Đề tài Tìm hiểu và thu nhận Enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus Oryzae

t động tối thích là 5,0 và nhiệt độ tối thích là 47,50C. Pullulanase phân giải các liên kết α-1,6 glucoside bị bao quanh bởi các liên kết α-1,4. Nó còn có khả năng thuỷ phân cả những dextrin phân tử thấp. II.6. α-glucosidase hay maltase Nấm sợi sản sinh enzyme này. Nó thuỷ phân maltose thành glucose nhưng không thuỷ phân tinh bột.Một số tác giả cho rằng nó có hoạt tính glucosyltransferase, tức là có khả năng chuyển các gốc glucosyl sang đường và rượu. Phần II: Chủng nấm mốc Aspergillus Oryzae  8 Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae Quá trình lên men là hoạt động sống của tế bào VSV trong môi trường. Quá trình này xảy ra ở điều kiện tự nhiên và quá trình sản xuất công nghiệp. Bản chất của 2 quá trình này có thể nói là như nhau nhưng về mặt hình thức và phương diện thì khác nhau hoàn toàn. Quá trình lên men trong điều kiện tự nhiên là một quy luật sống còn của VSV. Tự tham gia tổng hợp nên chất sống từ vật liệu lên men có trong tự nhiên. Các VSV và vật chất sử dụng trong quá trình lên men tự nhiên rất phức tạp, không đồng đều về chủng loại và về số lượng. Mặt khác, quá trình lên men này không được kiểm soát, bao gồm nhiều pha và không định hướng. Sản phẩm lên men là đa dạng, không ổn định; do dó, chất lượng sản phẩm kém không đồng nhất. Quá trình lên men trong sản xuất công nghiệp, tất cả các khâu về phân lập giống VSV, cơ chất, nhiệt độ, pH, độ ẩm… các quá trình phản ứng sinh học, quá trình thu nhận, tinh sạch sản phẩm đều được kiểm soát hoàn toàn ( Sản phẩm tạo ra mang tính định hướng rõ ràng ngay từ lúc đầu ở khâu chọn giống VSV cho đến cuối quá trình thu nhận sản phẩm ) . Do đó chất lượng sản phẩm được cải thiện . I. Giới thiệu về chủng nấm mốc Aspergillus oryzae Condium of Aspergillus oryzae Asp. oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp Ascomycetes ( nang khuẩn ). Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang 5-7 µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang , chia sợi thành nhiều bao tế bào ( nấm đa bào ). Từ những sợi nằm ngang này hình thành những sợi đứng thằng gọi là cuống đính bào tử, ở đó có cơ quan sinh sản vô tính. Cuống đính bào tử của Asp.oryzae thường dài 1-2 mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Phía đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng. Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi là những tế bào hình chai. Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử đính vào nhau, nên gọi là đính bào tử. Đính bào tử của Asp.oryzae có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau…  9 Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae Đặc điểm của giống Asp.oryzae: giàu các enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào (amylase, protease, pectinasa,…), ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột, gạo… đã hết nhưng không được rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lỏi ngô, ở bã sắn… Chúng mọc và phát triển có khi thành lớp mốc, có màu sắc đen ,vàng… Màu do các bào tử già có màu sắc. Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và phát tán khắp nơi, khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới. II.Giới thiệu phương pháp phân lập nấm mốc Aspergillus Oryzae Trong đất có nhiều loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase. Ở nấm mốc nguồn cơ chất thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzyme amylase này là tinh bột. Chúng ta có thể phân lập từ đất, thức ăn hay có thể mua trực tiếp từ nơi cung cấp nấm mốc giống. Ưu điểm của việc này là giống mua thì thời gian bảo quản và hiệu suất chất lượng giống được đảm bảo chắc chắn. Tuy nhiên, quá trình phân lập giống này có thể cho những kết quả đầy thú vị và có ý nghĩa trong việc bổ sung một chủng giống mới tại phòng thí nghiệm. Quá trình lấy mẫu: Có thể lấy mẫu từ đất ẩm khoảng 100g hay khoai tây cắt lát đem chôn xuống đất. Sau khoảng 8 ngày, đào hố lấy những miếng khoai tây ra, rủ sạch cát đất bám trên bề mặt miếng khoai tây. Sau đó cho vào bao nyclon và mang về phòng thí nghiệm. Tiến hành thí nghiệm phân lập: Nghiền mẫu đối với những mẫu khoai tây Lấy 10g mẫu đất hoặc mẫu khoai tây (đã làm nhuyễn) cho vào 90ml nước cất vô trùng sau đó đảo trộn mẫu. Dùng pipet hút 10ml từ dung dịch mẫu ban đầu chuyển sang 1 ông nghiệm khác có chứa 90ml nước cất vô trùng. Tiếp tục pha loãng mẫu ở nồng độ 10-3, 10-4 ở những ống nghiệm tiếp theo. Hút 0,1ml cho vào đĩa petri có chứa môi trường dinh dưỡng chọn lọc cho nấm mốc phát triển,môi trường PDA (Potato Dextro Agar). Dùng que trải, trải đều phần dinh dưỡng trên bề mặt môi trường đem ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 3 ngày.  10 Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae Mốc sẽ sử dụng nguồn tinh bột làm cơ chất, nên ở những chỗ này sẽ xuất hiện những quầng sáng xung quanh khuẩn lạc. Nhận biết bằng cách bổ sung Iodine vào trong môi trường trước khi cấy. Có tác dụng là chất chỉ thị cho tinh bột. Cấy truyền những mốc đặc trưng trong môi trường PDA trong ống thạch nghiêng với 1% tinh bột cho phép mốc phát triển trong 72 giờ sau đó có thể dự trữ trong máy làm đông. -Nhân giống vi sinh vật ở bình tam giác (qui mô nhỏ). Đổ 10ml H2O cất vô trùng vào ống thạch nghiêng có chứa bào tử nấm. Lắc đều cho bào tử hoà trộn vào môi trường đến khi tạo dung dịch huyền phù. Hút 0,1ml dịch huyền phù có chứa bào tử nấm cho vào bình tam giác có chứa môi trường sinh trưởng của nấm: PH = 6,5 Phân phối khoảng 30 – 40ml môi trường vào erlen 50ml đem khử trùng bởi Autoclave ở 1210C trong 15 phút sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng. Sau đó đem ủ ở 25 – 300C trong vòng 72 giờ trên máy lắc 200 vòng/phút. Sau khi nhân giống thành công có thể sử dụng ngay hoặc đem đi bảo quản và dự trữ, để có hiệu quả cao cho nấm mốc giống ta cần có những phương pháp bảo quản thích hợp.  11KH2PO4 1,4ml MgSO4.7H2O 0,1ml NH4NO3 10ml FeSO4.7H2O 0,01ml KCl 0,5ml hồ tinh bột 20ml Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae Phần III: Công nghệ lên men tạo enzym α-amylase I. Giới thiệu về phương pháp lên men bề mặt Thiết kế công nghệ: Cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20, việc nuôi cấy VSV thường được thực hiện theo phương pháp bề mặt. Phương pháp này được phát triển rất rộng rãi, không chỉ để thu nhận chế phẩm enzyme mà trước tiên đó là phương pháp thu nhận kháng sinh và một số quá trình lên men truyền thống. I.1.Ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho VSV phát triển trên bề mặt môi trường. Những ưu điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt là: - - - - -  Nuôi cấy bề mặt rất dễ thực hiện. Quy trình công nghệ thường không phức tạp. Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy chìm. Đây là đặc điểm ưu việt rất quan trọng trong giải thích tại sao phương pháp nuôi cấy bề mặt hiện nay phát triển mạnh trở lại. Chế phẩm enzyme thô ( bao gồm thành phần môi trường sinh khối VSV, enzyme và nước ). Sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản. Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vận hành công nghệ cũng như việc đầu tư vừa đơn giản vừa không tốn kém. Trong trường hợp bị nhiễm các VSV lạ, ta rất dễ dàng xử lý. Môi trường đặc là môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm ta chỉ cần loại bỏ khu vực đó khỏi toàn bộ khối nuôi cấy. Những khu vực khác sẽ hoàn toàn được an toàn. Nhược điểm lớn nhất và dễ nhận thấy nhất đó là: Phương pháp này tốn khá lớn diện tích cho nuôi cấy. Trong phương pháp này VSV phát triển trên bề mặt môi trường ( môi trường lỏng hoặc môi trường bán rắn) nên rất cần nhiều diện tích. Ở môi trường lỏng, VSV sẽ phát triển trên bề mặt môi trường, tạo thành khuẩn lạc ngăn cách pha lỏng ( môi trường ) và pha khí ( không khí ). Ở đây, VSV sẽ sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, O2 từ không khí, tiến hành quá trình tổng hợp enzyme. Enzyme ngoại bào sẽ được tách ra từ sinh khối và hòa tan vào dung dịch môi trường. Enzyme nội bào sẽ nằm trong sinh khối VSV. Nuôi cấy VSV thu nhận enzyme trên môi trường lỏng theo phương pháp cấy bề mặt thường được tiến hành trong các khay có chiều cao khoảng 12-15 cm, chiều rộng và chiều dài được thiết kế tùy theo kích thước phòng nuôi sao cho thuận tiện trong thao tác. Ở đây người ta quan tâm nhiều đến chiều cao môi trường lỏng. Nếu chiều cao môi trường lỏng quá lớn, VSV sẽ không có khả năng đồng hóa hết các chất dinh dưỡng ở phía đáy khay nuôi cấy. Nếu chiều cao môi trường nhỏ, sẽ thiếu thành phần chất dinh dưỡng, hiệu suất thu nhận enzyme sẽ không cao. Trong nhiều nhà máy, người ta thường tạo môi trường trong khay nuôi cấy có chiều cao môi trường từ 5-7 cm là hợp lý.  12 Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae Phần lớn các nhà máy sản xuất enzyme, khi nuôi cấy VSV thu nhận enzyme, người ta thường sử dụng môi trường đặc . Để tăng khả năng xâm nhập của không khí vào trong lòng môi trường, người ta thường sử dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc để làm môi trường. Trong trường hợp này, VSV phát triển trên bề mặt môi trường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường và sinh tổng hợp ra enzyme nội bào và ngoại bào. Các enzyme ngoại bào sẽ thẩm thấu vào trong các hạt môi trường, còn các enzyme nội bào nằm trong sinh khối VSV. VSV không chỉ phá triển trên bề mặt môi trường, nơi ngăn cách pha rắn ( môi trường ) và pha khí ( không khí ) mà còn phát triển trên bề mặt của các hạt môi trường nằm hẳn trong lòng môi trường. Môi trường nuôi cấy vừa có độ xốp cao và vừa phải có độ ẩm thích hợp. Nếu độ ẩm quá cao sẽ làm bết môi trường lại , không khí không thể xâm nhập vào trong lòng môi trường, nếu có độ ẩm thấp quá sẽ không thuận lợi cho VSV phát triển. Thông thường người ta thường tạo độ ẩm khoảng 55-65% W là hợp lý. Nếu sử dụng cám làm nguyên liệu chính để nuôi cấu VSV thu nhận enzyme, người ta phải cho thêm 20-25% trấu để làm xốp môi trường, tạo điều kiện thuận lợi không khí dễ xâm nhập vào lòng môi trường. Phương pháp nuôi cấy bề mặt bán rắn(môi trường đặc ) này rất thích hợp cho lên men ở nấm mốc Asp.oryzae. I.2. Qui trình sản xuất Chuẩn bị môi trường thạch nghiêng Ống mốc giống  Cấy chuyển Nuôi cấy 30-32oC trong 5-6 ngày Chuẩn bị môi trường trong bình tam giác  Ngô mảnh hấp thanh trùng Nước vô trùng  Giống trong ống thạch nghiêng Trộn đều bào tử  Nuôi cấy 30-32 oC trong 5-6 ngày Mốc giống trong bình tam giác Mốc giống cho  Làm tơi Trộn giống 0,5 – 10% Nuôi mốc 60 h sàn xuất Sấy khô Bao gói  13 Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae II. Qui trình lên men