Đề tài Khảo sát thành phần hoá học của lá ngũ sắc (lantana camara l.) họ roi ngựa (verbenaceae)

Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều rau, quả, hoa Phần lớn các flavonoids có màu vàng (do từ flavus là màu vàng); tuy vậy, một số sắc tố có màu xanh, tím, đỏ không màu cũng được xếp vào nhóm này vì về mặt hóa học, chúng có cùng khung sườn căn bản. Flavonoid có cấu trúc cơ bản là 1, 3-diphenylpropan, nghĩa là 2 vòng benzene A và B nối nhau bằng một dây có 3 cacbon, nên thường được gọi là C6-C3-C6. Cách đánh số tùy theo C3 đóng hay hở. Nếu dây C3 đóng, thì đánh số bắt đầu từ dị vòng với dị tố oxi mang số 1 rồi đánh tiếp theo đến vòng A, còn vòng B đánh số phụ. Nêú dây C3 hở, đánh số chính trên vòng B và đánh số phụ trên vòng A. O O A B1 2 3 45 6 7 8 1' 2' 3' 4' 5' 6' OH O 1 2 3 4 5 6 1' 2' 3' 4' 5' 6' A B Thường các flavonoid có mang một hoặc nhiều nhóm –OH ở vị trí 5 và vị trí 7 trên nhân A và ở vị trí 3, 4, 5 trên nhân B. Các flavonoids có thể ở dạng ự do hoặc ở dạng glycoside. Các đường thường gặp nhất là đường D-glucose, D-galactose, L-rhamnose, L-arabinose, D-xylose, D-apiose và acid uronic. Các flavonoid thường dễ kết tinh và thường có màu. Flavon thường có màu vàng nhạt hoặc màu cam, flavonol màu vàng đến vàng nhạt, chalcon có màu vàng đến cam đỏ. Một số flavonoid trong cây ngũ sắc[11, 18, 20, 24, 25, 27] O OOH OH OH HO OCH3 O OOH OH OH H3CO OCH3 3-methoxyquercetin 3,7-dimethoxyquercetin OOOH OH H3CO OCH3 OCH3 O OOH HO OCH3 OH H3CO 3,7,4’-trimethoxyquercetin Hispidulin O OOH OCH3 H3CO O HO HO OH O OH Pectolinargenin 7-O-β-D-glucoside O OOH OCH3 H3CO O HO HO OH O OH OH Camaraside Hợp chất thuộc loại quinone[6] Trong các loài thực vật, có thể gặp các loại quinone như benzoquinone, naptiquinon, antraquinone Các naptoquinone, antraquinone thường gặp trong gỗ, vỏ cây, rễ chúng hiện diện ở trạng thái tự do hoặc kết hợp với đường. Các quinone có tính kích thích nên một số quinone được sử dụng trong ngành y để trị nhuận trường, một vài khung hợp chất quinone: OO CH2CH3 O O OCH3 OH Eloides longicollis Plumbagin O O CH2OH OHOH O O O Aloe ferox Tectona grandis Trong rễ cây ngũ sắc có furanonaphthoquinones sau [11]: O OOH O O O O OH Diodantunezone Isodiodantunezone O O O OH MeO O O O OH MeO 6-methoxydiodantunezone 7-methoxydiodantunezone OO O OH MeO O O OMeO OH 6-methoxyisodiodantunezone 7-methoxyisodiodantunezone Hợp chất glycoside [6] Các glycoside hiện diện trong nhiều họ thực vật và tất cả các bộ phận: lá, vỏ, hạt Các glycoside thường là những chất kết tinh có vị đắng. Glycoside là hợp chất mà cấu trúc hóa học gồm hai phần: phần đường và phần không đường thường gọi là aglycon. Dưới tác dụng của ezym thực vật, dung dịch acid, kiềm, glycoside bị phân hủy thành aglycon và phần đường. Phần đường của glycoside thường phổ biến là D-glucose, D-galactose, L- rhamnose, L-arabinose, D-xylose, D-apiose, acid glucuronic và một số đường khác Phần aglycon của glycoside rất rất đa dạng, gồm tất cả các loại hợp chất tự nhiên: