Đề tài Phô mai và chế phẩm enzyme hoàn thiện mùi vị của phô mai

oạt tính cao nhất. Một vài enzyme có hoạt tính trong cả hai vùng pH: acid và kiềm, sản phẩm cuối cùng ở mỗi khoảng pH khác nhau có thể khác nhau. Ở hầu hết các loại phô mai cứng, pH thích hợp cho quá trình ủ chín là 4.9 – 5.5. Giá trị pH Công nghệ chế biến đồ uống&sữa 6 thấp có xu hƣớng hình thành các hợp chất nitơ tan đƣợc, amino nitrogen, amoniac và thúc đẩy thủy phân chất béo. III. VAI TRÒ CỦA ENZYME TRONG VIỆC HÌNH THÀNH MÙI VỊ PHÔ MAI: 1) Sự phân giải lipid (lipolysis): a. Lipid và các acid béo tạo mùi vị: - Tuỳ thuộc vào thời kì cho bú, sữa bò chứa từ 3- 5% chứa từ 3-5% chất béo. Các hạt cầu béo có đƣờng kính từ 0.1- 10μm.Thành phần chính của chất béo trong sữa là trigelyceride. Ngoài ra còn có diglycerides (0.36% to 1.8%), monoacylglycerols (0.03%) và acid béo tự do (0.03%) và phospholipids (0.6%), cholesterol tự do (0.3%) và vết của cholesterol esters (Mariani,Contarini, Zucchetti & Toppino, 1990; Walstra & Geurts, 1982). - Đặc điểm cuả chất béo trong sữa bò là chứa nhiều các acid béo mạch ngắn. Hơn nữa, sự phân phối các acid béo trong sữa triglyceride là không ngẫu nhiên (Angers, Tousignant, Boudreau & Arul, 1998). Các axít béo chính trong chất béo bò sữa, và vị trí của chúng đƣợc đƣa ra trong bảng : Bảng 1: Phân phối các thành phần acid béo chủ yếu trong triacyl-sn-glyceride trong sữa bò ( Christie & Clappeton,1982) - Nhƣ đã đề cập ở trên, triglyceride trong sữa bò phần lớn là ester mạch thẳng, chứa các acid béo bão hòa với số C chẵn từ 2 đến 20 phân tử cacbon. Sau khi thủy phân, các acid béo tự do (FFA) có thể là các hợp chất hƣơng quan trọng. Đặc biệt acid butyric có vị phô mai đặc trƣng. Acid butyric và các chuỗi acid béo mạch ngắn (từ 2C đến 6C) có thể đƣợc tạo ra từ việc thủy phân chất béo, cũng nhƣ là từ quá trình dị hóa protein bởi acid lactic bacteria. Công nghệ chế biến đồ uống&sữa 7 - Ngƣỡng hƣơng thơm của các acid béo tự do chịu ảnh hƣởng đáng kể bởi các thành phần môi trƣờng và độ pH của nó. Trong nhóm các acid béo có sự phân cực đáng kể, ngƣỡng của vị khác nhau giữa môi trƣờng nƣớc và chất béo.pH ảnh hƣởng đến vị, vì các anion của acid béo ở pH cao thì ít hoạt tính mùi vị hơn, ít bay hơi hơn, và có cảm giác nhƣ mùi xà phòng. - Ngƣỡng mùi vị trong môi trƣờng chất béo khoảng 0.7(butyric acid) đến 15000 ppm (stearic acid) (Siek et al., 1969). Trong nƣớc, ngƣỡng này khoảng 0.5 (octanoic acid) đến 50 (acetic acid) (Rothe, Woelm, Tunger & Siebert, 1972). Trong môi trƣờng chất béo, hỗn hợp các acid béo chứa 2C đến 12C có thể nhận thấy đƣợc, mặc dù nồng độ này nhỏ hơn ít nhất 10 lần so với ngƣỡng hƣơng của chúng (Siek et al., 1969). Vì vậy, các acid béo tự do cho thấy ảnh hƣởng mạnh mẽ trong môi trƣờng chất béo, ảnh hƣởng này chắc chắn có vai trò trong phô mai. Bảng 2: Hàm lƣợng các acid béo trong các loại phô mai khác nhau a b Công nghệ chế biến đồ uống&sữa 8 a Đơn vị của các giá trị là mg/kg b giá trị trong ngoặc đơn đại diện cho độ lệch chuẩn của phƣơng tiện c MS-đƣợc xác nhận bằng