Đề tài Sản xuất chế phẩm enzym amylase từ môi trường lỏng

ính là màu ta thường thấy ở mốc tương. Nấm sợi thường có màu vàng khi già nên còn được gọi là nấm sợi màu vàng. Khi mới phá triển, hệ sợi có màu trắng, sau đó chuyển dần sang màu lục và khi già thì chuyển hẳn sang màu vàng. Nấm mốc Aspergillus oryzae có khả năng sinh tổng hợp enzyme rất mạnh, trong đó có enzyme amylae. 4.2 Nhân giống vi sinh vật Giống sản xuất thường được bảo quản để tránh giảm hoạt tính. Do đó, việc cấy giống trên môi trường thạch nghiêng trước khi nhân giống là việc làm rất cần thiết. Có thể coi đây là việc “đánh thức” chủng giống, đồng thời để kiểm tra hoạt tính của giống sau một thời gian bảo quản ở nhiệt độ thấp. Từ những những tế bào hoặc bào tử riêng rẽ của chủng bảo quản, cấy ra một số canh trường, những canh trường này được nhân giống trong phòng thí nghiệm và được kiểm tra hoạt tính. Nếu có sự khác nhau thì dùng canh trường có hoạt tính mạnh nhất để gây nguyên liệu cấy và tạo thành chủng mới. 4.2.1 Môi trường nhân giống o 3% saccharose o 0.3% NaNO3 o 0.1% KH2PO4 o 0.05% MgSO4.7H2O o 0.05% KCl o 0.001% FeSO4 o 10 – 20mL dịch tự phân nấm men o 1000mL nước cất o 0.3% agar 4.2.2 Phương pháp và điều kiện nhân giống Nhân giống trên môi trường rắn xốp (thường áp dụng đối với nấm sợi như Aspergillus oryzae, với mục đích thu nhận bào tử) với các thông số kỹ thuật sau: - Độ ẩm của môi trường : 45 – 50%. - Nhiệt độ : 27 – 300C. - Thời gian : 30 – 36 giờ. - Độ ẩm của không khí : 85 – 95%. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 17 Aspergillus oryzae là vi sinh vật hiếu khí, chỉ phát triển bình thường khi đầy đủ oxy. Để đáp ứng điều kiện nuôi này, môi trường nuôi phải xốp, rải thành lớp không dày quá 2.5 – 3cm. Theo thực nghiệm, để thỏa mãn cho sự hô hấp của Aspergillus oryzae trong toàn bộ chu kỳ phát triển, cứ 1kg môi trường cần khoảng 1.7m3 không khí. Aspergillus oryzae phát triển bình thường khi nồng độ CO2 trong khí quyển lên tới 8%. Đôi khi khả năng sinh bào tử của nấm mốc bị yếu hoặc mất hẳn. Để khôi phục khả năng này, có thể nuôi nấm mốc trong ánh sáng khuếch tán trong một vài thế hệ. Trong sản xuất công nghiệp hiện nay, quá trình nhân giống vi sinh vật thường được thực hiện bằng phương pháp nuôi cấy tĩnh (nuôi cấy theo từng mẻ - batch culture). 4.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống  Nhiệt độ: Nếu tiến hành nhân giống vi sinh vật ở nhiệt độ thấp hoặc cao hơn khoảng nhiệt độ tối ưu (topt = 27 – 30 0 C) thì vi sinh vật sinh trưởng chậm hơn và hằng số tốc độ sinh trưởng của giống (µexpo) sẽ giảm xuống.  Oxy: Đối với nhóm vi sinh vật hiếu khí bắt buộc như Aspergillus oryzae, việc cung cấp oxy cho môi trường là rất cần thiết để giúp vi sinh vật tổng hợp năng lượng, duy trì các hoạt động trao đổi chất và tổng hợp sinh khối. Cụ thể: cứ 1kg môi trường cần khoảng 1.7m 3 không khí.  