monoterpene, sesquiterpene, diterpene, triterpene, steroid, iridoid, alcaloid, quinonoid, polyphenol Trong cây ngũ sắc có hợp chất glycoside là iridoid glycosides, phenyl ethanoid glycosides Iridoid glycoside [11,16] O H HO COOCH3 O HO HO OH HOH2C O HOH2C O H COOCH3 O HO HO OH HOH2C O HOH2C H Theviridoside Genposide OCOOCH3 O HO HO OH HOH2C O HO HO O COOCH3 O HO HO OH HOH2C O HO HO HO Shanzhside methyl ester Lamiridoside Phenyl ethanoid glycoside [11,16] O O O O O O OH OH OH OH HO HO OH HO HO H3C Verbascoside O O O O O O OH OH OH OH OHHO HO H3C OH OH Lantanaside O O O O O O OH OH OCH3 OH H3CO HO OH HO HO H3C Martynoside OHO O O O O O OH OH OH HO HO OH HO HO H3C Isoverbascoside O O O HO O OH OH OH OH HO HO Derhamnosylverbascoside O O OH O HO O OH OH O HO HO O OHHO HO Isonuomioside A CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT Phương pháp chiết siêu âm là phương pháp chiết ngâm dầm (maceration) cổ điển kết hợp với siêu âm được sử dụng trong đề tài. Phương pháp này không đòi hỏi kỹ thuật phức tạp, vì thế có thể dễ dàng thực hiện thao tác với một lượng lớn mẫu cây. Ngâm bột cây (hoặc nguyên liệu được cắt nhỏ) trong bình chứa bằng thủy tinh hoặc bình thép không rỉ, bình có nắp đậy. Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến xấp xấp mặt của lớp nguyên liệu. Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc màng tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên. Sau đó, dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc, thu hồi dung môi sẽ có được cao chiết. Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chứa nguyên liệu và tiếp tục chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây. Trong quá trình chiết có thể trộn, đảo nguyên liệu để chúng thấm đều với dung môi, tăng hiệu quả khi chiết. 2.2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ[6] Sắc ký là phương pháp vật lý để tách một hỗn hợp gốm nhiều hợp chất ra riêng thành đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại hợp chất đó đối với hệ thống (hệ thống gồm hai pha: pha động và pha tĩnh). 2.2.1. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ BẢN MỎNG Sắc ký bản mỏng (TLC – thin layer chromatography) hay còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), chủ yếu dựa vào hiện tượng hấp thu, trong đó pha động là một dung môi hay một hỗn hợp dung môi đi ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ (silicagel, Al2O3). Pha tĩnh này được tráng thành một lớp mỏng, đều phủ lên một nền phẳng như một tấm kiếng, tấm nhôm. Bình sắc ký: bằng thủy tinh, trong suốt, có nắp đậy. Pha tĩnh: một lớp mỏng khoảng 0,25 mm của một loại chất hấp thu (silicagel, Al2O3) được tráng thành một lớp mỏng, đều phủ lên một nền phẳng như một tấm kiếng, tấm nhôm. Chất hấp thu trên tấm giá đỡ nhờ CaSO4 khan hoặc tinh bột, polyme hữu cơ. Mẫu phân tích: thường là hỗn hợp với nhiều hợp chất có độ phân cực khác nhau, sử dụng khoảng 1μL dung dịch mẫu với nồng độ loãng 2-5%, dùng một vi quản chấm mẫu thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phía cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng chứa trong bình. Pha động: dung môi hoặc hỗn hợp hai dung môi, di chuyển chầm chậm trên tấm bản mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó. Dung môi di chuyển đi lên cao nhờ tính mao quản. Mỗi thành phần của chất mẫu sẽ di chuyển với những vận tốc khác nhau, phía sau mực của dung môi. Vận tốc di chuyển này tùy thuộc vào lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh (hiện tượng hấp thu của pha tĩnh) và tùy thuộc vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi. Với chất hấp thu là silicagel hoặc alumin, các hợp chất kém phân cực sẽ di chuyển nhanh và hợp chất rất phân cực sẽ di chuyển chậm. 2.2.2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ CỘT Sắc ký cột dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu. Pha động là chất lỏng, pha tĩnh là các hạt silicagel. Ở phương pháp sắc ký này, các chất của hỗn hợp sẽ hấp thu hoặc dính lên bề mặt của pha tĩnh. Các hợp chất khác nhau sẽ có những mức độ hấp thu khác nhau lên pha tĩnh và chúng cũng phụ thuộc vào tính chất của pha động. Kết quả là trong quá trình pha động di chuyển chúng sẽ tách nhau ra. Trong sắc ký cột hấp thu pha rắn thường là những hạt silica gel. Trên bề mặt những hạt này có mang nhiều nhóm -OH nên đây là những pha tĩnh có tính rất phân cực. Sự hấp thu xảy ra là do sự tương tác lẫn nhau giữa các phân tử phân cực, do sự tương tác giữa những phân tử có mang những nhóm phân cực đối với pha rắn là chất rất phân cực. 2.2. PHƯƠNG PHÁP PHỔ Sử dụng các phương pháp phổ để có thể xác định được cấu trúc của các chất hữu cơ. PHỔ 1H-NMR[7] Cho thông tin về các proton 1 H có trong phân tử. Các thông số của phổ 1 H NMR cho biết độ dịch chuyển hóa học, hình dạng tín hiệu và hằng số tương tác (J) spin-spin giữa các proton không tương đương nhau sẽ cho các kiểu ghép vân phổ khác nhau, tích phân cường độ của tín hiệu thể hiện số lượng proton tương ứng với tín hiệu đó. PHỔ 13 C-NMR Cho thông tin về độ dịch chuyển hóa học của carbon trong phân tử. Các tín hiệu phổ 13 C-NMR xuất hiện trong khoảng thang chia độ rộng (0-240 ppm) nên các tín hiệu tách rõ ràng, mũi đơn dễ quan sát. Mỗi loại carbon trong hợp chất hữu cơ có độ dịch chuyển hóa học khác nhau. Dựa vào độ dịch chuyển hóa học của carbon trong phổ 13 C-NMR , có thể dự đoán được loại carbon và liên kết của carbon đó[7]. Phổ 13 C-NMR DETP cũng là một dạng phổ 13 C-NMR, theo kỹ thuật đo này người ta thực hiện ba lần ghi phổ khác nhau, lần đầu (DEPT-45) sẽ thu được phổ với đầy đủ tín hiệu của các carbon. Trong lần đo thứ hai thực hiện ngay sau đó, (DEPT- 135), những carbon metin (-CH<), và methyl (-CH3) cho tín hiệu xuất hiện ở phía trên (cường độ dương) còn tín hiệu của carbon metylen (-CH2-) cho tín hiệu ở phía dưới (cường độ âm). Ở lần đo thứ ba (DEPT-90), chỉ có những carbon metin (-CH<) mới cho tín hiệu phổ[4]. PHỔ COSY 1H -1H[4] Phổ Cosy 1H -1H, là phổ tương quan proton- proton, dùng thay