cách so sánh thời gian lƣu của hợp chất thực - Phân giải lipid trong khối đông phô mai liên quan đến vấn đề bẻ gãy các chất béo sữa thành diglyceride, monoglyceride và acid béo tự do. - Một vài acid béo tự do có thể đƣợc tổng hợp nhờ vi khuẩn lactic và các vi sinh vật khác từ carbohydrate và protein. Nhƣng nhiều tài liệu đã chỉ ra rằng phân giải lipid là nhân tố chính hình thành nên các acid béo tự do mạch dài hơn C4 ( Aston &Dulley,1982). - West & Pawlett ( 1996) phân biệt rằng: esterase là enzyme thủy phân các ester tan trong nƣớc và lipase là enzyme thủy phân liên kết ester trong dầu và chất béo. - Lipid tạo thành mùi vị phô mai theo 3 con đƣờng: o Chúng là nguồn các acid béo, đặc biệt là các acid béo mạch ngắn ( là những chất cấu thành nên hƣơng vị phô mai). Acid béo sinh ra trong quá trình phân giải lipid. Nó có thể bị chuyển hóa thành các chất thơm và hợp chất tạo hƣơng vị , đặc biệt là methyl ketone và lactone. o Acid béo, nhất là các acid béo chƣa bão hòa, sẽ bị oxi hóa thành các aldehyde chƣa bão hòa. Tuy nhiên, sự oxi hóa chất béo này xảy ra rất hạn chế trong phô mai bởi vị mùi vị của nó không tốt. o Lipid có khả năng hòa tan các hợp chất thơm và vị từ môi trƣờng. Điều này là nguyên nhân của các vị lạ. Bảng 3: Độ dài mạch C của các acid béo và mùi của chúng Acid béo Mạch C Mùi Mạch ngắn C2 - C6 Phô mai Mạch trung bình C8 - C12 Bơ Mạch dài Lớn hơn C16 Xà phòng Công nghệ chế biến đồ uống&sữa 9 Hình 1: Các con đƣờng hình thành hợp chất tạo mùi hƣơng từ chất béo trong phô mai ( theo Mollimard và Spinner, 1996) - Trong các con đƣờng kể trên, phân giải lipid và biến đổi các acid béo là con đƣờng quan trọng tạo nên hƣơng vị phô mai. - Phân giải lipid, sự thủy phân acid béo tự do từ triglyceride, có thể xảy ra bởi 2 loại enzyme thủy phân khác nhau: esterase và lipase. 2 enzyme này xúc tác phản ứng giống nhau: thủy phân liên kết ester trong glyceride, tạo ta một acid béo, và một glycerol. - Thực tế, lipase là một sub-family của esterase. Sự khác nhau giữa 2 nhóm này dựa trên chiều dài acid béo đƣợc tách ra: esterase (carboxylesterases EC3.1.1.1) giải phóng acid béo có chiều dài không quá 10C, trong khi lipase (EC 3.1.1.3) giải phóng những chuỗi acid béo dài hơn. Công nghệ chế biến đồ uống&sữa 10 b. Lipase: Bảng 4: Các loại lipase phát triển mùi vị - Nguồn lipase bao gồm: Lipase sẵn có trong sữa, chế phẩm rennet, vi sinh vật. - Shahani (Shahani, K.M.1974. Lipases and esterases. trang 181 trong Enzymes in food processing. G.Reed,ed. Academic Press, NY) đã liệt kê một vài loại lipase phổ biến: lipase sữa, lipase tụy (pancreatic enzyme), lipase nguồn gốc thực vật (trong nhiều loại rau trái và loại hạt nhƣ lúa mì, yến mạch, mạch đen, cotton, đậu nành, …), lipase nguồn gốc vi sinh vật (bao gồm: nấm men Candida và Torulopsis; nấm mốc Rhizopus, Penicillium, Aspergillus, Geotrichum, Mucor; vi khuẩn Staphylococcus)  Lipase trong sữa: - Nguồn lipase trong sữa là lipoprotein lipase. - Sữa bò chứa 12mg lipase/ L. Tuy nhiên, hầu hết lipase trong sữa liên kết với các micelle casein và chất béo đƣơc màng lipoprotein bao bọc. Do cơ chất và enzyme tách rời nhau nên sự phân giải chất béo không xảy ra trừ khi màng lipoprotein bị phá vỡ.  