc, do tinh thể đá chèn ép tế bào, do nồng độ axit, muối trong dịch bào tăng lên. Ph−ơng pháp này bảo đảm chất l−ợng dịch quả nh−ng không kinh tế và khó áp dụng quy mô lớn. - Xử lý bằng dòng điện: Dùng dòng điện xoay chiều có U = 220 V, I = 20 ữ 30A, qua khối quả khoảng 2 ữ 5 giây. Dòng điện có tác dụng phá vỡ tế bào làm n−ớc quả thoát ra nhanh và nhiều khi ép. - Dùng sóng siêu âm: tần số > 20 000 Hz cũng có tác dụng phá vỡ màng tế bào. - Chiếu xạ bằng tia γ: có khả năng phân huỷ protopectin, làm phá vỡ màng tế bào. Các ph−ơng pháp trên đều có −u nh−ợc điểm riêng. Hiện nay do yêu cầu sản xuất của nền công nghiệp hiện đại cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, trên thế giới đang có xu h−ớng sử dụng một ph−ơng pháp xử lý n−ớc quả ép có hiệu quả cao, tăng đáng kể năng suất và hiệu suất trích ly dịch quả, tránh đ−ợc các biến đổi xấu cho dịch quả và có hiệu quả kinh tế cao, đó là ph−ơng pháp sử dụng các chế phẩm enzim pectinaza xử lý khối quả nghiền. Dùng chế phẩm enzim có thể làm phân huỷ các chất protopectin, pectin, xenluloza, tinh bột,... làm giảm mối liên kết giữa các tế bào, phá vỡ một cách nhanh chóng và hàng loạt các mô của quả, giảm độ keo của khối thịt quả và tạo điều kiện cho dịch bào thoát ra một cách dễ dàng. Hơn nữa, do sự phá vỡ mô quả bằng enzim nên các chất màu, tanin và những chất hoà tan trong n−ớc quả đ−ợc chiết rút một cách triệt để, nhờ đó mà tăng thêm chất l−ợng của thành phẩm. Để thu đ−ợc dịch quả trong tr−ờng hợp có sử dụng enzim cũng phải nghiền nhỏ nguyên liệu quả. Bột nghiền đem xử lý bằng enzim sau đó mới ép hoặc ly tâm. Có thể nghiền nhỏ quả đến mức tối đa mà không sợ bị tắc mao quản trong quá trình ép. 61 Nhờ tác dụng của enzim pectinaza, l−ợng dịch quả ép có thể tăng thêm 9,6 ữ 49% tuỳ từng loại quả. Theo kết quả đã nghiên cứu cho thấy: khi xử lý táo nghiền bằng chế phẩm pectinaza với nồng độ 0,025% thì hiệu suất thu hồi dịch quả tăng 14% so với không dùng enzim, còn khi xử lý chuối nghiền với nồng độ enzim 0,025 % thì hiệu suất thu hồi dịch quả tăng đ−ợc thêm 45% . Hiệu suất của quá trình ép dịch quả sử dụng enzim phụ thuộc vào l−ợng enzim, nhiệt độ và thời gian hoạt động của enzim. Tuy nhiên, đối với mỗi loại quả khác nhau cần phải xác định các điều kiện này bằng thực nghiệm để thu đ−ợc hiệu suất ép cao nhất. 1.4.2.2. Sử dụng enzim trong quá trình làm trong n−ớc quả: Dịch quả là dung dịch, trong đó có đ−ờng, axit, muối, protit, chất chát, chất màu và các cấu tử thành phần hoá học khác của nguyên liệu. Dịch quả không chỉ là dịch bào mà còn chứa các phần tử của mô quả. Kích th−ớc và hàm l−ợng của các phần tử này tuỳ thuộc vào nguyên liệu, ph−ơng pháp xử lý và kỹ thuật ép. Dịch quả sau khi ép ra khỏi nguyên liệu, tồn tại ở dạng đa phân tán, gồm những phần tử lơ lửng, phân tán có kích th−ớc khác nhau từ 0,001 àm đến vài trăm àm. Muốn có n−ớc quả trong suốt cần phải loại các