Sự khuấy trộn: Đối với nấm mốc sử dụng trong chế biến thực phẩm, giống thường được sử dụng dưới dạng bào tử. Khi đó, người ta thường nhân giống trên môi trường rắn xốp. Nếu sử dụng thiết bị nhân giống dạng khay – hình hộp chữ nhật (cuvet), sự đảo trộn môi trường sẽ khó thực hiện hoặc không đạt hiệu quả cao. Trong trường hợp này, sử dụng thiết bị nhân giống dạng hình trụ ngang và có thể quay quanh trục của nó, quá trình đảo trộn môi trường có thể thực hiện một cách tự động và canh trường nuôi đạt được độ đồng nhất cao hơn.  Thời gian: Theo lý thuyết, vào thời điểm đầu của giai đoạn ổn định, số lượng tế bào thu được trong canh trường là cao nhất và chúng có hoạt tính sinh lý ổn định. Do đó, ta kết thúc quá trình nhân giống để thu nhận sinh khối vào thời điểm này để đạt được hiệu quả kỹ thuật và kinh tế cao nhất. Thông thường thời gian nhân giống từ 30 – 36 giờ. 4.2.4 Thiết bị nhân giống  Nhân giống giai đoạn phòng thí nghiệm: Sau khi chuẩn bị môi trường, tiến hành tiệt trùng môi trường ở 1210C trong 40 phút. Môi trường sau khi tiệt trùng được lắc đều nhằm làm cho môi trường được tơi xốp và làm nguội đến nhiệt độ phòng. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 18 Hình 4.2.4.1: Máy lắc ổn nhiệt (Personal – 11 , TAITEC) Giống được nuôi trên môi trường thạch nghiêng, và giữ ở nhiệt độ phòng.  Nhân giống giai đoạn phân xưởng: Nếu sử dụng thiết bị nhân giống dạng khay – hình hộp chữ nhật (cuvet), sự đảo trộn môi trường sẽ khó thực hiện hoặc không đạt hiệu quả cao. Trong trường hợp sử dụng thiết bị nhân giống dạng hình trụ ngang và có thể quay quanh trục của nó, quá trình đảo trộn môi trường có thể thực hiện một cách tự động và canh trường nuôi đạt được độ đồng nhất cao hơn. 4.3 Chuẩn bị môi trường lên men Để nuôi Aspergillus oryzae 3 – 9 – 15 với mục đích thu – amylase, Fenikxova và Dvatxatova (1959, 1960) chọn môi trường có 65% bột ngô; 0.9% NaNO3; 0.005% MgSO4 và 10% nước chiết mầm mạch (100g/1 lít nước), pH môi trường 6 – 7.  Nguồn glucid:  Ngoài bột ngô, môi trường cần chứa maltose và dextrin.  Các loại đường: Sự có mặt của glucose, fructose và saccharose có tác dụng giúp cho sự phát triển của nấm mốc, nhưng lại hạn chế sự tích tụ amylase. Ngược lại, khi thêm lactose và MgO vào môi trường thì nấm mốc kém phát triển hơn nhưng lại tích tụ nhiều amylase.  Nguồn carbon được vi sinh vật sử dụng để đáp ứng các nhu cầu sinh sản và phát triển: - Cung cấp năng lượng cho vi sinh vật. - Cung cấp các tiền chất cho vi sinh vật. - Tạo các quá trình oxy hóa nhờ vi sinh vật. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 19  Các yếu tố khác: Sự tạo thành và tích tụ amylase còn gắn với sự có mặt của các ion Mg2+, Ca2+, và sự có mặt của các nguyên tố phosphor, đặc biệt là magie. - Trong môi trường thiếu MgSO4, amylase hầu như không được tạo thành, hàm lượng MgSO4 cần thiết chỉ vào khoảng 0.005%. Sau magie là phosphor, nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong việc tạo thành acid nucleic. Hàm lượng của muối KH2PO4 vào khoảng 0.1 – 0.2%. - Calci có trong thành phần của α – amylase. Mỗi phân tử α – amylase có 2 hoặc 3 ion calci, mà tính chịu nhiệt của enzyme