Đề tài Thử nghiệm phương pháp tách chiết DNA trong đất nhằm khảo sát tính đa dạng của hệ vi sinh vật trong mối quan hệ tương tác giữa trùn đất Pheretima SP.và thực vật siêu hấp thụ kim loại nặng cây thơm ổi

MỤC LỤC

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

1.2 Mục đích

1.3 Giới hạn đề tài

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2. Ô nhiễm chì (Pb) và tác hại

2.1 Đặc tính của chì (Pb)

2.2 Tình hình ô nhiễm chì

2.2.1 Trên thế giới

2.2.2 Ở Việt Nam

2.3 Ảnh hưởng lên sức khỏe cộng đồng dân cư

2.3.1 Tác hại đến hệ thống tạo huyết của cơ thể

2.3.2 Tác hại đến hệ thống thần kinh

2.3.3 Tác hại đến thận

2.3.4 Tác hại đến hệ tiêu hoá

2.3.5 Tác hại đến hệ tim mạch

2.3.6 Tác hại đến hệ sinh sản

2.4 Giải ô nhiễm bằng biện pháp sinh học

2.5 Phương pháp Phytoremediation

2.5.1 Lịch sử phát triển

2.5.2 Định nghĩa

2.5.3 Nguyên tắc

2.5.4 Ưu điểm

2.5.5 Khuyết điểm

2.6 Ứng dụng

2.7 Thực vật siêu hấp thu kim loại nặng

2.7.1 Khái niệm thực vật siêu hấp thụ ( Hyperaccumulator)

2.7.2 Nguyên nhân thực vật có khả năng hấp thụ kim loại nặng

2.7.2.1 Giả thuyết sự hình thành phức hợp

2.7.2.2 Giả thuyết về sự lắng đọng

2.7.2.3 Giả thuyết hấp thụ thụ động

2.7.2.4 Sự tích luỹ kim loại là cơ chế chống lại các điều kiện stress vô sinh hoặc hữu sinh

2.8 Cơ chế giải ô nhiễm của thực vật

2.9 Trùn đất

2.9.1 Đặc điểm

2.9.2 Điều kiện sống & sinh sản

2.9.2.1 Điều kiện sống

2.9.2.2 Sinh sản

2.10 Lợi ích đối với đất

Chương 3 VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

3. Chuẩn bị vật liệu thí nghiệm

Đất ô nhiễm

3.2 Phương pháp phân tích đất

3.2.1 Độ pH (độ chua của đất) (pH H2O)

3.2.2 Độ hút ẩm tối đa của đất (CMR)

3.2.3. CEC

3.2.4. Chỉ tiêu N, P tổng số

3.2.4.1 Chỉ tiêu N tổng số

3.2.4.2 P tổng số

3.2.5 Chất mùn

3.2.6 N, P, K dễ tiêu

3.2.6.1 P dễ tiêu

3.2.6.2 N2 dễ tiêu (phương pháp Kjendhal)

3.2.6.3 K dễ tiêu

3.2 Thực vật

3.2.1 Ứng dụng của cây Lantana camara L.

3.2.2 Những nhược điểm

3.3 Trùn đất

3.4 Bố trí thí nghiệm

3.4.1 Bố trí

3.4.2 Theo dõi thí nghiệm

3.4.2.1 Chăm sóc

3.4.2.2 Theo dõi sinh trưởng của cây

3.4.2.3 Thời gian thí nghiệm

3.4.2.4 Các chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm

3.4.3 Lấy mẫu và phân tích

3.4.3.1 Lấy mẫu

3.4.3.2 Các phương pháp trong phòng thí nghiệm

Chương 4 DỰ ĐOÁN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Dự đoán

4.2 Đề nghị

Tài liệu tham khảo

 

