Đề tài Nuôi cấy nấm sợi để thu nhận lactase

o, mát mẻ. Lactose có vị ngọt. Nếu lấy độ ngọt của sucrose làm chuẩn bằng 100 thì độ ngọt của lactose chỉ bằng 16. Cơ thể thể không thể hấp thu được lactose, muốn hấp thu được nó phải bị thủy phân thành các monosaccharide đơn giản hơn là galactose và glucose. Muốn thủy phân lactose ta phải có CÔNG NGHỆ LÊN MEN- NUÔI CẤY NẤM SỢI ĐỂ THU NHẬN LACTASE GVHD: PGS.TS. Lê Văn Việt Mẫn Page 8 enzyme lactase. Enzyme lactase được hình thành và hoạt động ngay từ khi sinh ra và giảm dần trong thời gian cai sữa. Tuy nhiên nó vẫn còn tồn tại và có thể khôi phục lại nếu được dùng sữa. Tuy nhiên, hiện nay có khá nhiều người dân châu Á không thể hấp thu được lactose. Do đó nhu cầu các sản phẩm từ sữa có ít hoặc không có lactose cũng được hình thành. Muốn thu được các sản phẩm sữa như vậy cần phải dùng enzyme lactase để loại bớt hoặc hoàn toàn lactose trong sữa. 1.2. Enzyme Lactase Lactase (EC 3.2.1.23) hay còn gọi là lactase-phlorizin hydrolase hoặc lactose galactohydrolase, là một loại enzyme thuộc họ β-galactosidase. Bởi vì đây là enzyme thủy phân liên kết β-(1,3) và β-(1,4) galactoside của các polysaccharide và oligosaccharide cũng như phản ứng nghịch đảo của các phản ứng ngưng tụ và chuyển hóa thành một loại đường khác nhờ thay đổi liên kết glycoside. Do đó, như phần trên đã nói, lactase có thể dùng để thủy phân đường lactose thành các đường đơn giản hơn gồm galactose và glucose, mà sinh vật nói chung có thể hấp thu được. Hình 6: Cấu trúc không gian enzyme lactase. Lactase có trong tự nhiên và có thể tìm thấy ở các loài thực vật, động vật và vi sinh vật. Tuy nhiên, để được sử dụng trong công nghệ thực phẩm thì nó cần phải đảm bảo an toàn theo quy định của Cục quản lý dược phẩm và thực phẩm (Food and Drug Administration (FDA)). Và đã được cho phép theo bản danh mục, thì ta sử dụng lactase đi từ lên men của nấm men và nấm mốc. Hiện nay trên thị trường đã có các chế phẩm lactase được sản xuất từ : nấm sợi Aspergillus niger và Aspergilus oryzae, nấm men Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis và Candida pseudotropicalis. Thật ra lactase được tổng hợp từ các nguồn khác cũng có thể được dùng để thủy phân nhưng không ứng dụng nhiều trên quy mô công nghiệp. CÔNG NGHỆ LÊN MEN- NUÔI CẤY NẤM SỢI ĐỂ THU NHẬN LACTASE GVHD: PGS.TS. Lê Văn Việt Mẫn Page 9 Tùy vào nguồn gốc mà ta có các loại lactase khác nhau về phân tử lượng,cấu trúc không gian, các giá trị như độ pH, nhiệt độ tối thích,… cũng khác nhau. Ta có thể chia ra làm 2 loại lactase chính theo nguồn gốc của nó. Lactase từ nấm sợi còn gọi là lactase acid. Sở dĩ có tên gọi đó là vì loại lactase này có thể hoạt động tốt trong môi trường pH dao động trong khoảng 3 – 5, và nhiệt độ hoạt động từ 50 – 60 0C. Loại thứ hai là lactase có nguồn gốc từ vi khuẩn và nấm men, còn gọi là lactase trung tính vì nó hoạt động trong khoảng pH gần bằng 7 và nhiệt độ hoạt động từ 30 – 40 0C. Enzyme lactase bản chất cũng là protein nên cơ chế sinh tổng hợp cũng giống như cơ chế sinh tổng hợp của protein. Vì vậy quá trình sinh