Lipase từ rennet: - Chế phẩm rennet có chất lƣợng tốt thì không chứa hoạt tính thủy phân chất béo. Tuy nhiên, rennet dùng trong sản xuất các loại phô mai Ý (nhƣ Romano, Provolone) lại có chứa lipase, pregastric esterase (PGE). - PGE hay còn gọi lingual hay lipase ở miệng. Nó do các tuyến cơ sở của lƣỡi tạo nên. Khi đông vật nhai lại bú sẽ kích thích tiết ra PGE, PGE sẽ theo sữa vào dạ dày khế. - PGE đƣợc tinh chế một phần từ chế phẩm thƣơng mại và mô răng miệng của bê. - Tùy theo nguồn PGE (bê, cừu…) mà sản phẩm phô mai Ý sẽ khác nhau ( mặc dù ở mức độ không đáng kể). Hầu hết các nguồn lipase khác không thích hợp cho việc làm phô mai Ý bởi không tạo ra đƣợc nét đặc trƣng riêng. Nhƣng lipase từ nấm cũng có thể là nguồn thay thế ( theo Fox&Stepaniad, 1993). Công nghệ chế biến đồ uống&sữa 11 Hình 2: Sự giải phóng các acid béo trong phô mai Cheddar Bảng 5: Hàm lƣợng acid béo tự do khi ủ phô mai.  Lipase từ vi sinh vật: - Các nguồn lipase từ vi sinh vật: o Vi sinh vật có sẵn trong sữa, đặc biệt là vi khuẩn ƣa lạnh khi bảo quản lạnh sữa. m E q p a lm it a te / k g c h e e s e weeks Phô mai từ sữa siêu lọc Phô mai từ sữa Phô mai từ sữa tiệt trùng Công nghệ chế biến đồ uống&sữa 12 o Hệ vi khuẩn lactic o Hệ vi sinh trên bề mặt ở các loại phô mai. - Nguồn lipase thêm vào: phần lớn các chế phẩm lipase từ vi sinh vật ứng dụng trong sản xuất phô mai là từ M. miehei, A. niger, A. Oryzae và vài loài khác. Trong nhiều trƣờng hợp, các chế phẩm này đã thay thế thành công lipase từ động vật. - Lactococus và Lactobacillus có hoạt tính phân giải lipid thấp hơn các loài vi khuẩn khác (nhƣ Pseudomonas) và nấm mốc. - Lactococci và lactobacilli là nhân tố thủy phân lipid thích hợp trong phô mai Cheddar và các loại phô mai Hà Lan. 2) Phân giải protein (proteolysis): a. Protein và các hợp chất gây mùi vị (peptide và amino acid): - Phân hủy protein là yếu tố quan trọng trong quá trình hình thành hƣơng vị của phô mai. Bƣớc đầu tiên của sự thoái hóa là chuyển đổi protein ( chủ yếu là casein) thành peptit và các acid amin tự do. Các acid amin tự do có thể bị suy thoái thành vô số các sản phẩm phụ. Hình 3: Các hợp chất mùi vị sinh ra từ sự phân giải protein. DMS: dimethyl sulfide; DMDS, dimethyl disulfide; DMTS dimethyl trisulfide.(Kranenburg và cộng sự - 2002.) Công nghệ chế biến đồ uống&sữa 13 - Sự phân giải protein là quá trình phức tạp nhất trong 3 quá trình hóa sinh xảy ra trong quá trình làm chín phô mai. Nó chủ yếu đáp ứng cho sự thay đổi cấu trúc và tạo mùi vị chính cho phô mai. Tuy nhiên, một vài đoạn peptide ngắn có thể gây ra vị đắng ( vị không mong muốn xuất hiện trong phô mai). - Phân giải protein trong quá trình ủ đóng vai trò cốt yếu trong hầu hết các loại phô mai. Nó có thể xảy ra rất giới hạn (VD: phô mai Mozzarella) hoăc có phạm vi rộng lớn (VD: các loại phô mai xanh) và sản phẩm của quá trình này là gồm các polypeptide mạch