công nghiệp tạo enzym α-amylase II.1. Nguyên liệu Nguồn tinh bột: Ở nước ta nguồn nguyên liệu chứa tinh bột thì vô cùng đa dạng và phong phú.Ví dụ tinh bột từ gạo ( gạo tẻ, gạo nếp), ngô (bắp), sắn, …Nhưng để phù hợp cho sản xuất enzym amylase ở qui mô công nghiệp thì cần phải tính đến chi phí cho giá thành sản phẩm. Do vậy, nguồn nguyên liệu cần được quan tâm và chú trọng về mức độ rẻ tiền và dể kiếm. Đây là một lợi thế rất quan trọng cho nhà sản xuất và cho cả người tiêu dùng để có giá thành thấp và được sản xuất đại trà.Sau đây, giới thiệu một số nguồn nguyên liệu dễ tìm: Thành phần dinh dưỡng của hạt gạo (Viện Nghiên cứu dinh dưỡng thuộc Đại học Mahidol, Thái Lan,1999) - Protein của gạo chiếm khoảng 8-9%, chủ yếu là glutelin và glubuline. Ngoài ra còn cólẫn ít : cozine và prolamin. Lượng protein thoái hoá và biến tính dần trong quá trình bảo quản. - Glucid thì chủ yếu là tinh bột, đường, cellulose hemicellulose.Trong tinh bột chủ yếu là amylopectin, có chứa một ít chất khoáng như: P,K,Mg,…Ngoài ra còn có một số Vitamin:B1, B2, B6, PP, H, C, E và carotenoid. +Thành phần dinh dưỡng của ngô: (Cortez và Wild-Altamirano,1972) Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy bề mặt thường là những nguyên liệu có nguồn gốc tự nhiên như cám mì, cám gạo, gạo, ngô mảnh, đậu nành và các loại hạt ngũ cốc khác.Trong các loại nguyên liệu trên, cám gạo, cám mì được sử dụng nhiều hơn cả. Hai loại này có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho VSV phát  14Thành phần dinh dưỡng /100g Bắp nếp Bắp ngọt Protein 9,1 12,9 Tinh bột 72,8 69,3 Lipid(tổng số) 2,2 3,9 Cellulose 1,8 2,9 Nước 11,2 9,5 Khoáng 2,9 1,5 Thành phần dinh dưỡng Đơn vị tính Hàm lượng/100g Protein g 6 Tinh bột g 82 Lipid (tổng số) g 0,8 Cellulse g 0,6 Nước g 10,2 Năng lượng kcal 361 Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae triển. Mặt khác khi tạo môi trường, chúng thường có tính chất vật lý rất thích hợp để vừa đảm bảo khối kết dính cần thiết, vừa đảm bảo lượng không khí lưu chuyển trong khối nguyên liệu. Trong nhiều trường hợp, để tạo khả năng thoáng khí tốt hơn, người ta thường cho thêm trấu với tỷ lệ thích hợp cho từng loại enzym đươc tạo ra từ VSV. Thực chất cho trấu vào là làm tăng độ xốp của môi trường, tạo nên những khoảng trống để không khí có thể lưu thông trong lòng môi trường. Chính vì thế ta thấy rằng nấm mốc Asp. oryzae không chỉ phát triển trên bề mặt môi trường mà còn phát triển rất mạnh trên bề mặt hạt môi trường. Hay nói cách khác, chủng nấm mốc Asp.oryzae có khả năng phát triển ở giữa hai pha rắn và pha khí của môi trường.Trong trường hợp này, nó có khả năng phát triển hẳn trong lòng môi trường nhưng nó vẫn hoàn toàn mang ý nghĩa của quá trình lên men bề mặt. .  15 Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae II.2. Qui trình công nghệ Nguyên liệu Xử lý nguyên liệu Hấp thanh trùng Làm nguội Trộn giống VSV Nuôi cấy Thu nhận phế phẩm enzyme thô Nghiền mịn Trích ly Lọc Kết tủa enzyme  Sấy  Lọc  Giống VSV Nhân giống Giống cho sản xuất Bã Cồn hoặc Sulfat amon Thu nhận kết tủa Hoà tan trong dịch đệm  Sấy kết tủa Sắc ký trao đổi ion  chế phẩm ezyme bán tinh khiết Tách rửa chế phẩm enzyme tinh khiết  Sấy khô  Siêu lọc  Thu enzyme  16 Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae Thuyết minh qui trình: Nguyên liệu: Trong phương pháp lên men bề mặt, cấu trúc chính là cám mì, cám gạo. Hai loại này là nguyên liệu hoàn hảo và có thể là một cấu tử duy nhất của môi trường để nuôi nấm không cần bổ xung thêm chất khác nữa. Tuy nhiên do là phế liệu của công nghệ xay xát, nhưng làm cũng tương đối đắt tiền. Hơn nữa trong quá trình nuôi nấm, các chất dinh dưỡng không được sử dụng hết, vì thế có thể thay thế hoặc pha trộn thêm một số cấu tử rẻ tiền hơn. Mặt khác cấu tử bổ sung vào (trấu, mạt cưa,…) để làm tăng độ xốp giúp cho hệ sợi nấm phát triển tốt hơn tận dụng tối đa nguồn cơ chất để sinh ra hoạt lực enzyme cao nhất. Đặc biệt chú ý, cám không được chứa tinh bột dưới 20-30%. Nên dùng cám tốt, cám mới không có vị chua hay đắng, không hôi mùi mốc. Độ ẩm của cám không quá 15%, tạp chất độc không quá 0,05%. Hấp thanh trùng: Cám và các chất phụ gia chứa nhiều bào tử VSV khác nên cần phải thanh trùng để đảm bảo chủng nuôi phát triển bình thường và canh trường sản xuất không chứa VSV ngoại lai, cần thanh trùng dưới áp suất hơi 1-1,5 atm bằng hơi nóng ở nhiệt độ 1200C trong 90 phút. Để thuận lợi cho việc thanh trùng có hiệu quả, cũng như tạo điều kiện cho nấm sợi phát triển, trước khi thanh trùng, người ta thường dùng HCl hay H2SO4 để điều chỉnh pH môi trường. Sau khi thanh trùng môi trường được làm nguội người ta bắt đầu nuôi cấy để thu nhận enzyme. Trộn giống vi sinh vật: Sau khi làm nguội, tiến hành cấy giống hoặc rắc bào tử vào môi trường đã thanh trùng, ủ thành đống vài giờ, giống mốc có thể nuôi cấy riêng ở phòng thí nghiệm hay tại các phân xưởng nhân giống hoặc là giống thương phẩm có bán ở nơi cung cấp giống. Các loại giống này thường chứa nhiêu bào tử. Khi cấy vào môi trường dinh dưỡng, chúng sẽ phát triển thành tế bào nấm mốcvà tạo ra các loại enzyme mà ta mong muốn.Tỷ lệ giống đưa vào nuôi cấy thường vào khoảng 0,5-20% so với khối lượng của môi trường. Kỹ thuật nuôi cấy: Sau khi đã trộn giống, môi trường được trải đều ra các khay với chiều dài 2-3cm, rồi được đưa vào phòng nuôi cấy, đặt trên những giá đỡ. Các giá đỡ này được thiết kế sao cho lượng không khí được lưu thông thường xuyên. Phòng nuôi cấy phải có hệ thống điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm không khí.Nhiệt độ thích hợp cho nấm sợi phát triển là 28-320C. Nhiệt độ thấp quá hoặc cao quá đều ảnh hưởng không tốt cho nấm sợi phát triển. Trong quá trình nuôi cấy, ta hoàn toàn không cần điều chỉnh pH. Môi trường bán rắn là môi trường tĩnh nên sự thay đổi pH ở một vùng nào đó ít khi ảnh hưởng đến toàn bộ khối môi trường.  17 Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae Thời gian nuôi nấm sợi thu nhận enzyme vào khoảng 36-60 giờ. Điều này còn phụ thuộc vào chủng nấm mốc Asp.oryzae và điều kiện môi trường cũng như phụ thuộc vào điệu kiện nuôi cấy. Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng phương pháp bề mặt này trải qua các giai đoạn sau: Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy. Ở giai đoạn này có những thay đổi sau: -Nhiệt độ tăng rất chậm. -Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa. -Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi. -Khối môi trường còn rời rạc. -Enzyme mới bắt đầu đươc hình thành. Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt độ. Tuyệt đối không được đưa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kỳ đầu này giống rất mẫn cảm với nhiệt độ. Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài 14-18 giờ. Trong giai đoạn này có những thay đổi cơ bản sau: Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất mạnh các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp trong các hạt môi trường trong lòng môi trường. -Trong giai đoạn này ta có thể hoàn toàn nhìn rõ các sợi nấm có màu trắng xám bằng mắt thường. -Môi trường được kết lại khá chặt -Độ ẩm môi trường giảm dần -Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-450C. -Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh do sự đồng hoá mạnh của nấm sợi. -Enzyme amylase được tổng hợp mạnh. -Lượng O2 trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng 29-300C là tốt nhất.  18 Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài 10-20 giờ. Ở giai đoạn này có một số thay đổi cơ bản như sau: -Quá trình trao đổi chất yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại. -Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí môi trường xuống 20-25 thể tích không khí /thể tích phòng nuôi cấy/ 1giờ. Nhiệt dộ nuôi duy trì ở 300C,trong giai đoạn này, bào tử được hình thành nhiều do đó luợng enzym amylase tạo ra sẽ giảm xuống . Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết để thu nhận enzym rất cần thiết. Thu nhận chế phẩm enzyme thô :Kết thúc qúa trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzym amylase, chế phẩm này được gọi là chế phẩm enzym thô (vì ngoài thành phần enzym ra, chúng còn chứa sinh khối VSV, thành phần môi trường và nước trong môi trường). Để đảm bảo cho chế phẩm enzym thô α-amylase không bị mất hoạt tính nhanh người ta thường sấy khô chế phẩm enzym đến một độ ẩm thấp ( thiết bị sấy thường dùng ở đây là máy sấy chân không. Độ ẩm cần đạt được sau khi qúa trình sấy kết thúc là nhỏ hơn10% độ ẩm. Để đảm bảo hoạt tính enzym không thay đổi người ta thường sấy ở nhiệt độ 38-400C. Enzym α-amylase ở nấm mốc Asp.oryzae sẽ bị bất hoạt nếu nhiệt độ lên đến 60-70 độ C. Tùy theo mục đích sử dụng ta có thể dùng chế phầm thô này ngay không cần phải quá trình tinh sạch. Trong những trường hợp cần thiết khác, ta phải tiến hành làm sạch enzym. Để sản xuất enzym tinh khiết người ta phả tiến hành như sau: Nghiền: Toàn bộ khối lượng enzym thô amylase được đem đi nghiền.Mục đích của quá trình nghiền là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ các thành phần của chế phẩm thô.Khi thành tế bào được phá vỡ ,các enzym nội bào chưa thoát ra khỏi tế bào sẽ dễ dàng thoát khỏi tế bào.Phần lớn enzym amylase ngoại bào khi được tổng hợp và thoát khỏi tế bào ngay lập tức thấm vào thành phần môi trường.Khi ta nghiền nhỏ, enzym thoát ra khỏi các thành phần này dễ dàng hơn. Trích ly:Sau khi nghiền mịn, người ta cho nước vào để trích ly enzym α-amylase. Các loại enzyme thủy phân có khả năng tan trong nước nên người ta thường dùng nước như một dung môi hòa tan. Cứ một phần chế phẩm enzym thô, người ta cho 4-5 phần nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch, phần bã thu riêng dùng làm thực phẩm gia súc ( chú ý cần loại bỏ cát thạch anh và bột thủy tinh ra khỏi hỗn hợp bã rồi mới cho gia súc ăn). Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzym thô vì trong đó có chứa nước, các chất hòa tan khác từ khối môi trường nuôi cấy. Việc tiếp theo là làm sao tách enzym ra khỏi vật chất này. Quá trình kết tủa enzym α-amylase: Để làm việc trên người ta tiến hành kết tủa enzym nhờ những tác nhân gây tủa.Trong công nghệ tinh chế enzym, người ta thường dùng cồn và sulfat amon. Hai tác nhân kết tủa này dễ tìm kiếm và giá rẻ so với những tác nhân gây tủa khác. Trong khi tiến hành kết tủa, người ta phải làm lạnh cả dung dịch enzym thô và cả những tác nhân kết tủa xuống từ 4-70C để tránh làm mất hoạt tính enzym. Khi đổ chất làm kết tủa enzym vào dung dịch enzym thô phải hết sức từ từ để tránh hiện tượng biến tính.  19 Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae Trong qúa trình kết