thế kỹ thuật khử ghép proton trong phổ một chiều, cho biệt proton nào trong phân tử đã tương tác spin- spin với nhau. PHỔ HSQC VÀ HMBC[4] Khảo sát hạt nhân 1H ghép cặp với 13 C Phổ HSQC là phổ hai chiều cho thấy sự tương tác giữa tín hiệu carbon và tín hiệu proton gắn trực tiếp với nó. Phổ HMBC cho thấy sự tương tác của các tín hiệu carbon với tín hiệu proton ở cách nhau hai hoặc ba liên kết PHỔ KHỐI LƯỢNG (MS)[4] Phổ khối lượng hay còn gọi là phổ khối là một phương pháp phân tích mà trong đó hợp chất nghiên cứu trước tiên được hóa hơi trong điều kiện chân không cao, sau đó được ion hóa và phá thành các mảnh nhờ những va đập điện tử. Cấu tạo của hợp chất nghiên cứu được xác định thông qua việc nghiên cứu khối lượng và điện tích các mảnh cùng với xác suất xuất hiện của mảnh đó. CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 3.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 3.1.1 NGUYÊN LIỆU Nguyên liệu sử dụng cho đề tài này là phần lá của cây ngũ sắc (Lantana camara L. Verbenaceae). Nguyên liệu này được thu hái ở Cần Thơ. Mẫu nguyên liệu lá ngũ sắc được phơi khô vào tháng 9 năm 2011. 3.1.2 HÓA CHẤT + Silica gel 60, MERCK, đường kính hạt 0,06–0,2 mm. + Thuốc thử định tính H2SO4 10%/EtOH ( Pha 50ml H2SO4 đậm đặc trong 500 ml EtOH 95 %). + Ethanol 960 (T, Trung Quốc). + n-Hexan (T, Trung Quốc). + Chloroform (T, Trung Quốc). + Ethylacetate (T, Trung Quốc). + Methanol (A, Trung Quốc). 3.1.3 THIẾT BỊ + Máy siêu âm Elma S 100 H Elmasonic. + Bản mỏng silica gel Merck–GF60F254 tráng sẵn, kích thước 20 × 20 cm, độ dày lớp hấp phụ 0,2 mm của hãng Merck, Germany. + Máy soi UV: MINERALIGHT ® LAMP, U.S.A. + Bình phun xịt thuốc thử. + Bếp điện dùng nướng bản mỏng Blacker®. + Cột cao áp các loại. + Máy HPLC cột Natpro_C18 crude sep 141110. + Cân điện tử hiệu TANITA KD–200 và PRECISA XB 220ª. + Máy cô quay chân không hiệu BUCHI Rotavapor R–200. + Tủ sấy. Hình 3.1: Sắc kí lớp mỏng. Hình 3.2: Máy cô quay chân không hiệu BUCHI Rotavapor R–200. 3.2. CHIẾT XUẤT CAO Lá ngũ sắc khô (1kg) được ngâm dầm với ethanol 960 (10lít). Lọc tách bã, cô quay đuổi dung môi ở áp suất thấp thu được 160g cao ethanol. Đem cao ethanol lắc lần lượt với các đơn dung môi từ không phân cực đến phân cực: n-hexan, ethyl acetate. Sau khi lắc với n-hexan, lọc lấy dịch chiết, cô quay loại dung môi thu được cao n- hexan 28g, phần không tan tiếp tục lắc với ethyl acetate, làm tương tự như trên ta thu được 11g cao ethyl acetate, phần không tan còn lại là cao methanol 121g. Hình 3.3: Máy sắc ký cột điều chế (HPLC) Hình 3.4: Cột HPLC Sơ đồ 3.1: Quy trình chiết xuất cao EtOH và phân lập các cao từ lá ngũ sắc 3.3. CÔ LẬP VÀ TINH CHẾ 3.3.1 CÔ LẬP Sau khi tiến hành TLC các mẫu cao, chúng tôi nhận thấy cao EtOAc cho nhiều vết rõ ràng trên bản mỏng. Do đó, chúng tôi lựa chọn cao EtOAC để cô lập các hợp chất. Tiến hành cô lập bằng phương pháp sắc ký cột hấp thu với máy sắc ký cột HPLC. + silica gel 0.06 -0.2 mm. + dcột = 40 X 300 mm. Dùng bơm để bơm dung môi n-hexan ổn