rất lớn ( chỉ nhỏ hơn casein), các peptide mạch ngắn và các acid amin tự do. Các peptide mạch ngắn và các amino acid là thành phần tạo nên mùi vị phô mai. Sau đó, chúng đƣợc dị hóa thành một dãy các hợp chất thơm cũng là thành phần hình thành nên hƣơng vị phô mai (VD: amine, acid, carbonyls và các hợp chất chứa sulfur). Mặc dù sự dị hóa acid amin không phải là quá trình phân giải protein nhƣng nó phụ thuộc vào công thức của amino acid. Hình 4: Sự hình thành các hợp chất hƣơng vị từ quá trình thủy phân protein, theo McSweeney et al. (2000) - Bảng 6 tóm tắt các peptide có vị đắng phân lập từ nhiều loại phô mai khác nhau. Sullivan và Jago (1972) chỉ ra peptide có vị đắng nhất do từ 2 - 23 amino acid tạo nên và các peptide này có khối lƣợng phân tử từ 500 - 3000 Da ( theo Lee et al, 1996). Nếu các đoạn peptide có giá trị Q>5862 J/mol và khối lƣợng phân tử của chúng nhỏ hơn 600Da, chúng sẽ gây nên vị đắng. Một vài sản phẩm phô mai cần có vị đắng bởi vì đó là vị tự nhiên của sản phẩm nhƣng nếu quá đắng sẽ tạo ra sản phẩm không mong muốn. Công nghệ chế biến đồ uống&sữa 14 - Các tác giả: Aston & Creamer,1986; Cliffe Marks & Mulholland, 1993; Egels & Visser, 1994) cho rằng các peptide < 500 Da sẽ hình thành mùi vị đặc trƣng cho Cheddar phô mai. McGugan, Emmons & Lamond (1979) nói rõ rằng peptide cũng rất quan trọng bởi chúng có thể kết hợp xây dựng nên các hợp chất mùi vị. Vị đắng có thể đƣợc hạn chế bằng cách giảm hoặc điều khiển mức độ phân giải protein hay thêm vào peptidase. - Hợp chất tạo đắng phải ít nhất hòa tan một chút trong nƣớc (theo Lemieux và Simard,1992; McSweeney, 1997). Các peptide kị nƣớc trong phô mai đầy đủ chất béo hợp thành pha béo do đó sẽ giảm đƣợc độ đắng ( theo Fox et al.,1996). Thông thƣờng, vấn đề vị đắng trong phô mai có hàm lƣợng béo thấp sẽ phức tạp hơn trong phô mai đầy đủ béo do các peptide kị nƣớc trong pha béo sẽ giảm. Bảng 6:Các peptide có vị đắng trong phô mai Công nghệ chế biến đồ uống&sữa 15 b. Protease: - Các enzyme xuất hiện trong quá trình phân giải protein: o Enzyme đông tụ sữa ( chymosin) o Enzyme sẵn có trong sữa ( VD: plasmin) o Proteinase và peptidase từ vi khuẩn lactic o Enzyme của giống vi khuẩn thứ hai ( VD: Penicillium camemberti trong phô mai Camembert và Brie, P. roqueforti trong phô mai vân xanh) o Proteinase hoặc peptidase hoặc cả hai loại đƣợc bổ sung vào trong quá trình ủ - Sự phân giải protein làm mềm cấu trúc phô mai trong quá trình ủ thông qua sự thủy phân casein của khối đông và làm giảm hoạt độ của nƣớc trong khối đông ( theo McSweeney, 2004). Hình 5: Sự thủy phân casein thành amino acid.  