này lại phụ thuộc vào số ion calci có trong phân tử. - Lưu huỳnh cũng đóng vai trò quan trọng không kém. Hoạt độ amylase gắn liền với sự có mặt của nhóm – SH; mặt khác còn tham gia vào thành phần của acid amin cấu thành enzyme. Hàm lượng lưu huỳnh trong canh trường chứa 0.04g/100ml bảo đảm cho hoạt độ amylase cực đại và bằng 360 đơn vị/100ml. Nếu giảm tới 0.004%, hoạt độ amylase của Aspergillus oryzae 3 – 9 – 45 chỉ còn 50% và bằng 180 đơn vị/100ml. - Các nguyên tố vi lượng như đồng, thiếc molipden, borac, mangan, sắt, coban,… làm tăng hoạt độ của nhiều enzyme. 4.4 Tiệt trùng môi trường 4.4.1 Mục đích Bảo quản: vô hoạt enzyme, ức chế vi sinh vật. 4.4.2 Những biến đổi trong quá trình tiệt trùng  Biến đổi vật lý: Sự thay đổi về thể tích, khối lượng, tỉ trọng (nước bốc hơi), … Độ nhớt của dung dịch giảm.  Biến đổi hóa học: Thay đổi tốc độ các phản ứng hóa học (sự oxy hóa vitamin C, các chất màu).  Biến đổi hóa lý: Độ hòa tan tăng, sự bốc hơi nước.  Biến đổi hóa sinh: Enzym bị vô hoạt.  Biến đổi sinh học: Ức chế, tiêu diệt vi sinh vật.  Biến đổi về mặt cảm quan: Sự tổn thất của một số cấu tử mẫn cảm với nhiệt (vitamin, …). 4.4.3 Thiết bị  Dùng thiết bị trao đổi nhiệt dạng bản mỏng. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 20  Thông số công nghệ:  : 1210C.  : 20 – . 4.5 Lên men sinh tổng hợp enzyme Sử dụng phương pháp lên men bề sâu. 1. Thùng trộn môi trường dinh dưỡng. 7. Thùng dịch lên men. 2. Nồi tiệt trùng. 8. Thùng lên men. 3. Thùng chứa. 9. Lọc khí sơ bộ. 4. Van xả. 10. Nén khí. 5. Thiết bị trao đổi nhiệt. 11. Lọc khí bước hai. 6. Bơm ly tâm. 12. Thùng canh trường thành phẩm. Hình 4.5.1: Sơ đồ nuôi cấy vi sinh vật bằng phương pháp bề sâu 4.5.1 Mục đích Khai thác: tạo điều kiện cho mốc phát triển đều trên môi trường nuôi cấy để hình thành hệ enzyme amylase. 4.5.2 Các biến đổi xảy ra trong quá trình lên men  Biến đổi vật lý: sự tăng nhiệt độ do quá trình hô hấp của nấm mốc.  Biến đổi hóa sinh: sự tổng hợp enzyme amylase.  Biến đổi sinh học: sự gia tăng sinh khối. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 21 4.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men  Môi trường lên men:  Hàm lượng chất khô: Các chất hòa tan trong môi trường sẽ tạo nên một áp lực thẩm thấu. Hàm lượng các chất hòa tan trong môi trường càng lớn thì giá trị áp lực thẩm thấu càng cao. Khi hàm lượng các chất hòa tan trong môi trường quá cao, màng tế bào chất không thể duy trì sự cân bằng áp lực thẩm thấu được nữa, do đó phải xác định hàm lượng chất khô tối ưu cho môi trường trước khi lên men.  pH môi trường: pH có ảnh hưởng nhiều đến tích tụ enzyme nên trong thực tế sản xuất, người ta thường sử dụng acid hoặc ammoniac để điều chỉnh cho pH luôn trong khoảng tối ưu: - Nếu như thêm vào môi trường các muối ammonium, thì khi vi sinh vật tiêu thụ ion ammonium, các ion được giải phóng ra sẽ acid hóa môi trường. Vì thế, cần phải cho thêm CaCO3 vào để trung hòa môi trường hoặc duy trì tự động giá trị pH thích hợp cho việc tổng hợp các enzyme amylase. - Khi nguồn nitơ vô cơ được dùng là các muối nitrate, thì trong quá trình vi sinh vật tiêu thụ anion (NO3 - ) sẽ giải phóng ra các ion kim loại và môi trường bị kiềm hóa làm pH tăng lên. Khi dùng các muối ammonium phosphate làm nguồn nitơ để nuôi chủng mốc này thì pH tối thích của môi trường phải nằm trong vùng 6- 7.  