định cột. Sau khi ổn định cột, nạp mẫu cao EtOAc (12g) dạng khô vào cột. Tăng dần độ phân cực của dung môi giải ly. Lá ngũ sắc khô (1kg) Phần không tan Cao EtOH (160g) Bã Cao n-hexan (28g) Cao EtOAc (11g) Phần không tan (121g) -EtOH 96o (10 lít). -Lọc. -Cô quay đuổi dung môi. -n-hexan (5 lít). -Cô quay đuổi dung môi. -EtOAc (5 lít). -cô quay đuổi dung môi. Lấy thể tích mỗi phân đoạn 250ml. Theo dõi cột bằng sắc ký lớp mỏng, hện vết bằng cách phun dung dịch axit H2SO4 10% trong EtOH và hơ nóng trên bếp điện. Sơ đồ 3.2: Quy trình phân lập và tinh chế các hợp chất từ cao EtOAc CAO EtOAc 10 g - Cho 2g Silica gel vào bình cầu, trộn đều đến khô. Sau đó nạp vào cartridge 12g. - Chuẩn bị cột: Nén đầy Silica gel vào cột dcột = 4cm, Hcột= 300 cm. - Ổn định cột bằng n - Hexan trong 15 phút ở tốc độ 20 ml/phút. - Gắn cartridge chứa mẫu vào đầu cột và tiến hành sắc ký để cho ra 8 phân đoạn chính. HE 90 : 10 HE 80 : 20 HE 70 : 30 HE 25:75 EtOAc 100% PĐ E1 44.5mg EM 85:15 Hệ dung môi + HE : n-Hexan_EtOAc + EM : EtOAc _MeOH PĐ E7 1.56g PĐ E6 415.4mg PĐ E5 2.04g PĐ E2 458mg PĐ E3 2.36g PĐ E4 1.73g PĐ E8 810mg EM 70:30 HE 50 : 50 Lc01 5mg Kết tinh Lc02 4mg Kết tinh Bảng 3.1: Kết quả sắc ký cột cao áp từ cao EtOAc Phân đoạn Hệ dung môi Kết quả TLC 1 n-Hexan-Ethylacetate 90:10 Nhiều vết 2 n-Hexan-Ethylacetate 80:20 Nhiều vết, có ba vết chính 3 n-Hexan-Ethylacetate 70:30 Nhiều vết có hai vết chính màu tím 4 n-Hexan-Ethylacetate 50:50 Nhiều vết 5 n-Hexan-Ethylacetate 25:75 Nhiếu vết 6 Ethylacetate 100 Nhiều vết 7 Ethylacetate:methanol 85:15 Có 1 vết chính màu vàng 8 Ethylacetate: methanol70:30 Nhiều vết kéo vệt 3.3.2 TINH CHẾ 3.3.2.1 TINH CHẾ CHẤT Lc01 Tại phân đoạn E2, quan sát thấy có kết tinh dạng hình kim, chúng tôi thực hiện loại bỏ chất màu bằng EtOAc, kết tinh lại nhiều lần, chúng tôi nhận thấy phần kết tinh sạch, có dạng hình kim màu trắng, thực hiện chấm bản mỏng với hệ CHCl3-MeOH (9:1) thì có một vết màu tím với Rf= 0.53. Sau nhiều lần kết tinh và gom lại chúng tôi thu được 6 mg chất tinh thể hình kim màu trắng. Kí hiệu là: Lc01. Hình 3.5 Tinh chế Lc01 (a) Trước (b) Sau 3.3.2.2 TINH CHẾ CHẤT Lc02 Tại phân đoạn E7, quan sát thấy có xuất hiện dạng bột vô định hình và chúng tôi thực hiện loại bỏ chất màu bằng MeOH, kết tinh lại nhiều lần, chúng tôi nhận thấy phần bột dạng vô định hình màu vàng nhạt, thực hiện chấm bản mỏng với hệ CHCl3- MeOH ( 9:1) thì có một vết màu vàng với Rf= 0.25. Sau nhiều lần kết tinh và gom lại chúng tôi thu được 4 mg sạch màu vàng nhạt. Kí hiệu là: Lc02. Hình 3.6: Tinh chế Lc02 3.3.2.3 TINH CHẾ CHẤT Lc03 Tại phân đoạn E3, chúng tôi quan sát thấy có kết tinh của tinh thể hình kim rất giống chất Lc01, chúng tôi trích một ít hòa với MeOH, chấm lên bản mỏng, so với Lc01, giải ly ba lần với hệ CHCl3-MeOH (95:5), thấy vết màu bẩn ở trên, và hai vết màu tím sát cạnh nhau, vết dưới có Rf trùng với Lc01, còn vết trên đậm hơn có Rf = 0.58. Chúng tôi tiến hành sắc ký điểu chế (HPLC) với hệ MeOH - H2O (94:6). + Cột