tổng hợp enzyme lactase cũng có 4 giai đoạn: Hình 7: Sơ đồ khái quát của sự sinh tổng hợp enzyme • Hoạt hóa acid amin: CÔNG NGHỆ LÊN MEN- NUÔI CẤY NẤM SỢI ĐỂ THU NHẬN LACTASE GVHD: PGS.TS. Lê Văn Việt Mẫn Page 10 Mục đích của quá trình này là làm cho phân tử acid amin trở nên hoạt động mạnh hơn, có khả năng phản ứng cao hơn, có khả năng phản ứng cao hơn và dễ tương tác với nhau hơn. • Vận chuyển acid amin đã được hoạt hóa đến ribosome: acid amin đã được hoạt hóa sẽ được vận chuyển bằng acid ribonucleic vận tải t-ARN. Ngoài chức năng vận tải và giải phóng acid amin đã được hoạt hóa khỏi bề mặt ,t-ARN còn có ý nghĩa lớn trong khâu quan trọng nhất trong sinh tổng hợp enzyme là đảm nhiệm sự phân bố acid amin trong phân tử enzyme tân tạo theo một trình tự xác định. • Cơ chế tổng hợp liên kết peptid trong ribosome và sự tạo thành cấu trúc bậc nhất của phân tử enzyme: dựa vào cơ chế mã hóa và dịch mã mà có thể tổng hợp được mạch polypeptide đặc trưng trong riboxom trên khuôn của ARN thông tin. • Giải phóng mạch polypeptide đã được và thiết lập cấu trúc không gian của phân tử enzyme. Bản chất enzyme lactase được hình thành trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật là do sự cảm ứng mà chất cảm ứng ở đây là lactose. Vì vậy, enzyme lactase được xếp vô nhóm enzyme cảm ứng. Cơ chế cảm ứng sinh tổng hợp enzyme lactase có thể được hiểu như sau: ban đầu, gen điều chỉnh mã hóa trình tự sắp xếp của các acid amin của protein kìm tỏa đặc hiệu và “phái” ARN thông tin đến riboxom để làm khuôn tổng hợp nên protein kìm tỏa. Chính sự liên kết của chất protein kìm tỏa này vào đoạn ADN (gen chỉ huy) làm cản trở sự sao chép mã của các gen cấu trúc tương ứng. Do đó, không có ARN thông tin được hình thành dẫn đến không tổng hợp được enzyme lactase. CÔNG NGHỆ LÊN MEN- NUÔI CẤY NẤM SỢI ĐỂ THU NHẬN LACTASE GVHD: PGS.TS. Lê Văn Việt Mẫn Page 11 Hình 8: Sơ đồ cơ chế sinh tổng hợp enzyme Sau đó, môi trường có xuất hiện lactose thì nó sẽ hình thành với protein kìm tỏa đó một phức: protein kìm tỏa – chất cảm ứng (lactose), kéo theo là nó không còn có khả năng phong tỏa gen chỉ huy nữa. Do đó mà sự sao chép mã trên gen cấu trúc được tiến hành và enzyme lactase được tổng hợp. Như đã nói ở trên, enzyme lactase được sử dụng để thủy phân lactose trong sữa và whey, tạo ra các sản phẩm có hàm lượng đường lactose thấp, sản phẩm yoghurt, phô mai tươi mà không có thêm đường. Ngoài ra trong một số trường hợp, đường lactose không thể tiêu hóa ở một số người do không có enzyme lactase trong cơ thể. Do đó, để hạn chế bất lợi này, các sản phẩm từ sữa cần được xử lý với lactase trước. CÔNG NGHỆ LÊN MEN- NUÔI CẤY NẤM SỢI ĐỂ THU NHẬN LACTASE GVHD: PGS.TS. Lê Văn Việt Mẫn Page 12 Hình 9: Phản ứng thủy phân lactose bởi enzyme lactase Hình 10: Cơ chế thủy phân lactose bởi enzyme lactase. Do độ bền của enzyme lactase có nguồn gốc từ vi sinh vật là rất lâu mà nó mới được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp như vậy. Thông thường, lactase từ nấm men có thể dùng được trên 2 năm còn từ nấm sợi thì có thể dùng lâu hơn nữa. 