Điều kiện lên men:  Lượng giống cấy: Nếu lượng giống cấy quá ít, thời gian lên men kéo dài. Các vi sinh vật tạp nhiễm trong môi trường lên men dễ phát triển và có thể gây hư hỏng sản phẩm. Nếu lượng giống cấy quá nhiều, thời gian lên men có thể rút ngắn, nhưng hàm lượng các sản phẩm phụ tạo thành sẽ thay đổi và gây ảnh hưởng đến chất lượng thành phẩm, hơn nữa, việc tăng lượng giống cấy sẽ làm tăng chi phí cho quá trình nhân giống trong sản xuất. Tỉ lệ giống cấy: 2 – 5%.  Nhiệt độ: Khi nhiệt độ thấp, quá trình lên men kéo dài. Khi nhiệt độ quá cao, hoạt tính trao đổi chất của vi sinh vật bị giảm và các cấu tử mẫn cảm với nhiệt bị tổn thất. Trong quá trình lên men, một phần năng lượng do vi sinh vật chuyển hóa sẽ được thải vào môi trường dưới dạng nhiệt năng, dẫn đến làm tăng nhiệt độ dịch lên men, do đó ở quy mô công nghiệp, thiết bị lên men có bộ phận hiệu chỉnh nhiệt độ để ổn định hoạt tính cho giống trong suốt quá trình lên men. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 22  Thời gian lên men: Trong sản xuất, xác định thời điểm kết thúc quá trình lên men thông qua việc lấy mẫu đánh giá kiểm tra một số chỉ tiêu hóa lý, vi sinh và cảm quan (thường 2 – 4 ngày).  Cung cấp oxy: Trong môi trường lỏng, tế bào vi sinh vật phân tán trong dịch thể, sự tiếp xúc của tế bào với oxy phải thông qua môi trường nuôi cấy. Do đó, khuấy và sục khí là biện pháp tốt để oxy của không khí có thể hòa tan vào canh trường. Lượng oxy hòa tan vào môi trường phải đủ để bù đắp cho sự phát triển của vi sinh vật, đồng thời phải dư ra từ 1 – 3mg/L. Mức độ hòa tan của oxy phụ thuộc vào các yếu tố: nhiệt độ, nồng độ chất và phương pháp sục khí, trong đó nhiệt độ cao thì oxy hòa tan kém, còn nồng độ chất tỷ lệ nghịch với khả năng hòa tan của oxy. Một số chất khi hòa tan vào môi trường sẽ ảnh hưởng xấu đến khả năng hòa tan của oxy, ví dụ như trong dung dịch có nồng độ chất khô là 13%, độ hòa tan oxy sẽ giảm 85%, và nếu chỉ bỏ 2% bột giấy hoặc xác tế bào chết vào dung dịch thì độ hòa tan của oxy sẽ giảm đến 85 – 90%. Ngược lại, có một số chất khi hòa tan vào dung dịch lại làm tăng độ hòa tan của oxy, đó là các ester, rượu, acid hữu cơ và các hợp chất háo nước khác. Khi nuôi cấy nấm mốc để thu nhận enzyme, lượng không khí cần sục vào 1m3 môi trường vào khoảng 30 – 40m3/m3×giờ. Với sự phát triển của kỹ thuật sục khí, tiêu hao không khí cho 1m 3 môi trường×giờ sẽ giảm dần. Chiều hướng phát triển hiện nay không phải là giảm lượng không khí cho 1m3 môi trường mà người ta tăng nồng độ chất dinh dưỡng tương đương với lượng oxy hòa tan để đạt sinh khối cao và do đó tăng năng suất của thiết bị. 4.5.4 Thiết bị Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 