Enzyme chymosin: - Enzyme chiết xuất từ ngăn thứ 4 của dạ dày bê bao gồm 2 loại: chymosin (chiếm 80 - 90 %) và pepsin chỉ khoảng (10 - 20 %). - Lƣợng chymosin còn lại trong khối đông dao động từ 0 - 15% hàm lƣợng chymosin ban đầu. Hoạt động của lƣợng chymosin còn lại này rất quan trọng cho sự khởi đầu quá trình phân giải casein khi ủ phô mai ( theo Fox et al., 1996). - Chymosin thủy phân κ-casein tại liên kết Phe105-Met106. Kết quả là phân đoạn caseinomacropeptide đƣợc tách khỏi phân tử κ-casein và mất theo whey. Phân đoạn paracasein còn gắn lại trên các gốc micelle và làm cho micelle dễ tập hợp lại với nhau chuẩn bị tạo khối đông. - Sự thủy phân αs1-, αs2-, và β-casein xảy ra khi ủ phô mai. Công nghệ chế biến đồ uống&sữa 16 - Hoạt động của chymosin lên β-casein chủ yếu là Leu192-Tyr193. Cƣờng độ thủy phân tăng lên khi có 5 - 10% NaCl (theo Awad et al. ,1998). Đoạn peptide β- caseinf193-209 rất đắng. - Đối với αs1-casein, chymosin xúc tác thủy phân liên kết Phe23-Phe24 (theo McSweeney, 2004) và Leu101-Lys102. - αs2-casein khó bị thủy phân bởi chymosin do có các vùng kị nƣớc.  Plasmin: - Plasmin ( EC.3.4.21.7) là protease có trong sữa, pHopt= 7.5 - 8.0, Topt= 37oC ( theo (Fox et al., 2000; Forde và Fitzgerald, 2000; Nielsen, 2002). Enzyme này là glycoprotein và gồm 2 monomer nối với nhau bằng cầu disulfide. - Plasmin xúc tác thủy phân hầu hết casein (trừ κ-casein, theo Sousa et al., 2001; McSweeney, 2004) đặc biệt là β-casein và αs2-casein. - Creamer (1975) cho rằng sự thủy phân β-casein chủ yếu là do plasmin ( ở các liên kết Lys28-Lys29, Lys105-His106, and Lys107-Glu108) tạo thành proteose peptone và γ- casein ( theo (Sousa et al., 2001).  Sự phân giải protein của vi khuẩn lactic: - Các enzyme phân giải protein của vi khuẩn lactic bao gồm: o protease ngoại bào cắt casein thành các oligopeptide o protease nội bào o peptidase nội bào thủy phân các oligopeptide thành amino acid. - Protease và peptidase của vi khuẩn lactic là các enzyme chính phân cắt peptide hình thành bởi chymosin và plasmin để hợp thành mùi vị phô mai. ( theo Fox etal.,1995; Mulholland, 1997; McSweeney, 2004). Hình 6: Hệ thống proteolysis của Lactococcus . (McSweeney, 2004) Công nghệ chế biến đồ uống&sữa 17 Bảng 7: Sản phẩm thủy phân của lactococcal proteinase với casein trong 1h IV. CÁC CHẾ PHẨM ENZYME THƢƠNG MẠI: 1. Lipase và esterase: - Phân giải lipid, sự thủy phân acid béo tự do từ triglyceride, có thể xảy ra bởi 2 loại enzyme thủy phân khác nhau: esterase và lipase.Hai enzyme này xúc tác phản ứng giống nhau: thủy phân liên kết ester trong glyceride, tạo ta một acid béo, và một glycerol. - Thực tế, lipase là một sub-family của esterase. Sự khác nhau giữa 2 nhóm này dựa trên chiều dài acid béo đƣợc tách ra: esterase (carboxylesterases EC 3.1.1.1) giải phóng acid béo có chiều dài không quá 10C, trong khi lipase (EC 3.1.1.3) giải phóng những chuỗi acid béo dài hơn. Bảng 8: Lipase sử dụng trong sản phẩm phô mai Phô mai Nguồn lipase Romano Domiati Feta Camembert Parmesan Provolone Fontina Ras Romi Roque fort Cheddar Manchego Blue Pregastric của cừu hay dê con Mucor miehei Penicillium camemberti Pregastric của cừu hay dê con Mucor miehei Penicillium roqueforti Aspergillus oryzae/A.niger Công nghệ chế biến đồ uống&sữa 18 - Hoạt tính của enzyme trên các cơ chất triglyceride khác nhau đƣợc dùng để so sánh các loại enzyme thủy phân lipid. - Lipase từ sữa có hoạt tính ở cơ chất tributyrin cao hơn với cơ chất triolein, trong khi