doc81 trang | Chia sẻ: leddyking34 | Ngày: 24/04/2013 | Lượt xem: 1954 | Lượt tải: 3download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Đề tài Thử nghiệm phương pháp tách chiết DNA trong đất nhằm khảo sát tính đa dạng của hệ vi sinh vật trong mối quan hệ tương tác giữa trùn đất Pheretima SP.và thực vật siêu hấp thụ kim loại nặng cây thơm ổi, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
hau thì có những đặc điểm riêng như : Cellulase: là enzyme cần thiết để giải phóng glucose, có chứa nhóm enzyme giúp phân giải vách tế bào trong thực tế được sử dụng tạo protoplast. Amylase: là enzyme có khả năng cắt liên kết glucoside nối các đơn vị đường đơn trong thành phần của phân tử tinh bột, giải phóng glucose là chất quan trọng trong cơ thể thực vật. Invertase: là một loại enzym thủy phân saccharose được sử dụng phổ biến trong công nghiệp nước giải khát. Invertase có trong động vật thực vật, vi sinh vật và đặc biệt là nấm men có khả năng tổng hợp invertase cao, tạo đường đơn tham gia vào quá trình biến dưỡng. Protease: cần thiết cho hoạt động sống và là thành phần cơ bản có khả năng thủy phân protein. Chúng có khả năng tổng hợp dạng tiền enzyme không hoạt động và chỉ hoạt động khi đưa vào hệ tiêu hóa và bị cắt bớt đi một phần sợi polypeptide do các endoprotease. Được sự dụng rất nhiều trong sản xuất dịch protein thuỷ phân. Peroxidase Urease Phosphatase Dehydrogenase Tóm lại trùn tác động thông qua tiêu hóa tác động, cắt các chất hữu cơ phức tạp thành những phần nhỏ rồi trộn đều lại thải ra dưới dạng phân trên mặt đất. Chúng còn cày xuyên qua đất trộn đều các lớp đất và các vi sinh vật tồn tại trong đó. Trong quá trình này chúng hình thành nên các viên đất kết hợp với nước làm cho đất thoáng khí và tăng khả năng giữ nước của đất . 2.8.3 Mối quan hệ giữa trùn và thực vật Trùn đến ảnh hưởng đến sự phát triển của cây đặc biệt là giai đoạn phát triển của cây (Brown và cộng sự, 1999; Lavelle, 1997). Như đã nói ở trên cây trồng tác động trực tiếp đến trùn đất thông qua hoạt động của bộ rễ cây là chủ yếu, những chất tiết ra từ bộ rễ, sự lan tỏa của bộ rễ. Là nguồn dinh dưỡng và là mái nhà che ổn định nhiệt độ, độ ẩm của trùn đất …. Bên cạnh đó trùn cũng tác động ngược lại đối với cây trồng là tạo ra các đường hang giúp rễ phát triển lan rộng dễ dàng, hệ tiêu hóa của trùn còn có khả năng kích thích hoạt động của các vi sinh vật giúp chuyển hóa các chât dinh dưỡng khó tiêu thành các chất dễ tiêu giúp cho cây hấp thụ dễ dàng . Trùn đất cải thiện đất trồng và các thành phần hóa học, sinh học. Giúp cho không khí luân chuyển dễ dàng trong đất, sự di chuyển của nước cũng dễ dàng. Dẫn nước cho cây: Trùn tạo ra các đường hang dọc và ngang, gia tăng khả năng vận chuyển khí và nước trong đất cung cấp kịp thời cho hệ thống cây trồng. Trùn còn có khả năng chuyển hóa các chất khó hấp thu thành chất dễ tiêu nhờ hệ thống VSV trong ống tiêu hóa của trùn tạo điều kiện thuận lợi cho cây trồng phát triển. Thông thoáng đất: Khí có thể dễ dàng luân chuyển xung quanh vùng rễ cung cấp oxi giúp cho rễ cây phát triển và cacbon dioxide từ rễ thoát ra ngoài dễ dàng. Bởi vì trùn đã làm thay đổi trạng thái của đất làm cho đất xốp hơn, áp xuất không khí trong đất cũng thay đổi. Trùn tác động vào đất bằng 2 cơ chế đó là: (1) Tạo ra nhiều đường hang. (2)Tạo ra các hạt kết trong đất. Hạt kết Ở đây hạt kết được biết như là sự pha trộn giữa đất và các vật chất của vi sinh vật do trùn tạo ra. Nó có cấu trúc ổn định, có độ bền cao có thể phân biệt được so với các hạt đất thông thường. Hay có thể nói là sự liên kết của các hạt đất ở nhiều kích thước với vi sinh vật (nấm, vi khuẩn , ….) sự liên