Phenomenex : 10×250 mm. + Hạt : 5 µm. + Tốc độ dòng: 4 ml/phút. + Dung môi sử dụng: metanol, nước. + Đầu dò: DAD. + Bước sóng: 254 nm. + Isocratic. (a) Trước (b) Sau Sơ đồ 3.3: Quy trình phân lập và tinh chế phân đoạn E3 Trong phân đoạn E3 này, chúng tôi thu được hai phân đoạn E3a và E3b, trong đó phân đoạn E3b có dạng tinh thể hình kim, nhanh chống kết tinh và tách ra khỏi phần dung dịch chưa bay hơi. Nhận thấy hiện tượng này, chúng tôi đã tách riêng phần dung dịch và phần kết tinh. Kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng: + Phần dung dịch vẫn cho hai vết màu tím sát gần nhau, giải ly ba lần hệ CHCl3 – CH3OH (95:5). + Phần tinh thể cho một vết màu tím Rf = 0.58, hệ CHCl3 – CH3OH (9:1). Sau nhiều lần tiến hành như trên chúng tôi đã thu được 7mg kết tinh hình kim, hiện màu một vết sạch màu tím. Hình 3.7: Tinh chế Lc03 Phần kết tinh  Phần dung dịch  (a)Trước (b) Sau PĐ E3a PĐ 3 PĐ E3b HPLC Lc03 7mg CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ & THẢO LUẬN 4.1 KẾT QUẢ CHIẾT XUẤT CAO Từ 1kg nguyên liệu khô thu được 160g cao ethanol thô (24% ẩm độ). Đem cao EtOH thô lắc lần lượt với các dung môi: n-hexan, EtOAc thu được: • Cao n-hexan 28g (8.3% ẩm độ). • Cao EtOAc 11g (10% ẩm độ). • Cao MeOH 121g (23.5 % ẩm độ). 4.2 KẾT QUẢ CÔ LẬP VÀ TINH CHẾ Từ 10g cao EtOAc tiến hành sắc ký cột tách ra thành 8 phân đoạn. • Tinh chế phân đoạn 2 thu được chất Lc01. • Tinh chế phân đoạn 7 thu được chất Lc02. Từ phân đoạn 3 tiến hành sắc ký cột điều chế pha đảo (HPLC). Tinh chế phân đoạn thu được chất Lc03. 4.2.1 NHẬN DANH CẤU TRÚC CHẤT Lc01 Những đặc tính của Lc01 + Là tinh thể hình kim màu trắng, kết tinh trong MeOH. + Tan tốt trong CHCl3, ít tan trong EtOAc và MeOH. + Sắc ký lớp mỏng (TLC) hiện màu bằng dung dịch axit H2SO4 10% trong EtOH: Giải ly bằng hệ CHCl3 – MeOH (9:1) cho vết tròn màu tím có Rf = 0.52. Giải ly bằng hệ CHCl3 – MeOH (95 :5) cho vết tròn màu tím có Rf = 0.15. Xác định cấu trúc Lc01 Phổ 13C NMR (bảng 4.1), (Phụ lục 1a, 1b, 1c) cho thấy sự xuất hiện 30 tín hiệu carbon: + Có chín carbon bậc bốn, gồm có một carbon carbonyl đặc trưng của acid (>C=O) 181.28 ppm, một carbon sp2 143.75 ppm, một carbon acetal (O-C-O) 98.61 ppm, các carbon bậc bốn khác có độ chuyển dịch lần lượt là [46.84, 40.47, 38.59, 35.36, 42, 31.24] ppm. + Có bốn carbon bậc ba (>CH-), gồm một carbon sp2 122.72 ppm chứng tỏ trong khung triterpene này có nối đôi, các carbon bậc ba có độ chuyển dịch lần lượt là 41.94, 50.64, 42.20 ppm. + Sáu carbon của các nhóm methyl (-CH3) [ 33.21, 27.44, 23.92, 23.67, 18.43, 17.73] ppm. + Còn lại mười một carbon methylen (-CH2-), trong đó có một carbon nối với oxi có độ chuyển dịch cao 67.91 ppm, các nhóm carbon khác có độ chuyển dịch [45.94, 34.89, 34.09, 32.48, 30.84, 29.64, 28.07, 25.53, 23.38, 19.96] ppm. Phổ 1H NMR (bảng 3.1) với một số tín hiệu đặc trưng (phụ lục 2b) + Ở vùng trường thấp có một proton 5.31 (t, J = 3.3 Hz, 1H ), proton này gắn trên carbon sp2 có độ chuyển dịch cao nhất so với các