23 Hình 4.5.2: Thùng lên men  Cấu tạo thiết bị: Thiết bị có dạng hình trụ đứng, được chế tạo từ vật liệu thép không rỉ. Bên trong thiết bị có hệ thống cánh khuấy và các đầu dò nhiệt độ, pH, … để theo dõi trực tiếp các thông số công nghệ trong quá trình lên men. Hệ thống sục khí được bố trí trên đáy thiết bị để cung cấp lượng oxy cần thiết cho vi sinh vật hiếu khí. Xung quanh thiết bị là lớp vỏ áo cho tác nhân điều nhiệt để ổn định nhiệt độ canh trường trong quá trình lên men. Phần trên nắp thiết bị có các cửa với nhiều chức năng khác nhau: cửa thông cánh khuấy gắn với motor, cửa nạp giống, cửa vào và ra cho không khí, cửa nạp chất phá bọt, cửa nạp chất điều chỉnh pH, … Cửa nạp môi trường và tháo canh trường ra khỏi thiết bị thường được bố trí ở phần đáy. Thiết bị được thiết kế ở dạng vô trùng: kín và có thể chịu được áp lực cao, có thể dùng hơi vô trùng trực tiếp và vệ sinh thiết bị.  Thông số công nghệ:  Nhiệt độ: 28 – 320C.  Không khí cần sục vào môi trường: 30 – 40m3/m3×giờ. ] Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 24 4.6 Ly tâm thu nhận chế phẩm enzyme thô  Mục đích  Khai thác: Tách sinh khối ra khỏi canh trường sau lên men.  Những biến đổi trong quá trình ly tâm  Biến đổi hóa học: tăng độ tinh sạch của sản phẩm  Biến đổi vật lý: khối lượng giảm.  Biến đổi hóa lý: tách pha .  Thiết bị:  Cấu tạo thiết bị Hình 4.6.1: Thiết bị lọc ly tâm nằm ngang Thiết bị lọc ly tâm Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 25 - Tốc độ 4500 – 6000 vòng/phút. - Đường kính đĩa ly tâm 200mm, chiều dài 1m. - Công suất động cơ đạt 5.5kW, khối lượng 600kg.  Ưu điểm - Năng suất lớn, kích thước nhỏ. - Thời gian nhanh. - Khả năng tách tốt, độ đồng đều cao. - Khả năng cơ giới hóa cao.  Nhược điểm Kết cấu thiết bị phức tạp.  - : 15 – 200C. - – . 4.7 Tách và tinh sạch enzyme 4.7.1 Siêu lọc  Mục đích Khai thác: làm giảm hàm lượng các chất có phân tử lượng nhỏ ra khỏi dung dịch enzyme thô.  Những biến đổi trong quá trình siêu lọc  Biến đổi vật lý: Khối lượng riêng hỗn hợp giảm.  Biến đổi hóa học: Hàm lượng enzyme tăng.  Thiết bị: thiết bị UF Phương pháp siêu lọc dùng để tách các chất có phân tử lượng khác nhau. Các chất có phân tử lượng nhỏ như đường, muối, nước… sẽ chui qua màng, enzyme và protein phi enzyme được giữ lại trên màng.  Cấu tạo thiết bị Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 26 Hình 4.7.1.1: Thiết bị lọc UF Thiết bị membrane có dạng hình trụ, bên trong chứa nhiều ống trụ nhỏ đặt song song với nhau. Mỗi ống trụ nhỏ thường được chế tạo bằng thép không rỉ, có đường kính dao động từ 12.5 – 75mm, chiều dài khoảng 0.6 – 6.4m và được đục các lỗ nhỏ trên than. Các membrane cũng có dạng hình trụ được lồng ép sát thành trong của các ống trụ nhỏ trên.  