2. NGUYÊN LIỆU: 2.1. Môi trường: Bàng 1: Thành phần hỗn hợp cho môi trường được sử dụng trong quá trình lên men Thành phần tỷ lệ(% khối lượng) Cám bột mì 10% Lactose 15% Dịch chiết nấm men 1.50% KCl 0.50% FeSO4.7H2O 0.01% CÔNG NGHỆ LÊN MEN- NUÔI CẤY NẤM SỢI ĐỂ THU NHẬN LACTASE GVHD: PGS.TS. Lê Văn Việt Mẫn Page 13 Cám bột mì Lúa mì hay tiểu mạch (Triticum spp.) là một nhóm các loài cỏ đã thuần dưỡng từ khu vực Levant và được gieo trồng rộng khắp thế giới. Về tổng thể, lúa mì là thực phẩm quan trọng cho loài người, sản lượng của nó chỉ đứng sau ngô và lúa gạo trong số các loài cây lương thực. Hạt lúa mì là một loại lương thực chung được sử dụng để làm bột mì trong sản xuất các loại bánh mì; mì sợi, bánh, kẹo v.v cũng như được lên men để sản xuất bia rượu hay nhiên liệu sinh học. Lúa mì cũng được gie trồng ở quy mô hạn hẹp làm cỏ khô cho gia súc và rơm cũng có thể dùng làm cỏ khô cho gia súc hay vật liệu xây dựng để lợp mái. Hình 11: Cấu tạo hạt lúa mì Hạt lúa mì gồm có 13-17% là cám, 80-85% là nội nhủ, 2-3% là mầm. Sau khi hạt lúa mì được nghiền nhỏ, ta sẽ thu được bột. sau nhiều công đoạn sàng rây, từ bột lúa mì ta tách để thu được cám lúa mì. Bảng 2: Thành phần dinh dưỡng có trong 100 g cám bột mì: Thành phần khối lượng trên 100g cám bột mì(g) chất béo 4 tổng hàm lượng cacbohydrate 65 Protein 16 CÔNG NGHỆ LÊN MEN- NUÔI CẤY NẤM SỢI ĐỂ THU NHẬN LACTASE GVHD: PGS.TS. Lê Văn Việt Mẫn Page 14 Bảng 3: Thành phần vitamin có trong 100g cám bột mì Vitamins Vitamin A 9 IU Retinol 0 mcg Alpha Carotene 0 mcg Beta Carotene 6 mcg Beta Cryptoxanthin 0 mcg Lycopene 0 mcg Lutein + Zeaxanthin 240 mcg Vitamin C 0 mg Vitamin E 1.49 mg Vitamin K 1.9 mcg Thiamin 0.523 mg Riboflavin 0.577 mg Niacin 13.578 mg Vitamin B6 1.303 mg Vitamin B12 0 mcg Folate 79 mcg Food Folate 79 5.6 mcg Folic Acid 0 mcg Dietary Folate Equivalents 79 mcg Pantothenic Acid 2.181 mcg Bảng 4:Thành phần khoáng có trong 100g cám bột mì Minerals Calcium 73 mg Iron 10.57 mg Magnesium 611 mg Phosphorus 1013 mg Potassium 1182 mg Sodium 2 mg Zinc 7.27 mg Copper 0.998 mg Manganese 11.5 mg Selenium 77.6 mcg Lactose: loại đường lactose như đã trình bày ở trên, và loại đường dùng để bổ sung vào dưới dạng đường tinh thể CÔNG NGHỆ LÊN MEN- NUÔI CẤY NẤM SỢI ĐỂ THU NHẬN LACTASE GVHD: PGS.TS. Lê Văn Việt Mẫn Page 15 Dịch chiết nấm men: sử dụng sản phẩm đã được thương mại hóa dịch chiết nấm men DIFCO. Đây là một trong những nguồn cung cấp N cho nấm sợi được sử dụng. 2.2. Vi sinh vật: Các tiêu chuẩn về chọn giống nấm sợi để tổng hợp enzyme lactase: - Không có khả năng sinh tổng hợp độc tố. - Khả năng sinh tổng hợp enzyme lactase càng cao càng tốt. - Thích nghi với môi trường nhanh và tốc độ sinh trưởng cao. - Điều kiện nuôi cấy đơn giản, môi trường rẻ tiền. - Hoạt lực của enzyme lactase tạo ra càng mạnh càng tốt. Như đã trình bày ở trên thì chỉ trong quy mô công nghiệp người ta quan tâm nhiều nhất là đến loài Aspergillus oryzae. Vì những tính năng thỏa mãn yêu cầu trên và tối ưu nhất. Do đó ta chọn loài này làm đối tượng nghiên cứu. Nấm sợi (Filamentous