hạt lơ lửng trông thấy bằng mắt th−ờng. Song dịch quả là hệ thống keo nên việc tách các hạt lơ lửng gặp khó khăn. Do đó, phải phá huỷ hệ thống keo mới có thể tách đ−ợc hết các hạt lơ lửng và làm cho dịch quả trong. Dịch quả bình th−ờng, nếu không qua một biện pháp xử lý nào thì lọc nhiều lần cũng không thể trong đ−ợc hoàn toàn hoặc nếu có lọc trong đến một mức độ nào đó thì sau một thời gian bảo quản sẽ bị đục trở lại. Tuỳ theo mức độ yêu cầu của thành phẩm mà tr−ớc khi ph−ơng pháp enzim ra đời ng−ời ta có thể sử dụng một số ph−ơng pháp để làm trong dịch quả nh− sau: • Lọc thô: ph−ơng pháp này để loại bỏ các phần tử cặn có kích th−ớc lớn. • Lắng: ph−ơng pháp này dựa vào sự kết tụ các phần tử thịt quả sẽ kéo theo các phần tử khác lắng xuống. Ph−ơng pháp này chỉ dùng đ−ợc trong điều kiện nhiệt 62 độ môi tr−ờng đủ thấp để thời gian lắng không xảy ra các hoạt động của vi sinh vật hoặc áp dụng cho loại sản phẩm có tính ức chế vi sinh vật cao. • Li tâm: là ph−ơng pháp lắng c−ỡng bức, d−ới tác dụng của lực ly tâm tách các phần tử cặn để đạt đến độ trong vừa. Ph−ơng pháp này dùng để tách các phần tử huyền phù có trong n−ớc quả. • Xử lý bằng dòng điện: cho 2 cực của dòng điện một chiều vào dịch quả, tại cực âm sẽ hình thành bọt khí hydro nổi lên và kéo theo các phần tử cặn tạo thành lớp cặn trên bề mặt khối dịch quả. • Dùng đất sét: đất sét có khả năng tạo keo háo n−ớc tích điện âm trung hoà với cặn và các phần tử keo tích điện d−ơng làm kết tủa chúng. • Dùng dung dịch keo: các dung dịch keo nh−: gelatin, aga- aga, cazein, albumin... khi cho vào dịch quả sẽ có tác dụng tạo keo tích điện ng−ợc dấu hoặc tạo thành phức hợp có tỉ trọng lớn lắng xuống. • Đun nóng tức thời: Đun nóng nhanh ở nhiệt độ cao trong vài giây sau đó làm lạnh nhanh dịch quả. Đun nóng làm biến đổi cấu trúc của các phân tử protit, giảm tính háo n−ớc của chúng và làm đông tụ. • Dùng K4[Fe(CN)6] (kali ferocyanic): khi cho vào dịch quả sẽ tạo phức hợp kết tủa nh−ng ít dùng vì là chất độc. • Lọc tinh: là khâu cuối cùng của quá trình làm trong dịch quả. Dùng màng lọc làm từ vật liệu có khả năng tạo độ xốp nhất định nh−: xenlulo, bông, sợi, amiăng... Tuy nhiên, các ph−ơng pháp trên đều có nh−ợc điểm đáng l−u ý là sau một thời gian bảo quản dịch quả bị đục trở lại. Nguyên nhân chủ yếu là do hàm l−ợng pectin khá cao trong n−ớc quả sau khi ép làm cho dịch quả có dạng keo và đục, có độ nhớt cao khó lọc. Ng−ời ta thấy rằng, muốn nhanh chóng thu đ−ợc dịch quả trong và không bị đục trở lại trong suốt thời gian bảo quản thì ph−ơng pháp pháp đơn giản và hiệu quả nhất là sử dụng các chế phẩm enzim pectinaza và xenlulaza. Bởi lẽ, các enzim có tác dụng phá huỷ một phần hoặc hoàn toàn hệ keo của dịch quả. Nếu nh− trong các ph−ơng pháp khác, pectin, xenluloza chỉ bị kết tủa một phần thì khi xử lý bằng các chế phẩm enzim, 63 pectin và xenluloza bị phân giải hoàn toàn thanh các chất