kết của các hạt đất giúp bảo vệ các thành phần dinh dưỡng của đất làm cho đất tránh hiện tượng xói mòn bảo vệ hệ vi sinh sống trong đó. Như vậy yếu tố nào đã liên kết các hạt đất với nhau ? Có quan điểm cho rằng vi sinh vật đóng vai trò gián tiếp trong sự liên kết các hạt đất với nhau. Hoạt động của vi sinh vật, nhất là nhóm háo khí đã hình thành nên một thành phần của mùn là axit humic. Các muối của axit humic tác dụng với ion Canxi tạo thành một chất dẻo gắn kết những hạt đất với nhau. Sau này người ta đã tìm ra vai trò trực tiếp của vi sinh vật trong việc tạo thành kết cấu đất: Trong quá trình phân giải chất hữu cơ, nấm mốc và xạ khuẩn phát triển một hệ khuẩn ti khá lớn trong đất. Khi nấm mốc và xạ khuẩn chết đi, vi khuẩn phân giải chúng tạo thành các chất dẻo có khả năng kết dính các hạt đất với nhau. Bản thân vi khuẩn chết đi và tự phân huỷ cũng tạo thành các chất kết dính. Ngoài ra lớp dịch nhày bao quanh các vi khuẩn có vỏ nhày cũng có khả năng kết dính các hạt đất với nhau. Genxe - một nhà nghiên cứu về kết cấu đã nhận xét rằng: khi bón vào đất những chất như Xenluloza và Protein thì kết cấu của đất được cải thiện. Đó là do vi sinh vật phân giải xenluloza và protein đã phát triển mạnh mẽ, các sản phẩm phân giải của chúng và các chất tiết trong quá trình sống của chúng đã liên kết các hạt đất với nhau tạo nên cấu trúc đất. Rudacop khi nghiên cứu về kết cấu đoàn lạp ở đất trồng cây họ đậu đã kết luận rằng: Nhân tố kết dính các hạt đất trong đất trồng cây họ đậu chính là một sản phẩm kết hợp giữa axit galactorunic và sản phẩm tự dung giải của vi khuẩn Clostridium polymyxa. Axit galactorenic là sản phẩm của thực vật được hình thành dưới tác dụng của enzym protopectinaza do vi khuẩn tiết ra. Các chất kết dính tạo thành kết cấu đất còn được gọi là mùn hoạt tính. Như vậy mùn không những là nơi tích luỹ chất hữu cơ làm nên độ phì nhiêu của đất mà còn là nhân tố tạo nên kết cấu đất. Sự hình thành và phân giải mùn đều do vi sinh vật đóng vai trò tích cực. Vì vậy các điều kiện ngoại cảnh ảnh hưởng đến vi sinh vật cũng ảnh hưởng đến hàm lượng mùn trong đất. Đặc biệt nước ra ở trong vùng nhiệt đới nóng ẩm, sự hoạt động của vi sinh vật rất mạnh ảnh hưởng rất lớn đến sự tích luỹ và phân giải mùn. Các biện pháp canh tác như cày bừa, xới xáo, bón phân ... đều ảnh hưởng trực tiếp đến vi sinh vật và qua đó ảnh hưởng đến hàm lượng mùn trong đất. Vi sinh vật trong đất: Trùn đất là một điển hình với số lượng lớn có thể tiêu thụ dễ dàng 2 tấn vật chất khô trong một năm, giúp cải thiện đất trồng, trộn đều đất và các vi sinh vật trong đất. Ví dụ một số vùng ở Pennysylvania có ít trùn nên tác động của chúng không nhiều là cho đất không được tốt nên thường ít được sử dụng. Còn ở Hà Lan, một số vùng ven biển khi cải tạo lần đầu không sử dụng trùn đất khi trồng cây thường phát triển kém, cho đến khi có bổ xung thêm trùn thì cây phát triển tốt hơn. Và đây cũng là một trong những nguyên nhân mà chính phủ Hà Lan bắt đầu khuyến khích người dân sử dụng trùn trong nông nghiệp. Cung cấp dinh dưỡng cho cây: Phân trùn có nhiều Ni, P, K và Ca hơn các phần đất xung quanh, khả năng trao đổi cation cao. Một số nguyên tố vi lượng như là Zinc, Bo được cung cấp nhiều hơn trong quá trình giải kim loại nặng. Lợi ích của vi khuẩn: Ngoài ra trong phân của trùn còn cung cấp thêm dinh dưỡng cho cây, tăng quá trình trao đổi chất dinh dưỡng. Các chất bài tiết của trùn có hàm lượng vi khuẩn rất cao rất cần thiết cho nông nghiệp. Điều khiển các loại sinh vật gây hại cho cây như tuyến trùng bằng cách ăn chúng làm giảm các sinh vật gây hại trong đất. Drilosphere Các yếu tố chủ yếu chi phối các hoạt động