đó lipase của Achromobacter lipolyticum lại cho thấy điều ngƣợc lại (Khan et al.). Lipase từ Penicillium roqueforti có mức độ thủy phân theo hƣớng giảm dần các cơ chất: tributirin, tricaproin, tricaprylin, tripropionin. Khác với nó, lipase từ Aspergillus niger lại thủy phân tricaprylin tốt hơn 3 cơ chất kia (Shipe). Tƣơng tự, lipase từ P.roqueforti cũng có mức thủy phân giảm dần các cơ chất: tributirin, tricaproin, tricaprylin, tripropionin, triolein. Theo Morris và Jezeski, lipase từ P.roqueforti hoạt tính trên chất béo từ sữa chỉ bằng 1/3 so với cơ chất là tributyrin, và hoạt tính của nó giảm khi phân tử lƣợng của các acid béo tăng lên. Pregastric esterase thì đặc trƣng với những glyceride chứa những chuỗi acid béo ngắn. - Một kiểu đặc trƣng cơ chất nữa là hoạt độ khác nhau của enzyme loại này trên cơ chất triglyceride và mono-, diglyceride. Bảng 9: Hoạt độ của vài loại enzyme trên cơ chất mono- và diglyceride so sánh với tributyrin (10% nhũ tƣơng) theo Richardson và Nelson enzyme tributyrin dibutyrin 1-monobutyrin pregastric esterase 1,00 0,04 0 lipase tụy 1,00 0,74 0,95 lipase từ nấm 1,00 0,26 0,15 lipase từ sữa 1,00 0,35 0,12 - Dạng vật lý của cơ chất cũng ảnh hƣởng đến hoạt độ của enzyme. Richardson và Nelson đã so sánh hoạt độ của 4 loại enzyme phân giải lipid trên chất nền triacetin dạng hòa tan và nhũ tƣơng, kết quả theo bảng10: Bảng10: Hoạt độ của vài loại enzyme khác nhau trên triacetin dạng hòa tan (5%) và nhũ tƣơng (15%) tại pH = 6,2 hoạt độ (units/min) enzyme hòa tan (s) nhũ tƣơng (e) e/s pregastric esterase 2,8 2 0,71 lipase tụy 2,6 5,8 2,2 lipase từ nấm 2 4,4 22 lipase từ sữa 4,6 2,2 0,48 - Mức độ giải phóng các loại acid béo của các enzyme từ nguồn khác nhau cũng khác nhau. Một số enzyme phân giải ra các acid béo với tỉ lệ tƣơng đƣơng nhƣ chúng tồn tại trong nguồn chất béo ban đầu; một số loại khác thì ƣu tiên giải phóng một loại acid béo đặc trƣng nào đó. Công nghệ chế biến đồ uống&sữa 19 Bảng 11: thành phần acid béo tự do đƣợc giải phóng từ chất béo sữa bằng vài loại enzyme (mol%) (Nelson) acid béo C - lipase sữa steapsin lipase tụy esterase bê chế phẩm esterase- pancreatin 4:00 13,9 10,7 14,4 35 15,85 6:00 2,1 2,9 2,1 2,5 3,6 8:00 1,8 1,5 1,4 1,3 3 10:00 3 3,7 3,3 3,1 5,5 12:00 2,7 4 3,8 5,1 4,4 14:00 7,7 10,7 10,1 13,2 8,5 16:00 21,6 21,6 24 15,9 19,3 18:1 và :2 29,2 24,3 25,5 14,2 21,1 18:00 10,5 13,4 9,7 3,2 10,1 Bảng 12: Sự giải phóng acid béo tự do từ chất béo sữa của 6 chế phẩm enzyme (3h, 35C) - Từ dữ liệu trên, ta thấy lipase tụy có xu hƣớng thủy phân acid béo phân tử lƣợng cao, trong khi lipase từ chủng Aspergillus thủy phân chủ yếu những acid béo mạch ngắn. - Achromobacter lipolyticum lipase giải phóng có chọn lựa một lƣợng lớn không cân đối acid béo C18 chƣa bão hòa từ chất béo sữa (Khan et al.). - Trong một hỗn hợp đẳng mol gồm tributyrin và tricaprylin, lipase từ Penicillium roqueforti và Aspergillus niger đều giải phóng ra acid butyric và caprylic, nhƣng với Penicillium roqueforti lipase, tỉ lệ là 3:1, trong khi với Aspergillus