proton khác, bên cạnh đó xuất hiện proton 2.83 (dd, J = 13.5, 4.0 Hz, 1H) trên carbon bậc ba (>CH-) là proton đặc Hình 4.1 Chất Lc01 Hình 4.2 TLC của Lc01 Hệ CHCl3-MeOH ( 9:1) trưng cho H-18 của khung olean, hai proton 4.22 (dd, J = 8.8, 2.7 Hz, 1Ha); 3.89 (dd, J = 8.8, 1.6 Hz, 1Hb) là proton trên carbon methylen kề oxi. + Kế tiếp là sự xuất hiện của các proton 2.12 (m), 1.98 (m), 2.14 (m) và vùng chồng chập của các nhóm methylen (-CH2-) rất khó xác định. + Ở vùng trường cao có xuất hiện các proton của sáu nhóm methyl (-CH3) lần lượt 0.89 (s, 3H), 1.03 (s, 3H), 1.13 (s, 3H), 0.92 (s, 3H), 0.97 (s, 3H), 0.74 (s, 3H). Từ phổ HSQC (phụ lục 3a) có thể thấy các tín hiệu tương tác đặc trưng giữa carbon 122.72 ppm và proton 5.31 (t, J = 3.3 Hz, 1H ), giữa carbon 41.94 ppm và proton 2.83 (dd, J = 13.5, 4.0 Hz, 1H), giữa hai proton 4.22 (dd, J = 8.8, 2.7 Hz, 1Ha); 3.89 (dd, J = 8.8, 1.6 Hz, 1Hb) và carbon 67.91 ppm. Qua các tín hiệu đặc trưng trên phổ 13 C NMR, carbon carbonyl (>C=O) 181.28 ppm (C-28), carbon sp2 143.75 ppm (C-13), 122.72 ppm (C-12) và phổ 1H NMR có proton 5.31 (t, J = 3.3 Hz, 1H) (H-12), proton 2.83 (dd, J = 13.5, 4.0 Hz, 1H) (H-18), proton của sáu nhóm methyl (-CH3) đều chẻ mũi đơn lần lượt 0.89 (s, 3H), 1.03 (s, 3H), 1.13 (s, 3H), 0.92 (s, 3H), 0.97 (s, 3H), 0.74 (s, 3H) ppm. Có thể khẳng định Lc01 là một triterpene thuộc khung olean mà cụ thể là dẫn xuất của acid oleanolic. Ngoài ra trên phổ HMBC (phụ lục 4a), (bảng 4.1) ta thấy carbon acetal (O-C-O) 98.61 ppm có tín hiệu tương tác với các proton của hai nhóm methyl (-CH3)có độ dịch chuyển hóa học lần lượt là 1.03 (s, 3H), 0.97 (s, 3H) ppm, có thể tạm kết luận carbon acetal này là C-3 trong khung olean; đồng thời carbon acetal này cũng tương tác với hai proton trên carbon methylen có 4.22 (dd, J = 8.8, 2.7 Hz, 1H), 3.89 (dd, J = 8.8, 1.6 Hz, 1H). Từ đó ta có thể khẳng định được carbon acetal (C-3) có cầu nối oxi với carbon methylen 67.91 ppm, carbon methylen này vẫn còn hai proton nên có thể kết luận carbon là C-25 trong khung triterpene olean. Các tương tác đặc trưng trên phổ HMBC của Lc01. COOH O HO 3 25 12 18 Bảng 4.1: Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC và COSY của Lc01 (Phụ lục 1a, 1b, 1c, 2a, 2b, 2c, 4a, 4b, 4c, 4d, 5a, 5b) Vị trí C/H 1H-NMR δppm (số H; dạng mũi; J = Hz) 13C- NMR δppm Loại carbon HMBC 1H → 13C COSY 1H → 1H 1 2.12(m, 1Ha) 1.20 (m, 1Hb) 34.89 –CH2– H1a → C3,5,10 H1b → C4,10 H1b → H25a 2 1.15 (m, 1H), 1.64 (m, 1H) 28.07 –CH2– 3 98.61 HO-C–O 4 40.47 >C< 5 1.18(m,1H) 50.64 –CH< H5 → C25,4,10,6 6 1.51 (m, 1Ha) 1.70 (m, 1Hb) 19.96 –CH2– H6a → C8 H6b → C3,5,10 7 1.36 (m, 2H) 30.84 –CH2– H7 → C5,6,9,8 8 38.59 >C< 9 1.68 (m, 1H) 42.20 –CH< H9 → C8,10,11,14 H9→ H12 10 35.36 >C< 11 1.66 (m, 1Ha) 1.98 (m, 1Hb) 23.38 –CH2– H11a → C8,25,10 H11b → C8,9,12 H11b→ H12 12 5.31 (t, J = 3.3 Hz, 1H) 122.72 –CH= H12 → C9,18,14,27 H12→ H11b 13 143.75 >C= 14 42.00 >C< 15 2.14 (2H, m) 29.64 –CH2– 16 1.00 (2H, m) 25.53 –CH2– 17 46.84 >CH< 18 2.83 (dd, J = 13.5, 4.0 Hz, 1H) 41.94 –CH< H18 → C12,13,17,28 H18→ H19a H18→ H19b 19 1.14(m, 1Ha) 1.63 (m, 1Hb) 45.94 –CH2– H19a→C17,16 H19b→C30,20 H19(a,b)→ H18 20 31.24 >C< 21 1.19(m, 1H) 1.31 (m, 1H) 34.09 –CH2– H21a→C17,16 H21b→C20,19 22 1.56(1H, m) 1.74(1H,m) 32.48 –CH2– H22a→C17 H22b→C30 23 1.03 (s, 3H) 27.44 –CH3 H23→C3,4,5 24 0.97 (s, 3H) 18.43 –CH3 H24→C2,3,4,5 25 4.22 (dd, J = 8.8, 2.7 Hz, 1Ha) 3.89 (dd, J = 8.8, 1.6 Hz, 1Hb) 67.91 –CH2–O H25a→C10 H25b→C3,5,10 H25a→ H2 26 0.74 (s, 3H) 17.73 –CH3 H26→C7,9,14 27 1.13 (s, 3H) 23.92 –CH3 H27→C8,13,14,15 28 181.28 –COOH 29 0.89(s, 3H) 33.21 –CH3 H29→C19,21,22 30 0.92(s,3H) 23.67 –CH3 H30→C19,21,22 Bảng 4.2: So sánh dữ liệu phổ 13C-NMR của Lc01 với tài liệu tham khảo [9,17] Vị trí C 13C-NMR (ppm) Lc01 Lantanilic acid Lantanolal 1 34.89 34.53 34.9 2 28.07 29.24 29.5 3 98.61 98.87 98.0 4 40.47 40.25 34.9 5 50.64 50.16 50.4 6 19.96 19.72 19.5 7 30.84 30.95 31.2 8 38.59 38.26 38.5 9 42.2 41.95 41.8 10 35.36 35.04 40.1 11 23.38 23.73 23.7 12 122.72 122.48 123.2 13 143.75 143.02 142.7 14 42.00 41.95 41.8 15 29.64 27.74 26.7 16 25.53 24.11 22.1 17 46.84 50.70 49.2 18 41.94 39.15 40.9 19 45.94 45.78 45.3 20 31.24 30.07 30.6 21 34.09 37.68 27.6 22 32.48 75.30 33.1 23 27.44 27.43 27.2 24 18.43 18.27 18.2 25 67.91 67.68 67.7 26 17.73 17.44 17.5 27 23.92 25.30 24.9 28 181.28 177.98 207.1 29 33.21 33.74 33.0 30 23.67 27.20 23.3 1’ - 166.34 - 2’ - 115.94 - 3’ - 157.10 - 4’ - 20.22 - 5’ - 26.23 - COOH1 2 3 4 5 24 23 6 7 8 9 10 11 12 13 14 27 15 16 17 18 19 20 21 22 25 26 2930 28 O HO O C O C C CH3 CH3 H 1' 2' 3' 4' 5' Lantanilic acid So sánh phổ 13C-NMR, Lc01 với Lantanilic acid ta thấy sự khác biệt lớn nhất ở C-22, C-22 của Lc01 32.48 ppm, C-22 của Lantanilic acid 75.30 ppm, còn lại ở các proton khác thì có sự chênh lệch không đáng kể. CHO1 2 3 4 5 24 23 6 7 8 9 10 11 12 13 14 27 15 16 17 18 19 20 21 22 25 26 2930 28 O HO Lantanolal So sánh phổ 13C-NMR, Lc01 với Lantanolal ta thấy sự khác biệt lớn nhất ở C-28, C-28 của Lc01 181.28 ppm, C-22 của Lantanolal acid có 207.1 ppm, còn lại ở các proton khác thì có sự chênh lệch không đáng kể. Từ các tín hiệu đặc trưng trên, kết hợp so sánh với tài lệu tham khảo cho ta thấy chất Lc01 có các tín hiệu trùng khớp với triterpen khung oleanan mà cụ thể là acid oleanolic, có cầu nối oxi từ C-3 qua C-25, cho ta khẳng định rằng chất Lc01 có công thức cấu tạo là: COOH1 2 3 4 5 24 23 6 7 8 9 10 11 12 13 14 27 15 16 17 18 19 20 21 22 25 26 2930 28 O HO 3,25-epoxy-3β-hydroxyolean-12-en-28-oic acid hay Lantanolic acid 4.2.2 NHẬN DANH CẤU TRÚC CHẤT Lc02 Những đặc tính của Lc02 + Là dạng bột vô định hình màu vàng nhạt, tan tốt trong EtOAc, hỗn hợp MeOH và CHCl3, ít tan trong MeOH. + Sắc ký lớp mỏng (TLC) hiện màu bằng dung dịch axit H2SO4 10% trong EtOH: Giải ly bằng hệ CHCl3 – MeOH (9:1) cho vết tròn màu vàng có Rf = 0.25. Giải ly bằng hệ CHCl3 – MeOH (85 :15) cho vết tròn màu vàng có Rf = 0.41. Hình 4.3 Chất Lc02 Hình 4.4 TLC của Lc02 Hệ CHCl3-MeOH ( 9:1)