trong đất là: mối liên kết giữa các hạt đất, vi sinh vật phân giải, chu kì dinh dưỡng, hoạt động của vi khuẩn, thực vật và các thành phần hoạt tính…. Và dựa trên những đặc điểm riêng người ta chia ra là các nhóm : litter system, detritusphere, rhizosphere, Aggregatusphere, drilosphere, termitosphere, myrmecosphere. Trong đó 2 thành phần đầu tiên là quan trọng chịu sự tác động của khối sinh vật. Các loại sinh vật sinh sống trên mặt đất, ở rễ cây và ở các vùng xung quanh. Porosphere là sự hình thành các lỗ đất tạo thành mạng lưới đan xen nhau với nhiều kích thước (nhỏ, vừa và lớn) trong đất. Độ xốp của đất giúp cho nước và oxi di chuyển dễ dàng giúp cho hệ rễ phát triển mạnh, ngoài ra còn có thể giúp chúng lan rộng một cách dễ dàng. Các thành phần và yếu tố có mối quan hệ đan xen với nhau, tác động ảnh hưởng qua lại . Hình thể hiện mối quan hệ các nhóm 2.9.1 Định nghĩa Là khu vực xung quanh nơi trùn đất sinh sống, là vùng xung quanh khu vực sống và hoạt động của trùn khoảng 2 mm (Bouché). Còn Lavelle thì cho rằng nó là sự kết hợp của trùn, đất và vi sinh vật sống hoạt động. Tóm lại đó là 5 thành phần chính : khu vực trùn sinh sống, các thành phần bên trong của ruột trùn, các sản phẩm do trùn tạo ra (đường hang, phân, dịch nhầy). Hay có thể được biết như là phần của đất tạo ra với dịch nhầy của trùn và phân trùn. Đặc biệt hơn nó là phần của đất đã được di chuyển trong hệ tiêu hóa của trùn; độ dày trung bình của drilosphere là 2 mm (xung quanh các đường hang). 2.9.2 Đặc điểm Trùn đất chịu sự tác động của khối vi sinh vật đó là sinh khối vi sinh vật và thành phần dinh dưỡng . một nghiên cứu cho thấy drilosphere có 70% độ thoáng khí, nitrogen – trộn lẫn với vi khuẩn. trong hệ thống này thành phần N, P, và mùn là khá cao. Nó được tạo ra nhờ quá trình phân giải lá cây, rễ cây, nấm. (M.B. Bouché). Drilosphere đã chứng minh sự ổn định của đất dưới tác dụng của trùn. Bằng cách khảo sát tác động của hệ tiêu hóa và được cấu trúc bên ngoài hoạt hóa bởi trùn (trùn, phân trùn, các đường hang). Phạm vi hoạt động của drilosphere và các đặc điểm phụ thuộc vào loài và hình thái của các loại trùn sinh sống tại khu vực. Không gian, drilosphere có thể tạo ra với các thành phần của đất trong một hệ thống như detritusphere và rhizosphere (sinh khối vùng rễ và sự đa dạng), 2 thành phần chính của khối sinh vật tạo ra với đất là hạt kết và độ tơi xốp. Drilosphere tác động hoạt động của khối sinh vật và quá trình khử của khối sinh vật có thể hoàn toàn khác nhau (và đối nghịch) phụ thuộc vào không gian và thời gian khảo sát. Trong ruột trùn, hoạt động của vi khuẩn được kích thích sau vài giờ ở hệ tiêu hóa. Trong quá trình này, nước và các chất hòa tan của dịch nhầy ruột làm cho hệ sinh vật không hoạt động lại hoạt động, bằng cách đó làm gia tăng quá trình phân hủy đất của vi sinh vật. Ngoài ra trong phân trùn còn có nhiều dinh dưỡng, có thể rút ngắn thời gian khoáng hóa. Trùn đất có vai trò rất quan trọng trong hệ sinh thái. Chúng làm phong phú hệ vi sinh vật trong đất, cung cấp nguồn dinh dưỡng cho thực vật. Trong quá trình sống giúp cho vi sinh vật phân phối đều trong đất. Các đường hang tạo ra làm thông thoáng khí giúp cho quá trình thủy giải dễ dàng, giúp thực vật và vi sinh vật phát triển tốt. Nói chung trùn đất trong tự nhiên có thể cải thiện kết cấu của đất, độ màu mỡ, và làm tăng số lượng vi sinh . Người ta đã gom chung các loài trùn sống chung với nhau sau đó quan sát việc tạo ra các đường hang của trùn. Kết quả cho thấy sự khác biệt sau thời gian khảo sát có sự khác biệt ở các vị trí cho thấy có sự phát triển tốt ở thực vật. Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3. Chuẩn bị vật liệu thí nghiệm Đất Đất thu nhận ở vùng đất xám xã Phú An – huyện Bến Cát tỉnh Bình Dương. Đất được phơi khô trong thời gian 2-3 ngày rồi đập nhỏ rồi sàng ở ray 5 mm, loại bỏ những chất tạp sau đó, trộn đều đất lên (chú ý lấy một lượng nhỏ khoảng 500 g giữ lại để phân tích các chỉ tiêu của đất trước thí nghiệm). Đất đã ray ở ray 5 mm Thu nhận mẫu đất trước khi thí nghiệm Đất thu nhận sau khi đã phơi khô đập nhỏ H Cây thơm ổi Lantana Camara L. Thực vật Sau khi xác định được thực vật siêu hấp thụ KLN cây thơm ổi Lantana camara L. có khả năng giải ô nhiễm tốt so với các loài khác, cây Lantana được trồng để nghiên cứu ngưỡng và cơ quan hấp thu Pb của cây. Cây thơm ổi Lantana Camara L. hay còn được gọi với nhiều tên khác nhau như hoa ngũ sắc, trâm ổi, tỷ muội, yellowsage, Lantana, wildsage. Một loại cây thuộc họ cỏ roi ngựa (Verbeneceae), có nguồn gốc từ Trung Mỹ . Cây cao 1 -1.5 m, thân bụi có 4 cạnh, có gai nhỏ cong. Lá có phiến rất nhám, rìa có răng cưa. Hoa đầu có nách lá và ngọn, có nhiều màu vàng, cam, đỏ. Quả nhân cứng, đen, ngọt, ăn được, khi còn non thì độc (do chứa lantadiens), nhân có 1-2 hột. Ngoài ra cây còn được biết đến nhờ khả năng dễ thích nghi với nhiều điều kiện khác nhau, cũng như khả năng chịu hạn của mình. Ví dụ : Ở một số vùng, Lantana cạnh tranh với các loài khác, làm giảm đa dạng sinh học. (Kumar và Rohatgi, 1999). Số cây sử dụng : 1 cây/chậu x 40 chậu = 40 cây 3.3 Trùn đất H : Trùn đất Pheretima Loại trùn đất được chọn là Pheretima sp. Theo nghiên cứu thấy rằng điều kiện tốt nhất cho trùn hoạt động là mật độ của trùn so với đất là 10 % trọng lượng đất vì vậy lượng trùn sử dụng là 10g, tương ứng khoảng 10 con cho 1 chậu. Lượng trùn đất sử dụng: 10 trùn / chậu x 40 chậu = 40 trùn 3.4 Bố trí thí nghiệm 3.4.1 Chuẩn bị trước thí nghiệm Để thực hiện mục tiêu thí nghiệm của đề tài việc thực hiện các thí nghiệm đã làm như sau: Đất: trộn đều khối đất thí nghiệm lại với nhau. Rồi dùng cân cân 10 kg đất cho vào mỗi chậu đã chuẩn bị sẵn. Trùn đất: trùn đem từ khu công nghiệp Biên Hoà 2 về và xác định là chỉ thực hiện trên 1 loại trùn duy nhất Pheretima sp. Sau đó chọn ra những con trưởng thành có đai sinh dục rõ ràng tương đối đều nhau để thực hiện thí nghiệm. Để trùn có thể thích ứng với môi trường thí nghiệm chúng ta có thể đưa trùn về nuôi trước 1 tuần, giảm nguy cơ bị sốc khi thực hiện ngay thí nghiệm. Cây: là cây có chung 1 nguồn gốc từ Đồng Tháp được đưa vào sử dụng, với số lượng 1 cây /1 chậu (quan sát các đặc điểm của cây trước khi thí nghiệm như: chiều dài, số cành, số lượng lá). Chọn những cây có được từ phương pháp giâm cành, có độ tăng trưởng đồng đều để làm thí nghiệm. Tưới nước cho cây: đất và nước tưới được phân tích hàm lượng Pb tự nhiên để đảm bảo môi trường thí nghiệm ban đầu không có Pb. Sau 1 tuần trồng, các cây được xử lý đồng loạt với acetate Pb, và để đảm bảo lượng chì không bị rửa trôi ta cần tưới đúng lượng xác định. (chỉ tưới 1/3 lượng nước so với ngày đầu tiên). Như vậy ở đây lượng nước tưới là : - Tưới 2 lần trong 1 ngày và mỗi lần tưới là 250 ml. Trong thí nghiệm quan sát và ghi nhận các đặc điểm của cây theo từng ngày như: số cành, chiều dài, đường kính, hiện tượng phát triển của lá ….). Cuối thí nghiệm: Thu nhận cây, tách riêng phần lá, rễ, và đất của thời gian 1 tháng. Quan sát việc hình thành các hạt kết của trùn đất và của cây khác nhau như thế nào. Mẫu đất sẽ được phân chia, phơi khô và nghiền, sàng và đem đi phân tích. Ngoài ra, cần chú ý có thể thu nhận thêm phân trùn đất trong thời gian thí nghiệm củng cố thêm số liệu thành phần dinh dưỡng trùn tạo ra. 3.4.2 Bố trí thí nghiệm Thực hiện: Thí nghiệm bao gồm 4 nghiệm thức (10 kg /chậu) trong một lô nhân tạo và 4 nghiệm thức trong một lô đối chứng. Mỗi nghiệm thức được thực hiện với 5 lần lặp lại với thời gian là 1 tháng như vậy sẽ có tổng cộng 40 chậu. 20 chậu là đất nhiễm kim loại nặng nhân tạo (ở đây kim loại là Pb(CH3 COO)2.3H2O) và 20 chậu là đối chứng. Việc bố trí thí nghiệm vị trí giữa các chậu là sự bốc thăm ngẫu nhiên. Để cho thấy sự thay đổi của các nghiệm thức cũng là ngẫu nhiên trong cùng điều kiện môi trường . Kí hiệu T (T) là đất ô nhiễm Pb đối chứng ( + là xử lý Pb , - là không xử lý Pb) S (Sol) là đất thí nghiệm đã chuẩn bị V (Ver de terre) là trùn đất P (Plante) là cây thí nghiệm Thực hiện ở Khu sinh thái Tre thuộc xã Phú An – huyện Bến Cát tỉnh Bình Dương T+ T+ T+ T+ T+ T-S T-S T-S T-S T-S SV SV SV SV SV T-SP T-SP T-SP T-SP T-SP SP SP SP SP SP T-SV T-SV T-SV T-SV T-SV SPV SPV SPV SPV SPV T-SPV T-SPV T-SPV T-SPV T-SPV 1 tháng Đối chứng SV : đất ô nhiễm có bổ sung trùn (10% trùn/chậu ≈ 10 trùn/chậu) SP : đất ô nhiễm có trồng 1 cây Lantana Camara L. /chậu SPV : đất ô nhiễm có cây Lantana camara L.và bổ sung trùn 3.4.3 Theo dõi thí nghiệm 3.4.3.1 Thời gian thực hiện Từ ngày 05/03/2008 – 06/03/2008 chuẩn bị thí nghiệm: xô rửa đất, xô trồng cây, cân 50 kg cân đất, xẻng trộn đất, bao tay . 07/ 03/ 2008 : Rửa rễ cây, trồng cây. 09/ 03/ 2008 : Thả trùn đất vào một số chậu. 07/ 04/ 2008 : Thu mẫu cây, đất, trùn đất. Chuyển đất vào phòng thí nghiệm, rồi phơi liên tục ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày. 14/ 04/ 2008 : Xử lí đất phân loại các hạt kết riêng biệt tạo ra, cân trọng lượng, ghi nhận số liệu. Sau đó đập, nghiền và ray lại đất ở ray 2 mm. Các mẫu sau đó được chia làm 2 phần cho vào các bịch Zipper đã chuẩn bị: 1 là đem ly trích DNA của vi sinh vật có trong đất, 2 là đem đi phân tích các chỉ tiêu của đất . Những sự thay đổi trước và sau thí nghiệm được ghi chép lại làm cơ sở phân tích số liệu. Từ 21/4 – 30/8/2008 : Thực hiện ly trích ở phòng thí nghiệm sinh học phân tử và phân tích các chỉ tiêu của đất ở trung tâm môi trường (thu nhận số liệu). 3.4.3.2 Theo dõi sinh trưởng của cây Thí nghiệm được theo dõi và chăm sóc thường xuyên, luôn chú ý quan sát những sự thay đổi của cây, cứ 7 ngày tiến hành đo chiều cao một lần. H: Cách lấy mẫu Sau khoảng 1 tháng thì thu hoạch. 3.4.4 Lấy mẫu và phân tích 3.4.3.1 Lấy mẫu Thu mẫu trùn đất: Số lượng trùn đất, trọng lượng, phân trùn đất … Số lượng và khối lượng trùn đất bỏ vào thí nghiệm trước và sau so sánh . Từ đó suy ra được khả năng ảnh hưởng của kim loại nặng trong đất tác động đến cây như thế nào. 3.4.3.2 Các phương pháp trong phòng thí nghiệm Phần 1: Phân tích các đặc tính hoá lý của đất: pH, hàm lượng chất hữu cơ C,N, P, vật chất hữu cơ, acid humic, cation. Trùn sẽ làm thay đổi cấu trúc đất tác động lên thực vật. Phần 2: Khảo nghiệm vi sinh vật trong đất. ∗ Tách chiết trực tiếp DNA vi khuẩn trong đất, sau đó tinh sạch các đoạn DNA. ∗ Khuếch đại trình tự DNA vi khuẩn bằng phương pháp PCR. ∗ Khảo sát tính đa dạng của hệ VSV bằng phương pháp DGGE (Denaturing Gradient Gel Elecrophoresis) ∗ Thu nhận các đoạn DNA của hệ VSV và giải trình tự gen. Phần 3: Khẳng định thực vật giải ô nhiễm sẽ có khả năng hấp thụ hàm lượng KLN cao hơn trong điều kiện có bổ sung trùn đất. Phương pháp phân tích đất Mẫu lấy : CÔNG TY CỔ PHẦN PIN ẮC QUY MIỀN NAM Trụ sở chính: 321 Trần Hưng Đạo, Quận 1, TP. Hồ Chí Minh. Địa điểm lấy mẫu: Nước thải chưa xử lý tại nơi sản xuất công ty pin pinaco ở Khu Công Nghiệp Tân Tạo. Phương pháp lấy mẫu là lấy trực tiếp từ vòi xả nước thải của công ty. Ngày tháng lấy mẫu: 20/06/2008 Mẫu được đưa về và bảo quản