niger tỉ lệ lại là 1:4. (Shipe) - Những giống Candida lipolytica thủy phân acid butyric và caproic từ chất béo từ sữa; trong khi đó acid butyric, caproic và caprylic đƣợc tạo ra bởi những giống P.roqueforti và A.lipolyticum. Penicillium camembert lipase cũng giải phóng butyric và một vài acid béo dễ bay hơi khác. % tổng acid béo tự do (micro đƣơng lƣợng) butyric caproic caprylic capric lauric và cao hơn 1. hỗn hợp rennet thô từ dê con 32,8 11,3 7,1 11,8 33,6 2. hỗn hợp rennet đã tinh sạch từ bê 10,7 3,1 86,5 3. oral lipase từ bê 36,7 8,9 4,8 10,7 39 4. lipase tụy 8,4 2,1 89,1 5. Aspergillus lipase 43,1 18,9 20,2 17,5 6. lipase sữa 13,5 8,2 10,2 8,7 60 Công nghệ chế biến đồ uống&sữa 20 - Từ đó ta thấy có sự giải phóng ƣu tiên dành cho butyrate khi hỗn hợp các trigliceride đƣợc thủy phân. - Theo Larwrence, đặc tính của vài loại lipase có nguồn gốc vi sinh phụ thuộc vị trí của acid béo trong triglyceride, chính bản thân acid béo và mức độ chƣa bão hòa của nó. Sự gia tăng hoạt tính enzyme phụ thuộc vào nồng độ của ammonium sulphate đƣợc sử dụng trong quá trình tinh sạch enzyme. Hoạt tính enzyme còn phụ thuộc vào pH. Những enzyme ngoại bào có nguồn gốc A. niger, Chromobacterium viscosum và loài Rhizophus thƣờng hoạt động ở vùng pH acid. Cofactor không cần thiết trong biểu lộ hoạt tính enzyme nhƣng vài cation hóa trị 2, nhƣ calcium, lại tăng cƣờng hoạt tính. Hoạt tính của lipase bị ức chế mạnh bởi Co2+, Ni2+, Hg2+ and Sn2+, và bị ức chế nhẹ bởi Zn2+, Mg2+, EDTA và SDS. - Với sự phát triển của kĩ thuật mới, nhiều chế phẩm lipase có nguồn gốc từ vi sinh vật đã đƣợc tạo ra, thay thế cho lipase từ nguồn động vật đang suy giảm, đáp ứng nhu cầu thực tế. o Lipase từ Aspergillus sp.: enzyme hoạt động tốt nhất ở pH = 5,6 và t = 25oC. Hai isozyme đƣợc tách từ A.niger có những tính chất nhƣ bảng 13: Bảng 13:Tính chất của hai lipase (là các isoenzyme) do Aspergillus niger sản xuất Tính chất Lipase I Lipase II Khối lƣợng phân tử (Da) pI pH tối ƣu Đặc điểm cơ chất Hg 2+ Iodoacetamide 31000 4.0 5 - 6 Acid béo mạch dài Không ảnh hƣởng Ức chế 19000 3.5 5 - 6 Acid béo mạch ngắn Khử hoạt tính Không ảnh hƣởng Công nghệ chế biến đồ uống&sữa 21 Hình 7: Ảnh hƣởng của pH lên hoạt tính của lipase từ A.niger và R.delemar Hình 8: Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt tính của lipase từ A.niger (lipase AP[AM]) và Humicola lanuginosa[NO] Công nghệ chế biến đồ uống&sữa 22 - Lipase từ Mucor.sp: Mucor Miehei sản xuất ra lipase có pH tối ƣu trong khoảng 7 đến 8,2. Nhiệt độ tối ƣu là 40oC.  Một vài chế phẩm lipase thƣơng mại: - CheeseMax ®-K o CheeseMax ®-K là lipase vi sinh vật từ Rhizopus oryzae o Hình thành các acid béo tƣơng tự nhƣ pregastric esterase, dùng thay thế cho pregastric esterase. o Dùng đƣợc cho thực phẩm chay. o pHotp=6.0 o totp= 45oC Hình 9: Biểu đồ so sánh hàm lƣợng acid béo tự do tạo thành khi sử dụng pregastric esterase và chế phẩm CheeseMax. - Enzeco® esterase / lipase: o Có nguồn gốc từ Mucor miehei, hoạt động chủ yếu là của esterase. o Thủy phân triglyceride tạo ra