fungi) là vi sinh vật chân hạch, ở thể tản (thalophyte), tế bào không có diệp lục tố, sống dị dưỡng (hoại sinh, ký sinh, cộng sinh), vách tế bào cấu tạo chủ yếu là chitin, có hay không có celuloz và một số thành phần khác có hàm lượng thấp. chúng có hình sợi , sợi có ngăn vách (đa bào) hay không có ngăn vách (đơn bào). Sợi nấm thường là một ống hình trụ dài có kích thước lớn nhỏ khác nhau tùy loài. Đường kính của sợi nấm thường từ 3-5µm, có khi đến 10µm, thậm chí đến 1mm. Chiều dài của sợi nấm có thể tới vài chục centimet. Các sợi nấm phát triển chiều dài theo kiểu tăng trưởng ở ngọn (Hình 1.1). Các sợi nấm có thể phân nhánh và các nhánh có thể lại phân nhánh liên tiếp tạo thành hệ sợi nấm (mycelium) khí sinh xù xì như bông. Trên môi trường đặc và trên một số cơ chất trong tự nhiên, bào tử nấm, tế bào nấm hoặc một đoạn sợi nấm có thể phát triển thành một hệ sợi nấm có hình dạng nhất định gọi là khuẩn lạc nấm. Aspergillus sp. Có khoảng hơn 100 loài khác nhau, cùng thuộc dòng nấm bất toàn (Deuteromycetes). Có cấu trúc hình thái chung như sau: CÔNG NGHỆ LÊN MEN- NUÔI CẤY NẤM SỢI ĐỂ THU NHẬN LACTASE GVHD: PGS.TS. Lê Văn Việt Mẫn Page 16 Hình 12: Cấu tạo cơ bản của nấm sợi Aspergillus .sp Loài A. oryzae đóng một vai trò quan trọng trong ngành sản xuất các loại thực phẩm như sake, shoyu và miso. Cách đây khoảng hơn 1000 năm thì nó đã được sử dụng để lên men thực phẩm và đồ uống. Thêm vào đó, nó cũng được dùng trong ngành công nghiệp sản xuất enzyme. Đây là loài nấm sợi ưa khí, thuộc giống Aspergillus, phân giống Curcumdati,nhóm Flavi, được xếp chung nhóm với A. flavus. Trong nhóm Flavi này ngoài 2 loài trên còn có A. parasiticus. Đây là một nhóm các vi sinh vật được ứng dụng nhiều trên thế giới. Tuy nhiên chúng lại có khả năng sinh độc tố, ngoại trừ loài A. oryzae này. Vì đặc tính trên mà nó được sử rộng rãi ở quy mô công nghiệp thực phẩm vì tính năng an toàn. Loài A.oryzae có thể được tìm thấy trong đất và thực vật, đặc biệt là ở trong gạo. A. oryzae được đặc tên sau khi được tìm thấy trong tự nhiên và nuôi cấy trên môi trường gạo là Oryza sativa. A. oryzae sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ trong khoảng 32 – 36 0C ( ±1 0C), không thể sống nếu như nhiệt độ trên 44 0C; pH tối ưu là từ 5 – 6, nó cũng có thể sống trong khoảng pH dao động từ 2 – 8. CÔNG NGHỆ LÊN MEN- NUÔI CẤY NẤM SỢI ĐỂ THU NHẬN LACTASE GVHD: PGS.TS. Lê Văn Việt Mẫn Page 17 Hình 13: Cấu tạo cuống bào tử Aspergillus oryzae. Đã có bài báo cáo xác nhận, A. oryzae có thể sống trên môi trường cám gạo với độ ẩm 16%. Nó sống trên những môi trường mà hoạt độ của nước phải lớn hơn hoặc bằng 0.8, rất hiếm khi nó có thể sống nếu aW nhỏ hơn 0.8. Màu sắc của nấm sợi này nếu trên một môi trường sạch thì ta có thể thấy có màu xanh lá cây, còn nếu trên môi trường đã cũ thì nó có thể có màu nâu, thỉnh thoảng là xanh lá cây trộn với màu nâu. Cũng như các loại nấm sợi khác, hình thức sinh sản chủ yếu của nó là sinh sản bằng bào tử. Bào tử đính của loại nấm sợi này ở thể đơn bội, nhưng có nhiều nhân. Bào tử đỉnh ở trên xòa rộng, đường