trong tủ lạnh . Trong quá trình bố trí thí nghiệm, nước thải được sử dụng 1 lần tưới cây để tăng thêm lượng chì trong đất. Để biết được những thành phần có trong nước thải, dưới đây là những thí nghiệm thực hiện đã được đưa ra và khảo sát. Giá trị pH Ý nghĩa môi trường Độ pH là một trong những chỉ tiêu cần kiểm tra đối với chất lượng nước cấp và nước thải. Giá trị cho phép ta quyết định xử lý theo phương pháp thích hợp, hoặc điều chỉnh lượng hoá chất trong quá trình xử lý như đông tụ hoá học. Sự thay đổi giá trị pH trong nước có thể dẫn tới những sự thay đổi về thành phần các chất trong nước do quá trình hoà tan hoặc kết tủa, hoặc thúc đẩy hay ngăn chặn những phản ứng hoá học, sinh học xảy ra trong nước. Giá trị pH của nước trong tự nhiên thường nằm trong khoảng 6.5 -7.5; giá trị pH thấp hơn là do sự có mặt của CO2 tự do; sự phát sinhtảo đưa đến làm mất canxi trong nước mặt có thể là nguyên nhân đưa pH của nước lên 9.5. Nguyên tắc Sự phân ly của nước được biểu thị : Kw= aH+. aOH- Trong đó a: hoạt độ và aH+ = [H+] . f H+ AOH- = [ OH-] . fOH- Với các dung dịch loãng trong môi trường nước, hệ số hoạt độ (a) được xem bằng, hoặc tương đương 1, (a=1). Vì vậy Kw = [H+].[OH-] và Kw= 10-14, tích số Kw không thay đổi. [H+].[OH-] = 10-14 nên [H+] = 10-14 / [OH-]. Và pH = - log [H+] pH = 14 - pOH H : Lọc mẫu trước khi đo pH Dùng máy pH kế để xác định pH và như vậy ta có thể xác định được [H+]. Dựa vào sự chênh lệch giữa điện điện cực chuẩn calomen và điện cực H+ (điện cực thuỷ tinh) cho kết quả chính xác cao. Hiện nay các loại máy hiện đại chỉ dùng một điện cực loại hỗn hợp. Các yếu tố ảnh hưởng Nếu trong mẫu có hàm lượng dầu cao kết quả thu nhận không được chình xác do dầu mỡ bám vào điện cực. Với pH cao > 12 kết quả thu nhận cũng không tốt. Thực hành Rửa điện cực bằng nước cất trước tiên dùng dung dịch chuẩn pH = 7 chỉnh máy. Rửa lại điện cực bằng nước cất lau khô, dùng chuẩn pH = 4 chỉnh máy. Rửa lại điện cực, lau khô, cho mẫu nước vào đo, đọc kết quả trên máy khi tín hiệu ổn định 30 giây. Độ kiềm của nước Ý nghĩa môi trường Độ kiềm biểu thị khả năng thu nhận proton H- của nước. Có 3 ion chính tạo ra độ kiềm đó là hydroxide, carbonic và bicarbonate. Ngoài ra còn có các thành phần khác như borax, silicat…. cũng ảnh hưởng đến độ kiềm. Có một vài acid hữu cơ bền với sự oxy hoá sinh học như acid humic và các muối chúng làm tăng độ kiềm. Nguyên tắc Độ kiềm chia làm 2 dạng là độ kiềm phenol và độ kiềm tổng cộng. Độ kiềm phenol được xác định bằng cách định phân các acid mạnh có chỉ thị màu phenolphtalein, tại điểm kết thúc chuẩn độ dung dịch sẽ chuyển từ màu hồng sang không màu, ứng với pH dung dịch từ 8.4 -8.2. Độ kiềm tổng cộng được xác định bằng cách định phân với acid mạnh và chỉ thị màu là methyl da cam. Điểm kết thúc chuẩn độ khi dung dịch chuyển từ màu vàng sang da cam, ứng với pH từ 4.5 – 4.3. Các yếu tố ảnh hưởng Nếu dung dịch có màu hợac d8ục thì không thể sử dụng phương pháp chuẩn độ để xác định độ kiềm mà phải sử dụng phương pháp chuẩn độ điện thế. Dụng cụ - Hoá chất Dụng cụ - thiết bị Erlen 250 ml Ống đong 50 ml Bình định mức 100 ml Buret điện tử Hoá chất Dung dịch HCl 0.02N : hoà tan 1.72 ml dung dịch HCl đậm đặc trong nước cất thành 1l. Chỉ thị màu phenolphtalein 0.5%: hoà tan 0.5 g phenolphtalein trong 50 ml etanol rồi định mức bằng nước cất đến 100 ml. Chỉ thị màu metyl da cam 0.05%: Cân 0.05 g methyl da cam hoà tan trong 100 ml ethanol. H: Độ kiềm phenol Thực hành Mẫu có pH >8.3 (có 2 độ kiềm) Độ kiềm phenol Lấy 50 ml mẫu vào erlen 250 ml, thêm 3 giọt chỉ thị phenolphtalein, lắc đều. Dùng dung dịch HCL 0.02 N chuẩn độ cho tới khi dung dịch vừa mất