Nguyên lý hoạt động Nguyên liệu sẽ được bơm vào từ một đầu của thiết bị và được phân phối vào bên trong các ống trụ nhỏ. Dòng ra retentate sẽ tiếp tục đi hết theo chiều dài các ống trụ nhỏ Hình 4.7.1.2: Module phân riêng với membrane ceramic Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 27 và thoát ra bên ngoài các ống trụ nhỏ, sau đó được tập trung theo cửa ra chung nằm phía trên thân của thiết bị. Bên trong thiết bị membrane có thể được chia thành nhiều khoang, mỗi khoang gồm một số ống trụ nhỏ song song nằm cạnh nhau. Đầu tiên nguyên liệu sẽ được bơm vào một khoang trong thiết bị. Dòng retentate thoát ra khỏi khoang này và đi tiếp vào khoang thứ hai, còn dòng retentate thoát ra từ khoang thứ hai sẽ đi tiếp vào khoang thứ ba, … Như vậy, dòng retentate thoát ra từ khoang cuối cùng sẽ có nồng độ đạt giá trị yêu cầu.  Ưu điểm - Dễ tạo ra dòng chảy rối trong quá trình vận hành. - Đơn giản khi vệ sinh, thay thế membrane sử dụng và bảo trì thiết bị. - Màng membrane từ vật liệu ceramic có rất nhiều ưu điểm: trơ với các hóa chất như acid, kiềm, chlorine, …, khoảng nhiệt độ và pH hoạt động rất rộng (Tmax ≤ 350 0 C, pH = 0.5 – 13), do đó có thể sử dụng hơi để vô trùng thiết bị.  Nhược điểm - Thiết bị cồng kềnh, chiếm nhiều không gian nhà xưởng. - Tốn nhiều năng lượng sử dụng do có sự tụt áp của dòng nguyên liệu trong các ống hình trụ nhỏ. - Membrane từ vật liệu ceramic dễ vỡ bởi những va chạm cơ học, giá thành cao và đường kính lỗ mao dẫn các membrane ceramic hiện nay không thể nhỏ hơn 10-2µm.  - Áp lực thẩm thấu: 6.9 bar. - . - Đường kính mao quản trung bình từ 2 đến 50nm. - Để tinh sạch canh trường nuôi cấy thu nhận loại enzyme này thì cần vật liệu có kích thước nhỏ hơn kích thước của enzyme amylase (38kDa). 4.7.2 Tinh sạch enzyme bằng phương pháp lọc gel  Mục đích: tách các protein ra khỏi nhau để thu được enzyme tinh khiết.  Nguyên tắc  Phương pháp này được ứng dụng để tách hỗn hợp các chất dựa vào sự khác nhau về kích thước, hình dạng, cấu trúc không gian, phân tử lượng.  Quá trình triển khai sắc ký được thực hiện thông qua sự tương tác của 2 pha: - Pha tĩnh là các hạt gel có cấu trúc mở, chứa liên kết ngang tạo thành mạng lưới không gian ba chiều được nhồi cố định trong cột. Bên trong và bên ngoài hạt gel có các mao quản kích thước nhỏ. Cả cột gel được giữ cân bằng cách rửa qua dung dịch đệm. - Pha động là hỗn hợp gồm dịch enzyme và các tạp chất hòa tan khác có kích thước phân tử khác nhau được pha trong dung dịch đệm. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 28 Dung dịch mẫu chứa enzyme và các cấu tử hòa tan (pha động) có kích thước khác nhau được chạy qua cột. Những phân tử có kích thước lớn hơn kích thước lỗ mao quản của gel thì không thể đi vào bên trong hạt gel, vì thế chúng di chuyển trong khoảng không gian giữa các hạt. Những phân tử có kích thước nhỏ hơn thì có khả năng khuếch tán vào bên trong các hạt gel.  Một số điều kiện khi tiến hành lọc gel Để tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký lọc gel, ta cần phải loại được các protein tạp ra khỏi hỗn hợp.  Lựa chọn kích thước cột gel: Để tinh sạch enzyme, người ta sử dụng những loại cột dài hơn 100 cm, tỷ lệ chiều dài và đường kính cột vào khoảng 2.5 – 10.0.  