kính từ 100 đến 200 micromet. Mỗi một bào tử của nó có kích thước khá lớn 5 – 8 micromet, có dạng hình cầu hoặc là những hình oval rất nhỏ. Thành bào tử có thể láng mịn hoặc xù xì. Cuống bào tử thường không có màu, hầu hết bề mặt bên ngoài nhám, cũng có những trường hợp đặc biệt thì láng mịn. Cuống thường dài, khoảng từ 1 – 5 mm. Trong công nghiệp để nhân giống người ta thường nuôi cấy loại nấm sợi này trên các môi trường như thạch dịch chiết nấm men Czapek ở 37 0C hay môi trường thạch dịch chiết nấm men ở 25 0C trong 7 ngày thì thấy khả năng sinh trưởng là rất tốt. Cần nhấn mạnh một lần nữa là A. oryzae không có khả năng tổng hợp độc tố aflatoxin. Bởi vì để tổng hợp được aflatoxin cần phải trải qua một chu trình mà trong đó cần có 16 enzyme xúc tác, do cấu trúc gen khác biệt nên loài này không thể tổng hợp được một số loại enzyme dẫn đến tính chất đặc trưng trên. CÔNG NGHỆ LÊN MEN- NUÔI CẤY NẤM SỢI ĐỂ THU NHẬN LACTASE GVHD: PGS.TS. Lê Văn Việt Mẫn Page 18 3. QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ 3.1. Sơ đồ khối Hình 14:Sơ đồ quy trình sản xuất enzyme Lactase 3.2. Sơ đồ thiết bị Nguyên liệu Nuôi cấy Tiệt trùng Chuẩn bị môi trường Giống vi sinh vật Nhân giống Canh trường sau khi nuôi cấy Làm nguội CÔNG NGHỆ LÊN MEN- NUÔI CẤY NẤM SỢI ĐỂ THU NHẬN LACTASE GVHD: PGS.TS. Lê Văn Việt Mẫn Page 19 CÔNG NGHỆ LÊN MEN- NUÔI CẤY NẤM SỢI ĐỂ THU NHẬN LACTASE GVHD: PGS.TS. Lê Văn Việt Mẫn Page 20 4. GIẢI THÍCH QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ 4.1. Nguyên liệu: Phải đạt những chỉ tiêu ban đầu đã qui định ở trên 4.2. Chuẩn bị môi trường: • Mục đích: chuẩn bị cho các quá trình kế tiếp. • Các biến đổi chính: Gia tăng nồng độ của các chất thêm vào, thay đổi pH của môi trường. • Cách thực hiện: Cám bột mì cùng với lactose sẽ được bổ sung thêm muối KCl, FeSO4.7H2O theo bảng dưới đây Bảng 5: Môi trường nuôi cấy Thành phần tỷ lệ(% khối lượng) Cám bột mì 10% Lactose 15% Dịch chiết nấm men 1.50% KCl 0.50% FeSO4.7H2O 0.01% Ngoài ra ta còn bổ sung vào (NH4)2SO4 5g/l, KH2PO4 15g/l. Sau đó cho vào một bình đựng bằng thép không rỉ, hình trụ. Bình này vừa có tác dụng khuấy trộn vừa có tác dụng tiệt trùng bằng nhiệt. Chú ý là lượng nước cho vào trước khi tiệt trùng chỉ bằng 10% lượng nước cần cho vào. Sau khi đã được thêm vào ta khuấy trộn đều bằng thiết bị cánh khuấy Các thông số: o Vận tốc cánh khuấy 200 vòng/ phút. o Thời gian khuấy: tùy lượng môi trường, thông thường từ 15 – 20 phút. 4.3. Tiệt trùng môi trường • Mục đích: chuẩn bị cho quá trình nuôi cấy, tạo một môi trường tốt nhất. • Các biến đổi chính: o Hóa sinh: Vô hoạt enzyme o Sinh học: tiêu diệt các loại vi sinh vật o Hóa học: Thủy phân protein, tạo nguồn N cho nấm sợi sử dụng, các cấu tử mẫn cảm như vitamin có thể bị mất do nhiệt o Vật lý: Thể tích,khối lượng thay đổi • Yêu cầu: Quá trình tiệt trùng càng ít làm mất mát các loại vitamin, khoáng càng tốt. Đây là những yếu tố sinh trưởng cho vi sinh vật. Song cũng cần đảm bảo tiêu diệt được các loại vi sinh vật khác. Tạo điều kiện thuận lợi khi cho nấm sợi vào. CÔNG NGHỆ LÊN