tủa người ta dùng cồn hoặc sulfat amon với liều lượng như sau: Cứ một phần dung dịch enzym thô người ta cho 2 đến 2,5 lần cồn hoặc sulfat amon. Khi cho chất kết tủa vào dung dich enzym thô, người ta tiến hành khuấy nhẹ, sau đó để yên trong điều kiện nhiệt độ lạnh (thường từ 4-7OC) theo thời gian, các enzym sẽ được tạo kết tủa và lắng xuống đáy, người ta tiến hành gạn và lọc thu nhận kết tủa ở dạng paste (độ ẩm lớn hơn 70%W). Ở trạng thái này enzym rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước để dễ bảo quản người ta sấy kết tủa enzyn α-amylase ở 40OC cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5-8% W ( thiết bị sấy thường dùng là máy sấy phun sương – có thể xem ở phần phụ lục). Trong nhiều trường hợp chế phẩm enzym α-amylase ở dạng kết tủa vẫn hoàn toàn chưa sạch về mặt hóa học vì trong đó còn chứa 1 số enzym ngoài enzym amylase ta quan tâm, chẳng hạn enzym α- amylase này còn chứa hoạt tính protase có tính acid và cellulose do đó muốn thu nhận được enzym có độ tinh khiết cao hơn ta phải tinh tiếp tục tinh sạch enzyme. Hoà tan trong dung dịch đệm Tris-HCI 0,05M ( pH 8) nhằm giúp trạng thái pH trong dung được ổn định. Thực hiện sắc kí trao đổi ion đối với dung dịch enzyme vừa hoà tan bằng cột DEAE-cellulose với mục đích loại các protein tạp kể cả các acid Nucleic khỏi enzyme. Có thể tiếp tục thực hiện tiếp lần lọc thứ hai sau lần lọc thứ nhất nhưng thay chất giá cellulose bằng chất giá Sephadex.Sau đó enzyme được tách rửa bằng NaCl nồng độ 0-0,5M. Dịch enzyme sau thu sẽ được đưa đi siêu lọc nhằm cô đặc enzyme lại. Đem enzyme đi sấy khô để được enzyme dạng bột tinh khiết.. Để nâng cao giá trị sử dụng, hiện nay người ta thường tạo ra chế phẩm enzyme gọi là enzyme không tan (hay enzym cố định).Một số phương pháp chủ yếu tạo enzyme không tan: Phương pháp hấp phụ vật lí; Phương pháp đưa enzyme vào khuôn gel; Phương pháp cộng hóa trị của enzyme và chất mang đây là phương pháp được dùng phổ biến nhất II.3. Các yếu tố ảnh hưởng khi thu nhận enzym α-amylase từ nấm mốc Aspergillus Oryzae II.3.1. Sinh trưởng và sinh tổng hợp amylase từ nấm Khi nuôi VSV tạo amylase có 2 quá trình liên quan mật thiết với nhau. Quá trình tổng hợp sinh khối VSV và quá trình tích tụ enzyme trong tế bào hoặc ngoài môi trường. Ở một số VSV, quá trình sinh tổng hợp amylase tiến hành song song với quá trình sinh trưởng, nghĩa là sự tích tụ enzyme phụ thuộc tuyến tính vào sự tăng khối. Trong trường hợp này, sinh tổng hợp enzyme amylase kết thúc ở pha logarit cùng đồng thời với sự ngưng sinh trưởng và sự bắt đầu pha phát triển ổn định tiếp theo sau.  20 Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae Tuy nhiên theo ý kiến của nhiều tác giả, sự tạo thành amylase cực đại thường xảy ra sau khi quần thể tế bào VSV đạt điểm sinh trưởng. Trong trường hợp này, sinh trưởng của VSV hầu như không kèm theo sự tích lũy enzyme amylase trong canh trường, chỉ sau khi kết thúc pha sinh trưởng mới xảy ra sự tổng hợp enzyme cực lớn. II.3.2..Các yếu tố dinh dưỡng Nguồn dinh dưỡng Nitơ hết sức quan trọng. Khi chuẩn bị môi trường dinh dưỡng để nuôi nấm mốc Asp.oryzae để tạo enzym α-amylase, người ta dùng muối vô cơ Natri Nitrat là nguồn Nitơ dinh dưỡng để nuôi nhiều loại nấm sợi tạo α-amylase. Hàm lượng thường sử dụng là 0,91%. Nari Nitrat và Amoni Nitrat có hiệu qủa hơn so với các loại muối khác ( Kali Nitrat, Magie Nitrat, Amoni Sunfat….). Cho nguồn Nitơ nhất định vào môi trường có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác .Ví dụ:Kết qủa thí nghiệm Fenikvova và cộn