nhiều các acid béo mạch ngắn. 2. Protease: a. Rennet: - Theo Martin et al. (1981), có nhiều loại chế phẩm rennet dùng trong sản xuất phô mai. Một vài hỗn hợp chymosin tinh khiết với pepsin có nguồn gốc từ bò và rennet có nguồn gốc từ vi sinh vật đƣợc sử dụng bởi khả năng chịu nhiệt hơn chymosin có nguồn gốc từ động vật. Công nghệ chế biến đồ uống&sữa 23 Hình 10: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính một vài chế phẩm rennet khi so sánh với rennet chiết xuất từ dạ dày bê. - Dạ dày bê là nguồn chymosin truyền thống nhƣng hiện nay nó ít đƣợc dùng và chymosin có nguồn gốc từ vi sinh vật cũng bị hạn chế sử dụng, bởi những loại này thƣờng tạo ra mùi vị bất lợi. Nhiều loại enzyme tái tổ hợp có mặt trên thị trƣờng với nhiều tên gọi khác nhau nhƣ Maxiren [GB], Chymogen [CH], CHY-Max [PF], Gist- Brocades [GB], Genencor [GR], Novo Nordisk [NO] và Pfizer [PF] là những sản phẩm hàng đầu trong lĩnh vực này. - Rennet từ nấm: Enzyme đƣợc sản xuất từ Mucor miehei, Mucor pusillus và Cryphonectria ( Endothia) parasitica. Rennilase®, Fromase®, Novren®, Marzyme®, Hannilase® và Suparen® là các chế phẩm enyme từ nấm đƣợc sử dụng rộng rãi để sản xuất các loại phô mai khác nhau. Quá trình phân giải protein của enzyme đông tụ từ nấm có phần khác biệt so với chymosin từ dạ dày bê, kết quả là hình thành nên vài đoạn peptide gây vị đắng cho quá trình ủ chín phô mai ( theo Harboe và Budtz, 1999).  Mucorpepsin: - M.pusillus và M.miehei là hai loài sản xuất ra protease có hoạt tính đông tụ sữa cao do hoạt tính phân cắt κ-casein có chọn lọc của chúng cùng với hoạt tính phân giải chậm protein ( Harboe và Budtz, 1999; Awad et al.,1999). Các enzyme này có khả năng chịu nhiệt cao nên chúng hạn chế đƣợc sử dụng nhƣ là tác nhân đông tụ sữa. Lý do là vì khả năng chịu nhiệt độ cao làm cho enzyme vẫn còn hoạt tính sau quá trình nấu khối đông, gây nên các vị lạ cho phô mai trong giai đoạn ủ ( Yamashita et al., 1994). Công nghệ chế biến đồ uống&sữa 24 - Ngƣời ta sử dụng cả hai loài M.miehei và A.oryzae để sản xuất rennet cho sản phẩm phô mai ( Budtz và Heldt-Hansen,1998; Harboe và Kristensen,2000). Khi các chế phẩm này đƣợc xử lý tách các gốc đƣờng bằng endo-β-N-acetylglucosaminidase H thì hoạt tính đông tụ tăng lên đáng kể ( Harboe và Kristensen, 2000). - Hai biện pháp để giảm khả năng chịu nhiệt của rennet từ nấm ( Branner - Jorgensen, 1981; Branner-Jogensen et al.,1982): o Xử lý trong dung dịch chứa các tác nhân oxi hóa gồm dung dich chlorine o Acyl hóa với các dẫn xuất của carboxylic acid Lƣợng rennet sử dụng phụ thuộc vào loại phô mai và thời gian tạo khối đông mong muốn. VD: Liều lƣợng sử dụng rennet trong sản xuất phô mai Cheddar là 150ml/1000 lit sữa ở 31 o C. - Nhƣ mong đợi, rennet từ M.miehei hầu nhƣ giống hệt với rennet từ M.pusillus ( theo Tonouchi et al.,1986; Yang et al.,1997).  Endothiapepsin: - C.parasitica gây bệnh tàn lụi cho hạt dẻ có khả năng tổng hợp một loại protease, endothiapepsin, với tính chất đông tụ sữa nhƣ rennet ở dạ dày bê ( Awad et al., 1999). Do tính chịu nhiệ