MEN- NUÔI CẤY NẤM SỢI ĐỂ THU NHẬN LACTASE GVHD: PGS.TS. Lê Văn Việt Mẫn Page 21 • Phương thức thực hiện: cho gia nhiệt bằng hơi nước qua vỏ bình tiệt trùng. Bình tiệt trùng hình trụ, làm bằng thép không rỉ, trên bình có gắn các cảm biến để xác định các thông số nhiệt độ và áp suất. Ta sử dụng hơi nước đã được tiệt trùng để gia nhiệt cho bình lên đến thông số cần đạt. Hình 15: Bình tiệt trùng Thông số: o Nhiệt độ : 121 0C o Áp suất : 1.52 bar o Thời gian: 15 phút Sau quá trình tiệt trùng ta chuyển toàn bộ môi trường qua bình điều nhiệt 4.4. Làm nguội: • Mục đích: chuẩn bị cho quá trình nuôi cấy. • Các biến đổi chính: nhiệt độ môi trường sẽ giảm xuống. • Yêu cầu: nhiệt độ của môi trường còn khoảng 35 0C, pH của môi trường từ 5 – 6. • Phương pháp: dùng bình điều nhiệt,bình này cũng là bình hình trụ làm bằng thép không rỉ, bên trong có các cánh khuấy, khuấy để đảm bảo sự đồng đều của nhiệt độ. Nếu như cần thiết ta có thể dùng một dòng tác nhân lạnh để trao đổi nhiệt qua vỏ bên ngoài. 4.5. Giống vi sinh vật • Yêu cầu: đạt được những tiêu chuẩn đã được trình bày ở trên. • Chọn loài Aspergillus oryaze vì đây là loài không có khả năng sinh độc tố, tốc độ sinh trưởng nhanh và cũng là đối tượng của ngành công nghệ sản xuất enzyme lactase từ vi sinh vật. 4.6. Nhân giống: CÔNG NGHỆ LÊN MEN- NUÔI CẤY NẤM SỢI ĐỂ THU NHẬN LACTASE GVHD: PGS.TS. Lê Văn Việt Mẫn Page 22 • Mục đích: chuẩn bị cho quá trình nuôi cấy. • Yêu cầu: tạo được giống Vi sinh vật có hoạt lực ổn định, mạnh, số lượng đáp ứng đủ nhu cầu quá trình lên men. • Phương thức thực hiện: Ta sẽ tiến hành nhân giống tùy theo yêu cầu của thiết bị ta sẽ xác định được quy mô nhân giống. giả sử cần 100 m3 thể tích lên men. Từ giống đã phân lập, ta tiến hành nuôi cấy trên môi trường thạch nấm men – nấm sợi để thu nhận sinh khối 4.7. Môi trường nhân giống : môi trường ATCC medium 325 Bảng 6: công thức để pha chế 1 lít môi trường nhân giống Dịch chiết nấm men 20.0 g Glucose 20.0 g Pepton 1.0 g Agar 20.0 g Nước cất 1.0 L Sau đó ta quan đem quan sát thử trên kính hiển vi, đếm số lượng tế bào bằng dụng cụ thích hợp. Nếu đạt chất lượng, chỉ tiêu thì tiến hành tiếp. Từ giống gốc, ta hòa vào nước lấy 10ml dung dịch chứa giống cần dùng sau đó tiến hành nuôi cấy trong môi trường như trên thí nghiệm 4.8. Sơ đồ nhân giống: • Trong phòng thí nghiệm: 10mL– 100mL – 1000mL – 10L • Trong phân xưởng : 10L – 100L – 1000L – 10 m3 – 100 m3.  Lưu ý: Trong quá trình nhân giống ta nên cho môi trường tối thích để vi sinh vật phát triển ở những cấp nhân giống đầu. Sau đó, nên pha loãng với môi trường sẽ nuôi cấy để lên men nhưng tăng từ từ để vi sinh vật thích nghi dần với môi trường mới. Nên sản phẩm thu được sau này sẽ cao hơn, hoạt tính vi sinh vật mạnh hơn. Trong quá trình nhân giống cũng như là lên men thì có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình Nhiệt độ: Hầu hết các loài Vi sinh vật nói chung và nấm sợi nói riêng thì bị ảnh hưởng rất nhiều bởi nhiệt độ. Nhiệt độ quá thấp có thể gây ức chế nấm sợi, còn nếu quá cao có thể làm chết vi sinh vật, chưa kể đến làm