hoà tan. Đồng thời, độ nhớt của dịch quả giảm đi nhiều nên rất thuận lợi cho quá trình lọc. Quá trình làm trong dịch quả d−ới tác dụng của enzim pectinaza có thể chia thành 3 giai đoạn sau: [14] - Giai đoạn đầu: “bất ổn định hoá” đ−ợc biểu hiện bằng sự giảm độ nhớt của dịch quả một cách sâu sắc và th−ờng đ−ợc gọi là trạng thái “bị gãy ”. - Giai đoạn hai: kết lắng bắt đầu từ trạng thái “bị gãy” và kết thúc khi cặn đã lắng hoàn toàn. - Giai đoạn ba: kết thúc sự phân giải pectin, th−ờng đ−ợc xác định bằng cách cho ion Ca2+ vào mà không thấy kết tủa. Nói chung, việc sử dụng enzim trong sản xuất dịch quả cho sản xuất r−ợu vang đem lại hiệu quả kinh tế lớn và rút ngắn đ−ợc quá trình sản xuất. Mặt khác, không những hiệu suất thu hồi n−ớc quả tăng mà ngay cả chất l−ợng dịch quả và r−ợu vang cũng đ−ợc cải thiện rõ rệt. Tất cả những điều này đã góp phần đáng kể trong việc nâng cao chất l−ợng và giảm giá thành sản phẩm. 1.4.3. Sử dụng enzim trong quá trình lên men r−ợu vang: [22], [27], [29] Ngoài việc sử dụng enzim trong quá trình trích ly nhằm tăng hiệu suất thu hồi dịch quả và làm trong dịch quả, trong quá trình sản xuất r−ợu vang ng−ời ta còn sử dụng enzim trong suốt quá trình lên men r−ợu vang. Các chế phẩm enzim này có tác dụng: chống các biến đổi có hại cho vang trong suốt quá trình lên men nh−: sự ôxi hóa h−ơng, màu, các phản ứng gây đục, ... 64 Phần II: Nguyên liệu và ph−ơng pháp nghiên cứu 2.1. Nguyên vật liệu 2.1.1. Quả các loại: Các loại quả có độ chín vừa phải, nguyên vẹn, không đ−ợc dập, nát, sâu, ủng, lên men. - Dâu: Ba Vì, Hà Tây, Bắc Ninh và Quảng Ninh - Mận: mận hậu Lạng Sơn và mận Tam Hoa (Lào Cai) - Nho: Ninh Thuận - Dứa: giống dứa Queen và Cayen của Nông tr−ờng Đồng Giao - Táo mèo: Hà Giang 2.1.2. Vi sinh vật - Chủng nấm men công nghiệp thuần khiết thuộc loài Schizo-Saccharomyces vini 12 và 03 chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae thuộc s−u tập giống của Viện Công nghiệp Thực phẩm. 2.1.3. Enzim: - Chế phẩm Pectinex Ultra SP-L của hãng NoVo, Đan Mạch. - Chế phẩm Pectinex 3XL của hãng NoVo, Đan Mạch. - Chế phẩm Celluclast của hãng NoVo, Đan Mạch. - Chế phẩm Rohapect DA6L của hãng Rửhm của Đức - Chế phẩm Rohapect B1L của hãng Rửhm của Đức - Chế phẩm Amylaza của hãng NOVO Đan mạch 2.1.4. Hoá chất Các loại hoá chất, nguyên liệu, phụ gia dùng trong quá trình thí nghiệm đ−ợc liệt kê trong bảng sau: 65 Bảng 2.1: Danh sách các loại hoá chất dùng trong quá trình thí nghiệm TT Tên hoá chất N−ớc sản xuất TT Tên hoá chất N−ớc sản xuất 1. Saccaroza Việt nam 16. Xanh mêtylen Mỹ 2. Glucoza Việt nam 17. 