Lựa chọn loại gel: Sephadex được sử dụng phổ biến nhất đối với quá trình chiết tách mà ở đó tốc độ chảy không phải là yếu tố quan trọng.  Lựa chọn kích thước hạt gel: Thông thường, trong sắc ký lọc gel dùng để tinh sạch protein – enzyme, người ta thường chọn hạt gel có kích thước nhỏ. Kích thước nhỏ có thể khắc phục hiện tượng chảy tràn do trọng lực, chảy rối và tăng bề mặt tiếp xúc giữa pha động và pha tĩnh. Tuy nhiên, nếu gel có kích thước quá nhỏ, đặc biệt là các gel có cấu trúc mềm thì xuất hiện sự tăng áp suất trong quá trình sắc ký và dễ xảy ra hiện tượng đè nén cục bộ.  Lựa chọn dung dịch đệm chiết xuất: Tùy theo độ ổn định của gel và các cấu tử cần chiết tách mà lựa chọn dung dịch đệm có pH thích hợp. Thông thường, đối với gel dextran và polyacrylamide, pH ổn định trong khoảng 1 – 10. Gel agarose ổn định trong giới hạn pH 4 – 10.  Thể tích mẫu: Thể tích mẫu chiếm khoảng 1 – 5% thể tích cột.  Tốc độ dòng chảy qua gel: Thông thường, đối với gel kích thước nhỏ, có thể điều chỉnh tốc độ chảy lên đến 15 – 25 ml/giờ.  Phương pháp thực hiện Dùng cột sắc ký nhồi chất mang là sephadex tách các chất có phân tử lượng khác nhau. Chất nào có phân tử lượng lớn không bị mắc kẹt trong các lỗ rây của cột nhồi sẽ chạy ra trước ta thu được nhưng phân đoạn đầu tiên và ngược lại những chất có phân tử lượng nhỏ nhất sẽ chạy ra sau cùng. Từ đây, ta thu được ta thu được các phân đoạn khác nhau. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 29  Thiết bị Hiện nay, người ta thường sử dụng gel sephadex làm vật liệu nhồi cột. Sephadex là tên thương mại của một loại polysaccharide có nguồn gốc từ vi sinh vật – có bản chất là dextran. Trong đó, các phân tử được liên kết với nhau thông qua các liên kết ngang nhờ tác dụng của epichlorohydrin tạo thành các "rây phân tử". Số liên kết ngang càng nhiều thì kích thước lỗ rây sẽ càng nhỏ. Sephadex khi ngâm trong nước sẽ hình thành nên mạng lưới gel ba chiều. Các loại sephadex hiện nay chỉ trương nở trong nước và một vài dung môi phân cực nhưng không trương trong methanol, ethanol, acid acetic. Sephadex không tương tác với các ion do nó trung hòa về điện. Nếu bị oxy hóa mạnh trong các dung dịch thì cấu trúc gel sẽ bị phá vỡ, còn trong trong dung dịch acid mạnh thì các glucoside trong gel sẽ bị thủy phân. Hình 4.7.2.1: Sự phân tách các phân tử protein – enzyme bằng kỹ thuật sắc ký ái lực Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 30  Một số hiện tượng cần chú ý khi tiến hành lọc gel  Hiện tượng hấp phụ (adsorption effect): Là hiện tượng có thể gặp trong quá trình lọc gel. Sự hấp phụ một phần có thể gây ra sự trễ (delay) trong quá trình phân tách một phân tử protein nào đó. Sự hấp phụ có thể xem gần giống như tính chất trao đổi ion (ion exchange character) mà khi đó có thể tránh bằng cách sử dụng dung dịch đệm có lực ion lớn.  Hiện tượng chảy rối (turbulent flow): Là hiện tượng xảy ra khi dòng dung dịch đệm – mẫu di chuyển từ một vùng không gian hẹp giữa các hạt gel đến vùng không gian lớn hơn. Hiện tượng này luôn xảy ra trong quá trình sắc ký. Chỉ có thể giảm bớt hiện tượng chảy rối bằng cách giảm tốc độ chảy của dung dịch rửa giải hoặc sử dụng hạt gel có kích thước nhỏ hơn.  