các thành phần môi trường nuôi cấy bị thay đổi. Oxy: Đây là một chỉ tiêu quan trọng đối với nấm sợi vì chúng là nhóm hiếu khí bắt buộc. do đó cần cung cấp oxy đầy đủ để tổng hợp năng lượng, sinh khối. Nếu thiếu thì gây ức chế hoặc làm chết nấm sợi. Thời gian nuôi cấy: CÔNG NGHỆ LÊN MEN- NUÔI CẤY NẤM SỢI ĐỂ THU NHẬN LACTASE GVHD: PGS.TS. Lê Văn Việt Mẫn Page 23 Đặc biệt quan trọng, nếu để quá lâu hoặc thu quá sớm thì ta sẽ thu sinh khối nấm sợi với số lượng ít hơn có thể. Cũng như các loài vi sinh vật khác, nên thu hoạch cuối giai đoạn phát triển pha log ( vi sinh vật phát triển với tốc độ nhanh nhất (μexpo max)). Có thể kiểm tra bằng cách xác định hàm lượng ATP trong tế bào. Các thông số: o Nhiệt độ : 30 – 35 0C o Hàm lượng oxy: nhỏ nhất là 20% của khí được cho vào nhân giống o Thời gian nuôi cấy: tùy mỗi cấp nhân giống, thông thường thì thời gian nhân giống của mỗi cấp nhân giống thường dao động trong khoảng từ 24 – 36 h. 4.9. Nuôi cấy: • Mục đích: khai thác enzyme lactase, tạo điều kiện cho nấm sợi phát triển. • Yêu cầu: càng tạo ra nhiều enzyme lactase càng tốt, hoạt lực enzyme càng mạnh càng tốt. • Các biến đổi chính o Sinh học: nấm sợi sử dụng các nguồn dinh dưỡng như C,N có sẵn tạo ra một phần năng lượng, tăng sinh khối sau đó,nấm sợi tự tổng hợp ra lactase để thủy phân lactose tạo ra những đường đơn giúp cơ thể hấp thu. o Vật lý: nhiệt độ tăng, do quá trình sinh tổng hợp tạo ra năng lượng, độ ẩm thay đổi o Hóa lý: thành phần môi trường thay đổi theo độ ẩm, nhiệt độ. o Hóa học: hàm lượng oxy giảm do sinh vật đã sử dụng và tạo ra CO2 ( tăng nồng độ) • Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình: cũng như trên là nhiệt độ, oxy, hoạt lực của nấm sợi Nhiệt độ: Nhiệt độ quá cao, vi sinh vật hoạt động kém hoặc có thể ngừng hoạt động, chưa kể đến là enzyme lactase tạo ra bị vô hoạt. ngược lại, nhiệt độ quá thấp sẽ làm cho vi sinh vật bị ức chế, các quá trình sinh hóa xảy ra chậm, dẫn đến thời gian lên men sẽ bị kéo dài. Thông thường nên giữ ở nhiệt độ 35 0C là nhiệt độ tối thích cho loài này. Oxy: Đây là loài hiếu khí bắt buộc, vì vậy để tạo điều kiện cho nấm sợi phát triển thì dùng thiết bị sục khí vào trong thiết bị lên men, có cánh khuấy. Thông thường thì lượng oxy được cung cấp cũng phải ít nhất là 20% thể tích khí đưa vào bình Lượng giống cấy: Quá nhiều hay quá ít đều ảnh hưởng không có lợi. Thông thường, tỷ lệ giống cấy là 107 bào tử/ml. • Thiết bị: CÔNG NGHỆ LÊN MEN- NUÔI CẤY NẤM SỢI ĐỂ THU NHẬN LACTASE GVHD: PGS.TS. Lê Văn Việt Mẫn Page 24 Hình 16: Thiết bị lên men Thiết bị lên men là một bồn hình trụ làm bằng thép không gỉ, có cánh khấy, có hệ thống đầu dò để kiểm soát nhiệt độ, khi cần thiết ta có thể tiến hành trao đổi nhiệt qua vỏ ống. Ngoài ra còn có hệ thống sục khí vào thiết bị. Không khí được qua bơm rồi qua màng lọc membrane để loại hết những vi sinh vật không mong muốn trước khi sục vào bình. Khi cần thiết, với một nguồn oxy lớn hơn thành phần oxy có trong không khí, ta có thể trộn oxy nguyên chất với không khí với một tỷ lệ xác định. • Các thông số: o Nhiệt độ làm việc: 30 oC’. o pH nhỏ nhất: 4. o Điều chỉnh tốc độ cánh khuấy: 250 – 600 vòng/phút. o Hàm lượng oxy trong không khí: ≥20 % (v/v). o Sục khí 5 L/phút. o Thời gian nuôi cấy khoảng 160 h. Mỗi 8h ta tiến hành đo hoạt lực của enzyme. 