2,6 diclophenol indophenol Nhật Bản 3. Cao nấm men Việt nam 18. Amygdalin chuẩn Mỹ 4. Thạch Trung Quốc 19. Axit meta phosphoric Trung Quốc 5. Pepton 20. Axit axetic Trung Quốc 6. (NH4)2HPO4 Trung Quốc 21. Axit xitric Trung Quốc 7. (NH4)2SO4 Trung Quốc 22. Axit ascorbic Trung Quốc 8. KH2PO4 Trung Quốc 23. Cồn 96 o Việt nam 9. KH2PO4 Trung Quốc 24. Cồn thực phẩm Việt nam 10. KI Trung Quốc 25. NaOH Trung Quốc 11. K3Fe(CN)6 Trung Quốc 26. Na2CO3 Trung Quốc 12. MgSO4 Trung Quốc 27. Na2S2O3 Trung Quốc 13. Benzoat natri Việt Nam 28. NaCl Việt nam 14. Phenolphtalein Đức 29. CaCO3 Trung Quốc 15. Bột trợ lọc Mỹ 30. AgNO3 Trung quốc 2.2. Thiết bị 2.2.1. Thiết bị trong phòng thí nghiệm: - Thiết bị lên men, Việt nam - Buồng cấy (Bioblock scientific - France) - Cân điện tử, Thuỵ sỹ - Cân kỹ thuật, Trung quốc - Chiết quang kế cầm tay Refactometer, Trung quốc - Máy đo pH, Bồ Đào Nha 66 - Máy ly tâm, Hettich, Đức - Máy phân tích sắc ký khí GC Shimazu, Nhật bản - Máy phân tích sắc ký lỏng cao áp HPLC Shimazu, Nhật bản - Máy so màu 722, Trung quốc - Máy so màu quang phổ Spectophotometer Erma Tokyo Model AEII, Nhật bản - Kính hiển vi quang học Olympus, Nhật bản - Buồng đếm hồng cầu Goriaev - Máy xay sinh tố PHILIPS, Hà lan - Thiết bị ép thủ công - Nồi hấp áp lực, Nhật bản - Nhớt kế Schott Gerate, Đức. - Nhớt kế Ostwald, Tây Đức - Thiết bị ổn nhiệt, Đức - Tủ ấm, Đức - Tủ sấy, Trung quốc - Tủ vô trùng, Việt nam - Các dụng cụ thuỷ tinh: cốc 1000ml, bình tam giác, pipet, ống đong ngoại đều mua trên thị tr−ờng Việt nam. 2.2.2. Thiết bị ở x−ởng thực nghiệm - Nồi hơi 100 kg/h, Việt nam - Máy lọc khung bản, Ba lan - Máy xé, Việt nam - Máy chà, Việt nam - Máy ép thuỷ lực, Việt nam - Máy ly tâm, Trung quốc - Thiết bị chần và thanh trùng sản phẩm, Việt nam - Thiết bị gia nhiệt, Việt nam - Thiết bị nhân giống, Việt nam - Thiết bị lên men, Việt nam 2.3. ph−ơng pháp nghiên cứu 67 2.3.1. Ph−ơng pháp vật lý: 2.3.1.1. Xác định nồng độ chất khô hoà tan bằng chiết quang kế (Refractometer). Nguyên lý: Khi đi từ môi tr−ờng (không khí) vào một môi tr−ờng khác (chất lỏng) tia sáng sẽ bị lệch đi (khúc xạ) dựa vào độ lệch của tia sáng ta có thể xác định đ−ợc nồng độ chất hoà tan và từ đó tính ra phần trăm n−ớc trong sản phẩm. Cách xác định: Dịch quả thu đ−ợc sau công đoạn lọc ép đ−ợc khuấy đều và lấy một, hai giọt nhỏ vào bề mặt chiết quang kế đơn vị đo là 0Bx, đo ở 200C 2.3.1.2. Xác định độ trong của dịch bằng cách đo độ truyền quang T (transmittance) ở b−ớc sóng 590 nm Độ đục hay độ trong của dịch quả đ−ợc xác định theo ph−ơng pháp Loeffer (1941): Dịch quả sau xử lý bằng enzim đ−ợc diệt enzim ở 75oC trong 5 phút để làm ngừng phản ứng. Lấy 30ml dịch quả đem ly tâm ở tốc độ 2500 vòng/ phút trong thời gian 10 phút. Lấy 5 ml dịch quả trong cho vào cuvet và đo độ truyền quang bằng máy quang phổ Spetronic 20 tại b−ớc sóng 590 nm. Tại b−ớc sóng này màu vàng sẽ bị hấp phụ và màu của dịch trong sẽ không ảnh h−ởng đến giá trị đo. Dịch quả trong thì sẽ có độ truyền quang gần bằng 100% T. Còn nếu dịch đục thì sẽ ảnh h−ởng và làm giảm độ truyền ánh sáng bởi sự phân tán và hấp thụ, khi đó dịch sẽ có độ truyền quang nhỏ hơn. Tr−ớc khi đo phải chuẩn máy bằng n−ớc cất có