Hiện tượng không ổn định do trọng lực (gravitational instability): Hiện tượng này xuất hiện khi mẫu được đưa vào ở vị trí phía trên cột. Hệ quả của nó làm giảm khả năng khuếch tán của protein vào hạt gel, từ đó, khả năng phân tách protein trong hỗn hợp cũng bị giảm. Có thể khắc phục hiện tượng này bằng cách tiếp mẫu từ dưới lên và giảm kích thước hạt gel.  Đánh giá hiệu quả quá trình tinh sạch: Đánh giá hoạt tính riêng của chế phẩm: Các phương pháp xác định hoạt tính enzyme chủ yếu dựa vào lượng tinh bột bị thủy phân hay lượng đường khử tạo thành, sau đây là một số phương pháp để xác định hoạt độ của enzyme amylase:  Phương pháp Wolhgemuth: Nguyên tắc: xác định lượng enzyme ít nhất có thể thủy phân 1mg tinh bột đến các sản phẩm không màu với iod.  Phương pháp Heinkel: Nguyên tắc: xác định lượng tinh bột bị phân giải dựa trên cơ sơ xác định mức độ giảm cường độ màu của hỗn hợp với dung dịch iod. Đơn vị hoạt độ của enzyme là lượng enzyme có khả năng phân giải 1mg tinh bột sau 30 phút ở 300C.  Phương pháp Rukhliadeva Geriacheva: Nguyên tắc: amylase có khả năng thủy phân tinh bột tạo thành các dextrin có khối lượng phân tử khác nhau, khi cho tác dụng với iod, chúng sẽ tạo màu, đo cường độ màu tạo thành ta tính được hoạt độ của amylase. Đơn vị hoạt độ của amylase là lượng enzyme xúc tác thủy phân được 1g tinh bột tạo thành dextrin có phân tử lượng khác nhau ở nhiệt độ 300C trong 1 giờ. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 31  Phương pháp Smith và Rose: Nguyên tắc: hoạt tính α – amylase được xác định dựa trên sự thay đổi màu sắc của phức tinh bột – iod trước và sau thủy phân. Mật độ quang của phức tinh bột – iod được đo ở bước sóng 595nm trên máy quang phổ. Một đơn vị hoạt tính α – amylase là lượng enzyme cần thiết để thủy phân 10mg tinh bột trong thời gian 1 phút ở 500C và pH 5.6.  Phương pháp Gratreva: Nguyên tắc: đơn vị hoạt độ amylase là lượng enzyme xúc tác chuyển hóa 1g tinh bột thành glucose sau 1 giờ. Hoạt độ amylase được tính bằng số đơn vị trên 1ml môi trường hoặc 1g chế phẩm.  Phương pháp Nelson: Nguyên tắc: dưới tác dụng của amylase, tinh bột bị thủy phân tạo ra dextrin và đường khử. Vì vậy, sự tăng lượng đường khử trong hỗn hợp phản ứng sau khi enzyme tác dụng là thước đo hoạt lực enzyme. Để định lượng đường khử tạo thành có thể dung nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp Nelson, Berrand, Luff – Schoorla cả tiến, Granxianof, … Nguyên tắc chung: lợi dụng tính chất khử của nhóm – CHO trong phân tử đường khi tác dụng với các chất khác nhau hay phản ứng với dung dịch đồng hóa trị II tạo thành kết tủa Cu2O. Hòa tan kết tủa Cu2O bằng các chất khác nhau và định lượng Cu để suy ra lượng đường. Ở đây ta sử dụng phương pháp Nelson. Hòa tan kết tủa Cu2O trong thuốc thử arseno – molybden sẽ nhận được màu xanh da trời. So màu ở máy so màu