4.10. Nhận xét quá trình CÔNG NGHỆ LÊN MEN- NUÔI CẤY NẤM SỢI ĐỂ THU NHẬN LACTASE GVHD: PGS.TS. Lê Văn Việt Mẫn Page 25 Quá trình nuôi cấy sử dụng phương pháp lên men bề sâu, mà trong nuôi cấy thu nhận enzyme lactase nói riêng và trong sản xuất enzyme nói chung thì nên nuôi cấy thu nhận bằng phương pháp lên men bề mặt nên chất lượng enzyme có thể sẽ thấp. Không phải tốn quá nhiều hơi và nhiệt như phương pháp lên men bề mặt vì hơi và nhiệt dễ dàng đi bên trong môi trường lên men, trong khi đó thì lên men bề mặt khó mà hơi và nhiệt có thể đi sâu vào trong cả môi trường. Tuy nhiên một ưu điểm vượt trội của phương pháp này là dễ dàng cơ giới hóa và tự động hóa cũng như chuyển sang qui mô sản xuất lớn rất dễ dàng và đơn giản. 4.11. Sản phẩm Sản phẩm là một canh trường sau khi lên men có lẫn enzyme lactase cần thu nhận, do đó, thật ra người ta sẽ làm bước kế tiếp để tách enzyme ra khỏi canh trường. Và lúc đó, người ta sẽ đánh giá thêm chỉ tiêu về hoạt lực của enzyme, độ tinh sạch enzyme… Còn đối với canh trường sau lên men có một số yêu cầu sau: • Hàm lượng của enzyme lactse có trong sản phẩm càng cao càng tốt. Thông thường thì hoạt lực của enzyme lactase là 100000 FCC/g • Lượng cơ chất sót càng ít càng tốt như acid amin, đường… Ngoài ra cũng cần kiểm soát các sản phẩm phụ tạo ra có thể có cả các enzyme khác lẫn vào. Ta hạn chế các chất này đến mức thấp nhất. • Bảo quản ở điều kiện thích hợp tránh các tác nhân có thể làm vô hoạt enzyme lactase như nhiệt độ không vượt quá 55 0C , pH nên đạt từ 4.5 – 5. 5. THÀNH TỰU CÔNG NGHỆ 5.1. Đột biến Aspergillus oryzae cho sản xuất protein đơn giản Người ta tiến hành gây đột biến điểm đối với loài Aspergillus oryzae (MTCC 1846) bằng chất hóa học Ethyl Methyl Sulphonate (EMS). Ủ cả môi trường trong vòng 1 h với chất EMS để đột biến đến 98 % bào tử. Sau khi kiểm tra các môi trường ta thu được ba loài đột biến kí hiệu tên Shan 1, Shan 2 và Shan 3. Cả ba loài này đều được sử dụng để sản xuất protein tế bào. Trong đó loài Shan 2 cho lượng protein nhiều hơn cả. Nó tăng trưởng tốt nhất với điều kiện pH= 3 - 7, nhiệt độ 36-45 oC. Tốc độ tăng trưởng cụ thể của Shan2 cao hơn trên các canh trường có chứa các chất nền như glucose, maltose và cellulose. Shan2 có hàm lượng cao hơn các axit amino khi so sánh với tiêu chuẩn của FAO và A. oryzae (MTCC 1846), hàm lượng acid amin của Shan2 được xấp xỉ bằng với hàm lượng của đậu tương trong bữa ăn. • Môi trường nuôi cấy: Cám gạo sau đó cho vào trong NaOH 0.25 M và tiệt trùng ở 121 0C trong 15 phút. Môi trường được làm mát sau đó lịc bằng vải và rửa dưới nước sinh hoạt để pH trung tính. Sau đó được sấy trong 60 0C và để qua đêm và nghiền nó đến kích thước 0.3 mm. • Giống cấy: Aspergillus oryzae (MTCC 1846) và các đột biến của nó được nuôi cấy trên môi trường thạch dextrose khoai tây. Được nuôi cấy lại