độ truyền quang là 100% T. 2.3.1.3. Thử định tính pectin bằng kết tủa với cồn: 2 thể tích cồn + 1 thể tích quả + 1 thể tích 0,1% HCl. 2.3.1.4. Xác định các sản phẩm tạo thành trong quá trình lên men bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 2.3.1.5. Phân tích h−ơng tạo thành trong quá trình lên men sử dụng sắc ký khí (GC) 2.3.1.6. Xác định độ cồn (hàm l−ợng r−ợu etylic) theo ph−ơng pháp đo trực tiếp bằng cồn kế Gay Lussac ở 15oC sau khi đ∙ tiến hành cất mẫu. 2.3.1.7. Ph−ơng pháp xác định c−ờng độ màu của dịch quả và r−ợu vang: C−ờng độ màu của dịch quả và r−ợu vang đ−ợc xác định bằng tổng của độ hấp thụ ánh sáng của dịch tại các b−ớc sóng: 420 nm, 520 nm và 620 nm. Dịch quả và r−ợu vang đ−ợc lọc qua màng lọc 0,45àm và đo độ hấp thụ ánh sáng bằng thiết bị Spetrophotometter tại các b−ớc sóng 420 nm, 520 nm và 620 nm. 2.3.2. Ph−ơng pháp hoá học: 2.3.2.1. Xác định hàm l−ợng axít toàn phần bằng ph−ơng pháp trung hoà Dùng dung dịch kiềm chuẩn là NaOH 0,1N để trung hoà các axít trong thực phẩm với chất chỉ thị màu là phenolphtalein. Kết quả đ−ợc tính theo công thức sau: K.a Caxit = .100% b Trong đó: a: Số ml NaOH 0,1N cần dùng để chuẩn b: Số ml dung dịch mẫu đem chuẩn K: Hệ số axit (Nếu quy về axit xitric thì K = 0,0064) Cách xác định: lấy 5ml dịch cho vào bình tam giác, thêm vào 2 đến 3 giọt phenolphtalein 0,1N, dùng NaOH 0,1N chuẩn độ cho tới khi dịch chuyển sang màu hồng nhạt (bền trong khoảng1phút), dừng chuẩn độ và tính kết quả. 2.3.2.2. Ph−ơng pháp xác định hàm l−ợng đ−ờng tổng số + Cơ sở lý thuyết: Dùng ph−ơng pháp ferixyanua kali - Ph−ơng pháp Graxiaqnop. Ph−ơng pháp dựa vào phản ứng sau: 2K3Fe (C N)6 + KOH → 2 K4 Fe (C N)6 +H2O +O Tiếp theo oxygen nguyên tử sẽ oxi hoá đ−ờng để thành axit sacaric 68 CH2OH(CHOH)4CHO + O → COOH(CHOH)4COOH Phản ứng tổng quát là: 4K3Fe(C N)6 +4KOH + COOH(CHOH)4CHO → 4K3Fe(C N)6 + COOH(CHOH)4COOH + 2H2O + Hoá chất: - Dung dịch ferixyanua 1% - Dung dịch KOH 2,5 N - Dung dịch methylen xanh 0,5 % + Tiến hành - Chuẩn bị dung dịch đ−ờng loãng: Lấy 100 ml dịch lọc cho vào bình định mức 250 ml, thêm vào đó 10 ml HCl đậm đặc (d = 1,185) rồi đặt vào nồi n−ớc có nhiệt độ 700 C và giữ 5 phút . Tiếp đó làm nguội rồi trung hoà và thêm n−ớc cất tới vạch. - Dùng pipet lấy 20 ml dung dịch ferixyanua cho vào bình tam giác 250 ml , sau đó cho thêm 5 ml KOH 2,5N và 3-4 giọt methylen xanh (nếu dung dịch đ−ờng có nồng độ bé hơn 0,25 % thì lấy 10 ml ferixyanua và 2,5 ml KOH ). Lắc đều và đặt trên bếp điện đun sao cho dung dịch sôi sau 1-2 phút. Tiếp theo dùng dung dịch đ−ờng pha loãng trên để chuẩn đến mất màu của methylen xanh. Chú ý màu của hỗn hợp phản ứng sẽ thay đổi từ xanh sang tím hồng và cuối cùng là màu vàng da cam thì kết thúc. Nếu để nguội màu của dung dịch sẽ trở lại màu tím hồng. + Tính toán: Hàm l−ợng đ−ờng trong dung dịch pha loãng tính theo công thức: a Đg(%) = 100% m 69 a -L−ợng