màu hồng. Ghi nhận thể tích V1 của HCL tiêu hao. Độ kiềm tổng cộng Lấy 50 ml mẫu vào erlen 250 ml , thêm 3 giọt chỉ thị methyl da cam, lắc đềudung dịch tiến hành chuẩn độ bằng dung dịch HCL 0.02 N cho tới khi dung dịch từ màu vàng sang màu da cam. Ghi nhận thể tích V2 của HCL tiêu tốn. Chú ý với mẫu pH < 8.3 chỉ tiến hành xác định độ kiềm tổng cộng. H: Mẫu khi cho methyl da cam vào H: Mẫu chuyển sang vàng cam Tính toán kết quả Độ kiềm phenol (mg CaCO3/l) = V1 x 1000 Vmẫu Độ kiềm tổng cộng (mg CaCO3/l) = V2 x 1000 Vmẫu V mẫu là thể tích dung dịch mẫu đem đi chuẩn độ. 2. Độ cứng và calci 2.1 Độ cứng tổng cộng Ý nghĩa môi trường Độ cứng của nước là đặc tính của nước biểu thị nồng độ tổng số ion calci và magie qui thành calci carbonat. Độ cứng tổng cộng của nước bao gồm cacbonat và độ cứng không phải cacbonat. Độ cứng cacbonat là độ cứng do muối của calci, magie cacbonat và bicacbonat tạo nên còn độ cứng các muối khác của calci và magie không phải là độ cứng cacbonat. Độ cứng của nước còn được hiểu là khả năng tạo bọt của nước với xà bông. Ion calci và magie trong nước sẽ kết tủa với xà bông làm giảm sức căng bề mặt và phá huỷ đặc tính tạo bọt. Nguyên tắc Ở pH 10 Ca, Mg sẽ phản ứng tạo phức với muối Natri Ethylenediaminetetraacetate (Na – EDTA) với chỉ thị màu là Eriochrome Black T (NET). Điểm kết thúc chuẩn độ dung dịch sẽ chuyển từ màu hồng sang màu xanh dương. Các yếu tố ảnh hưởng Một vài kim loại nặng gây cản trở cho việc định phân, làm chỉ thị nhạt màu dần hay không rõ ràng tại điểm kết thúc quá trình chuẩn độ. Có thể loại trừ ảnh hưởng này bằng cách thêm vào các chất che vào dung dịch định phân. Chẳng hạn cho thêm dung dịch Diethanolamine vào để loại trừ ảnh hưởng của Al, thêm dung dịch KCN vào để loại trừ động , thêm hydroxylamine vào để ngăn ngừa sự tạo thành của Mn4+ trong môi trường kiềm, vì Mn4+ sẽ phá huỷ chỉ thị NET. Dụng cụ - hoá chất Dụng cụ và thiết bị Beacher 250 ml Erlen 250 ml Buret 25 ml Ống đong 100 ml Bình định mức 100 ml Hoá chất Dung dịch đệm pH: hoà tan 67.6 g NH4CLl trong 572 ml NH4OH đậm đặc rồi thêm nước cất cho đến 1 L. Chỉ thị màu Eriochrom black T: cân 0.5 g chỉ thị NET trộn đều trong 100 g NaCl nghiền mịn. Dung dịch chuẩn EDTA 0.01 M: cân 3.723 g EDTA hoà tan trong nước cất thành 1 L. Dung dịch KCN 10%: cân 10 g muối KCN pha trong nước cất thành 100 ml. Dung dịch hydroxylaminaclorate NH2OH.HCl 1%. Thực hành Lấy 50 ml mẫu vào erlen 250 ml, cho thêm 1 ml dung dịch KCN, 1 ml dung dịch NH2OH.HCl thêm 5 ml dung dịch đệm và một ít chỉ thị NET, lắc đều. Chuẩn độ bằng dung dịch EDTA 0.01 M cho tới khi dung dịch chuyển từ màu hồng sang màu xanh. Ghi nhận thể tích V của EDTA tiêu tốn. H : Mẫu sau khi chuẩn bằng EDTA H H: Mẫu sau khi cho NET Tính toán kết quả Độ cứng tổng cộng ( mgCaCO3/L) = VEDTA x CEDTA x 1000 x MCaCO3 V mẫu Calci Ý nghĩa môi trường Calci là một trong những nguyên tố thuờng gặp trong nước thiên nhiên vì chảy qua những vùng có nhiều đá vôi, thạch cao…..Tuỳ theo nguồn gốc và cách xử lý mà hàm luợng calci trong nước có thể từ vài đến vài trăm ppm. Calci ở dạng kết tủa calci cacbonate có thể tạo nên một màng cứng bám vào mặt trong các ống dẫn theo thời gian tích tụ, bảo vệ kim loại chống lại sự ăn mòn. Tuy nhiên lớp màng này lại có tác hại đối với những thiết bị sử dụng ở nhiệt độ cao như nồi hơi….. Nguyên tắc Trong môi trường pH 12, calci sẽ phản ứng tạo phức với dung dịch EDTA với sự có mặt của

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • docThử nghiệm phương pháp tách chiết dna trong đất nhằm khảo sát tính đa dạng của hệ vi sinh vật trong mối quan hệ tương tác giữa trùn đất Pheretima sp v.doc
Tài liệu liên quan