đ−ờng glucoza chứa trong m ml dịch pha loãng và t−ơng ứng với 20 ml ferixyanua (a= 0,0225) 70 m - số ml dịch quả dùng chuẩn độ hết 20 ml ferixyanua 1% 2.3.3. Ph−ơng pháp vi sinh vật: 2.3.3.1. Môi tr−ờng: a) Môi tr−ờng phân lập và môi tr−ờng bảo quản nấm men MYPG agar. b) Môi tr−ờng nhân giống nấm men, môi tr−ờng hoạt hoá là n−ớc chiết malt 12oBx. c) Môi tr−ờng lên men là dịch sirô pha loãng của từng loại quả dâu, nho, dứa, mận và táo mèo có độ đ−ờng từ 18 – 20oBx. d) Môi tr−ờng giữ giống và bảo quản: Sử dụng môi tr−ờng phân lập, giống sau khi đ−ợc phân lập đem bảo quản trong tủ lạnh 40C thời gian 1 tháng. e) Các môi tr−ờng kiểm tra vi sinh vật gây h− hỏng sản phẩm • Kiểm tra vi sinh vật hiếu khí [22] Kiểm tra vi sinh vật hiếu khí trên môi tr−ờng: Thạch - thịt - pepton. Thành phần môi tr−ờng bao gồm: - Pepton : 10g/l - Cao thịt bò: 1,4g/l - Thạch: 20g/l - NaCl: 5g/l - pH = 7 Thanh trùng môi tr−ờng ở nhiệt độ 1210C trong 45 phút • Kiểm tra E.coli [22] Để kiểm tra E.coli dùng môi tr−ờng Endo, thành phần môi tr−ờng gồm có: - Pepton: 10g/l - Na2SO3: 3,3g/l - KH2PO4: 2,5g/l - Thạch: 20g/l - Lactoza: 10g/l - Fucshin: 0,3g/l - pH = 7 Thanh trùng môi tr−ờng ở nhiệt độ 1210C trong 45 phút. • Kiểm tra vi khuẩn lactic [22] Để kiểm tra vi khuẩn lactic dùng môi tr−ờng MRS có các thành phần: 71 - Cao nấm men: 5g/l - Na2HPO4 : 2g/l - Cao thịt bò: 10g/l - MgSO4.4H2O : 0,05g/l - Glucoza : 20g/l - Tween 80: 1g/l - Xitrat diamonium : 20g/l - Thạch: 15g/l - pH = 6,5 Thanh trùng môi tr−ờng ở nhiệt độ 1120C trong 20 phút. • Kiểm tra nấm men, nấm mốc [22] Dùng môi tr−ờng Hansen gồm các thành phần: - Glucoza: 5% - MgSO4.7H2O: 0.003% - Pepton: 1% - Thạch: 2% - KH2PO4: 0,003% - pH = 4 Thanh trùng ở nhiệt độ 1120C trong 30 phút. • Kiểm tra Clostridium perfringens [22] Dùng môi tr−ờng INGRAM gồm có các thành phần: - Cao thịt bò: 10g/l - Tinh bột: 1g/l - Pepton từ casein: 10g/l - NaCl: 5g/l - Cao nấm men: 3g/l - Natri axetat: 3g/l - Glucoza: 5g/l - L-Cysteinium Chlorit: 5g/l - pH = 6,8 Thanh trùng môi tr−ờng ở nhiệt độ 1120C trong 30 phút. • Kiểm tra tụ cầu vàng St. aureus [22] Dùng môi tr−ờng canh thang muối mặn, gồm có các thành phần: - Cao thịt : 5g - NaCl: 75g - Pepton: 10g - N−ớc cất: 1000ml Thanh trùng môi tr−ờng ở nhiệt độ 1120C trong 30 phút. 2.3.3.2. Các ph−ơng pháp vi sinh a) Xác định hình thái khuẩn lạc nấm men d−ới kính soi khuẩn lạc. 72 b) Xác định hình thái và kích th−ớc tế bào bằng hệ thống kính hiển vi – máy tính Olympus-compaq (Nhật bản). c) Xác định số l−ợng tế bào nấm men bằng sử dụng buồng đếm hồng cầu Goriaev. d) Xác định số l−ợng tế bào chết bằng ph−ơng pháp nhuộm xanh methylen. e) Phát hiện men dại trên môi tr−ờng Lysine. f) Độ thuần khiết sinh học: đ−ợc đánh giá bằng ph−ơng pháp kiểm tra trên môi tr−ờng đặc hiệu. g) Xác định khả năng lên men bằng ph−ơng pháp bình engol. Cho 9 ml môi tr−ờng vào bình engol và tiếp 1ml giống nấm men. Xác định khoảng thời gian cần thiết để nấm men sinh ra 5 ml CO2 ở đầu nhánh kín của bình engol. Thời gian lên men càng nhanh chứng tỏ nấm men có khả năng lên men tốt. h) Xác định khả năng chịu cồn của các chủng nấm men: tiếp 5% men giống của mỗi chủng vào môi tr−ờng 120 Bx có nồng độ cồn ban đầu là 6, 8, 10, 12% V. Bx ban đầu - Bx sau lên men i) Xác định hiệu suất lên men = ----------------------------------------- Bx ban đầu 2.3.4. Ph−ơng pháp phân tích và đánh giá cảm quan. Sử dụng một số phép thử cảm quan nh−: - Phép thử so sánh cặp đôi - Phép thử cho điểm - Phép thử so hàng - Phép thử tam giác 2.3.5. Ph−ơng pháp công nghệ Các thí nghiệm đ−ợc tiến hành 3 lần và lấy kết quả trung bình. 73 2.3.5.1. Sơ chế quả tr−ớc khi làm thí nghiệm: a) Sơ chế mận, táo mèo: - Mận, táo mèo sau khi đã đạt độ chín (xấp xỉ 90%) đ−ợc phân loại, rửa sạch, để ráo - Sau đó chần bằng hơi n−ớc nóng ở các nhiệt độ và thời gian khác nhau - Quả sau khi chần đ−ợc để nguội đến 400C -500C - Đ−a đi chà tách hạt và thịt quả riêng bằng thiết bị chà có l−ới inox với kích th−ớc lỗ khác nhau. - Chế độ chần quả đ−ợc chọn là chế độ cho sản phẩm sau khi chà tốt nhất và hiệu quả nhất (hiệu suất tách thịt quả và hạt là cao nhất) b) Sơ chế dứa: Dứa cắt hoa, gọt vỏ, bỏ lõi, cắt nhỏ, xé. c) Sơ chế nho, dâu Nho đ−ợc rửa sạch (riêng dâu không cần rửa), loại bỏ cuộng và các tạp chất khác, đem xé nhỏ. 2.3.5.2. Nghiên cứu sử dụng enzim để tăng hiệu suất trích ly dịch quả: Phần thịt quả thu đ−ợc sau quá trình sơ chế sẽ là đối t−ợng chính cho các thí nghiệm trong quá trình nghiên cứu này. Thịt các loại quả đ−ợc chia thành nhiều mẫu, mỗi mẫu có khối l−ợng 100g ở phòng thí nghiệm và 1 tấn ở quy mô x−ởng thực nghiệm. Chuẩn bị 1 mẫu đối chứng là mẫu không bổ sung enzim. a) Khảo sát tỉ lệ enzim: Chuẩn bị các mẫu theo trình tự nh− trên gồm: - Mẫu đối chứng - Các mẫu còn lại đ−ợc bổ sung enzim nhằm mục đích nâng cao hiệu suất trích ly với các tỉ lệ khác nhau tùy theo từng loại quả 74 - Các mẫu (gồm cả mẫu đối chứng) đ−ợc xử lý ở cùng một nhiệt độ và thời gian. Sau khi đủ thời gian, các mẫu này đ−ợc nâng lên 700C trong 5 phút để vô hoạt enzim. - ép thu dịch, xác định các chỉ tiêu: thể tích dịch thu hồi đ−ợc từ thịt quả, từ đó suy ra đ−ợc hiệu suất trích ly; hàm l−ợng chất khô hòa tan; hàm l−ợng đ−ờng tổng, axit tổng… b) Khảo sát nhiệt độ hoạt động của enzim: Chuẩn bị các mẫu theo trình tự nh− trên gồm: - Mẫu đối chứng - Các mẫu còn lại đ−ợc bổ sung enzim với cùng một tỉ lệ là kết quả đã tìm đ−ợc sau thí nghiệm ở phần a. - Các mẫu (gồm cả mẫu đối chứng) đ−ợc xử lý ở các nhiệt độ khác nhau. Sau cùng một thời gian đã chọn, các mẫu này đ−ợc nâng lên 700C trong 5 phút để vô hoạt enzim. - Các b−ớc tiếp theo đ−ợc tiến hành nh− phần a. c) Khảo sát ảnh h−ởng của thời gian enzim hoạt động: Chuẩn bị các mẫu theo trình tự nh− trên gồm: - Mẫu đối chứng - Các mẫu còn lại đ−ợc bổ sung enzim với cùng một tỉ lệ là kết quả đã tìm đ−ợc sau thí nghiệm ở phần a. - Các mẫu (gồm cả mẫu đối chứng) đ−ợc xử lý ở nhiệt độ thích hợp cho enzim đã tìm đ−ợc ở phần b. Sau các khoảng thời gian khác nhau, các mẫu này đ−ợc nâng lên 700C trong 5 phút để vô hoạt enzim. - Các b−ớc tiếp theo đ−ợc tiến hành nh− phần a. 2.3.5.3. Nghiên cứu sử dụng enzim để làm trong dịch quả: Dịch quả thu đ−ợc sau khi dùng enzim trích ly hoặc bằng ph−ơng pháp ép cơ học (đối với các loại qủa mà enzim trích ly không có tác dụng) đ−ợc đ−a đi làm trong bằng ph−ơng pháp enzim. Chuẩn bị một mẫu đối chứng: là mẫu không bổ sung enzim 75 a) Khảo sát tỷ lệ enzim: Chuẩn bị các mẫu theo trình tự nh− trên gồm: - Mẫu đối chứng - Các mẫu còn lại đ−ợc bổ sung enzim nhằm mục đích làm trong dịch với các tỉ lệ khác nhau tùy theo từng loại dịch quả - Các mẫu (gồm cả mẫu đối chứng) đ−ợc xử lý ở cùng một nhiệt độ và thời gian. Sau khi đủ thời gian, các mẫu này đ−ợc nâng lên 800C trong 5 phút để vô hoạt enzim. - Sau đó, dịch đ−ợc tách cặn, xác định các chỉ tiêu: độ truyền quang, độ nhớt, thử phản ứng với nhiệt độ cao, với cồn,…. b) Khảo sát nhiệt độ hoạt động của enzim: Chuẩn bị các mẫu theo trình tự nh− trên gồm: - Mẫu đối chứng - Các mẫu còn lại đ−ợc bổ sung enzim với cùng một tỉ lệ là kết quả đã tìm đ−ợc sau thí nghiệm ở phần a. - Các mẫu (gồm cả mẫu đối chứng) đ−ợc xử lý ở các nhiệt độ khác nhau. Sau cùng một thời gian đã chọn, các mẫu này đ−ợc nâng lên 800C trong 5 phút để vô hoạt enzim. - Các b−ớc tiếp theo đ−ợc tiến hành t−ơng tự nh− phần a. c) Khảo sát thời gian hoạt động của enzim: Chuẩn bị các mẫu theo trình tự nh− trên gồm: - Mẫu đối chứng - Các mẫu còn lại đ−ợc bổ sung enzim với cùng một tỉ lệ là kết quả đã tìm đ−ợc sau thí nghiệm ở phần a. - Các mẫu (gồm cả mẫu đối chứng) đ−ợc xử lý ở nhiệt độ thích hợp cho enzim hoạt động đã tìm đ−ợc sau thí nghiệm ở phần b. Sau các khoảng thời gian khác nhau các mẫu này đ−ợc nâng lên 80oC trong 5 phút để vô hoạt enzim. - Các b−ớc tiếp theo đ−ợc tiến hành t−ơng tự nh− phần a. 76 d) Khảo sát ảnh h−ởng của pH môi tr−ờng hoạt động của enzim: Chuẩn bị các mẫu theo trình tự nh− trên gồm: - Mẫu đối chứng - Các mẫu còn lại đ−ợc bổ sung enzim với cùng một tỉ lệ là kết quả đã tìm đ−ợc sau thí nghiệm ở phần a, điều chỉnh pH môi tr−ờng với các giá trị khác nhau. - Các mẫu (gồm cả mẫu đối chứng) đ−ợc xử lý ở nhiệt độ thích hợp cho enzim hoạt động đã tìm đ−ợc sau thí nghiệm ở phần b. Sau thời gian thích hợp cho enzim hoạt động đã tìm đ−ợc ở phần c, các mẫu này đ−ợc nâng lên 80oC trong 5 phút để vô hoạt enzim. - Các b−ớc tiếp theo đ−ợc tiến hành t−ơng tự nh− phần a. 2.3.5.4. Nghiên cứu tạo thành phẩm r−ợu vang: Môi tr−ờng lên men đ−ợc chuẩn bị từ dịch quả thu đ−ợc sau quá trình làm trong, bổ sung thêm sacaroza để có cùng nồng độ chất khô hoà tan ban đầu là 18% - 20%. Giống nấm men đ−ợc nhân trong n−ớc nha chiết từ malt đại