Đồ án Nghiên cứu ảnh hưởng Kali và Photpho đến sự hình thành và phát triển chồi lan DendrobiumSonia trongmôi trường Murashige Skoog (MS, 1962)

eo khả năng thẩm thấu của không bào tăng lên. Điều này có thể đạt được nhờ sự tích tụ K+ gây ra sự tăng mạnh về thể tích của không bào do tính thấm. GA3 và K+ dường như có tác dụng hỗ trợ nhau trong vai trò làm tăng chiều cao cây. Sự cân bằng ion: K+ có vai trò quan trọng cho việc duy trì cân bằng ion. Nó trung hòa các anion kém linh động trong tế bào chất và rất nhiều các anion linh động trong mạch xylem, libe và không bào. Trong quá trình trao đổi nitrat, K+ có chức năng chủ yếu là vận chuyển ion NO3- qua những khoảng cách dài trong mạch xylem hoặc dự trữ trong không bào. Sau quá trình khử nitrat trong lá cây, lượng K+ còn lại được sử dụng để tổng hợp các axit hữu cơ trung hòa ion K+. các muối kali của các axit hữu cơ như kali malat được vận chuyển tới rễ, sau đó K+ có thể nhận ion nitrat ở tế bào rễ và vận chuyển chúng qua mạch xylem. Dùng K40 Olsen đã thấy trong tế bào có tới 30% K+ ở dạng liên kết với protein và các hợp chất khác. Vai trò chủ yếu của kali là điều tiết các hoạt động sống thông qua tính chất hóa lý, hóa keo của tế bào. Do K+ có khả năng làm tăng độ ngậm nước, độ phân tán nên làm giảm độ nhớt của keo nguyên sinh chất, do đó kali ảnh hưởng tích cực đến sự hấp thụ nước, vận chuyển các chất, tăng cường sử dụng lượng nước có trong mặt đất một cách có hiệu quả. Kali là một trong những kim loại có khả năng tăng tính ưa nước và khả năng giữ nước của keo nguyên sinh chất nên làm tăng lượng nước liên kết, tăng áp suất thẩm thấu, thuận lợi cho quá trình trao đổi chất. Do kali được hấp thụ nhiều qua màng tế bào nên làm tăng lượng nước liên kết, tăng áp suất thẩm thấu, thuận lợi cho quá trình trao đổi chất. Do kali được hấp thụ nhiều qua màng tế bào nên không những thuận lợi cho sự hấp thụ nước, vận chuyển các chất mà còn ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình phosphoril hóa trong quang hợp, cụ thể kali tham gia vận chuyển điện tử tạo Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ks. Nguyễn Ngọc Quỳnh SVTH: Nguyễn Hoàng Mỹ Duyên -29- ATP, NADHPH (Hartt, 1972) giúp quá trình đồng hóa CO2 tổng hợp polisacarit, protein, axit nucleic, lipit. Ta biết rằng trong quá trình tổng hợp các chất trên rất cần ATP và NADPH. Hình 1.1: Ảnh hưởng của kali đối với thực vật. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ks. Nguyễn Ngọc Quỳnh SVTH: Nguyễn Hoàng Mỹ Duyên -30- 1.3.2.Phosphore: Phosphore là nguyên tố hóa học thuộc nhóm V trong bảng tuần hoàn các nguyên tố hóa học Mendeleev, có số thứ tự 15. khối lượng nguyên tử bằng 30,97. trong các đồng vị của P đồng vị P32 là quan trọng nhất, được dùng làm nguyên tử đánh dấu trong các nghiên cứu khoa học khác nhu. Chu kỳ bán hủy của P32 là 14,5 ngày. Hàm lượng P trong vỏ Trái Đất là 0,8% tính theo khối lượng, P dễ bị oxi hóa nên không ở trạng thái tự do. Trong đất, P chiếm 0,02% - 0,2% tùy theo loại đất. Cơ thể thực vật sử dụng P dưới dạng muối của axit phosphoric. Bản chất của sự biến đổi các hợp chất P trong cơ thể là các gốc axit tham gia vào thành phần một chất hữu cơ nhất định bằng quá trình phosphoril hóa và sau đó truyền cho các chất khác ( bằng cách chuyển phosphoril hóa). Bằng con đường đó cơ thể đã tạo thành tất cả các chất chứa P cần thiết cho sự sống. Các hợp chất P gặp trong cơ thể thực vật khác nhau về bản chất hóa học, cũng như về chức năng sinh lý. Có thể chia làm 5 nhóm các hợp chất P như sau: - Nhóm nucleotit ( bao gồm AMP, ADP, ATP). Các nucleotic đóng vai trò rất quan trọng trong các quá trình cố định, dự trữ và chuyển hóa năng lượng, đồng thời chúng tham gia vào tất cả các quá trình biến đổi và sinh tổng hợp các cabohydrate, lipit, protein, cũng như quá trình trao đổi axit nucleic trong cơ thể thực vật. - Hệ thống Coenzim. Hệ thống này đóng vai trò to lớn trong việc tạo thành các hợp chất và năng lượng trong các quá trình hô hấp và quang hợp. Liên quan với chúng có CoI (NAD), CoII (NADP). - Các axit nucleic và các nucleoprotein. Nhóm này liên quan với quá trình sinh tổng hợp protein, các quá trình sih trưởng và phát triển của thực vật. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ks. Nguyễn Ngọc Quỳnh SVTH: Nguyễn Hoàng Mỹ Duyên -31- - Các poliphosphate. Chúng có thể phosphoril hóa ARN và có thể coi chúng là các hợp chất cao năng giống như ATP. Thực vật cần các poliphosphate này để hoạt hóa ARN trong quá trình sinh tổng hợp protein và axit nucleic. - Các estephosphate của các loại đường (như hexozo – P). chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi cacbohydrat. P được dùng trong nuôi cấy là NaH2PO4.7H2O, KH2PO4. Trong môi trường nuôi cấy, P được cung cấp dưới dạng mono hay dihydrogenphosphate hóa trị I và II có thể chuyển đổi lẫn nhau tùy thuộc vào độ pH. Ion H2PO4- chiếm ưu thế ở pH < 7 mà đây là đặc tính của hầu hết các môi trường nuôi cấy mô thực vật và cũng là ion dễ được thực vật hấp thụ nhất (Devlin, 1975). Trong các môi trường nuôi cấy trước đây, tất cả (Bouharmont, 1961) hoặc một phần (Vacin và Went, 1949) P được cung cấp dưới dạng Phosphate hòa tan hạn chế. P được cung cấp dần dần từ các hợp chất này. Nồng độ của phosphate hòa tan cao trong môi trường sẽ làm giảm sự tăng trưởng của mô, có thể là do calcium và một số nguyên tố vi lượng bị kết tủa trong môi trường hoặc bị giảm hấp thu vào trong mô. Nồng độ ion phosphate được cho vào môi trường nuôi cấy cao nhất là 18,9 mM, trung bình là 1,7 mM và hầu hết các loại môi trường đều chứa phosphate khoảng 1,3 mM. Tuy nhiên, cũng tùy theo mục đích nuôi cấy mà nồng độ phosphate trong môi trường có khi rất thấp. Phosphore ở dạng HPO42- được hấp thụ nhờ hệ thống rễ của thực vật và ngược lại với nitrat, sunfat, nó không bị khử. Nó có thể có mặt trong thực vật dưới dạng P vô cơ hoặc dạng hợp chất este (R-O-P). Vùng dự trữ P (phosphate): trong tế bào bao gồm hai vùng dự trữ phosphat khác nhau. Vùng trao đổi, chủ yếu là dạng P vô cơ, nằm trong không bào. Nếu ngừng cung cấp P cho cây, nồng độ giảm chậm hơn nhiều. Khi tăng cường cung Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ks. Nguyễn Ngọc Quỳnh SVTH: Nguyễn Hoàng Mỹ Duyên -32- cấp P, nồng độ P chứa trong các cơ quan của tế bào cũng tăng theo, tuy nhiên khi tăng quá mức bình thường thì chỉ có P vô cơ trong không bào tăng lên. Vì vậy có thể nói, P dư thừa được dự trữ ở không bào dưới dạng P vô cơ. Hình 1.2: Ảnh hưởng của Phosphore đối với thực vật. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ks. Nguyễn Ngọc Quỳnh SVTH: Nguyễn Hoàng Mỹ Duyên -33- Các enzym: P vô cơ cũng có khả năng điều chỉnh tốt trong nhiều quá trình trao đổi chất của thực vật. Vậy nên sự phân bố P là cần thiết để điều chỉnh quá trình trao đổi chất của tế bào. Ơû cà chua, sự giảm P vô cơ ở không bào trong tế bào chất kích thích hoạt tính của enzym phosphofructokinaza. Enzym này là enzym quan trọng trong sự phân giải cơ chất của phản ứng thủy phân glyco và làm tăng sự hô hấp của tế bào trong quá trình chín. Cũng trong thời gian này, sự thiếu hụt P có thể làm chậm quá trình chín của quả. Trong quá trình tổng hợp tinh bột của lục lạp, P cũng đóng vai trò quan trọng. Chỉ với nồng độ thấp, P vô cơ đã có thể gây ức chế quá trình tổng hợp tinh bột. Sự cân bằng giữa các hợp chất có chứa P là rất quan trọng trong điều hòa tổng hợp tinh bột ở lục lạp. Ngoài ra, P vô cơ cũng tham gia quá trình này theo một con đường khác. Các phân tử vận chuyển phosphate ở màng tế bào sẽ mang P vô cơ vào tế bào và các triosephosphate ra ngoài tế bào, làm nồng độ P vô cơ trong lục lạp tăng, triosephosphat giảm. Điều này lại tác động đến quá trình tổng hợp tinh bột. Ribuloza biophossphat (RuBP), với vai trò như một chất nhận CO2, là hợp chất quan trọng trong sự cố định CO2. sự tái tổng hợp này đòi hỏi phải có các triosephosphate ra khỏi lục lạp, gây thiếu hụt các chất này, do đó làm kìm hãm quá trình cố định CO2. Ngoài ra, phosphore còn quan trọng trong việc điều khiển hoạt động của nhiều enzym khác. Nồng độ Phosphore tối ưu cho sự sinh trưởng của thực vật là 0,3 – 0,5 g/kg trọng lượng khô. Sự thiếu P làm cây chậm lớn, lá cây có màu xanh thẫm do trong thời gian bị thiếu P, sự phát triển của lá chậm hơn sự tổng hợp diệp lục tố nên làm tăng nồng độ diệp lục tố trong lá cây. Vì vai trò của P quan trọng như vậy, nên khi thiếu P cây có những biểu hiện rõ rệt về hình thái bề ngoài, cũng như về năng suất thu hoạch. Đối với những cây họ Lúa, thiếu P lá mềm yếu, sự sinh trưởng của rễ và toàn cây, sự đẻ nhánh, phân cành kém. Lá cây có màu xanh đậm, lá cây có màu xanh đậm do sự thay đổi tỉ lệ clorophin a và b. Ở những lá già thì đầu mút của lá có màu đỏ, thân cũng có màu Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ks. Nguyễn Ngọc Quỳnh SVTH: Nguyễn Hoàng Mỹ Duyên -34- đỏ, thân cũng có màu đỏ. Hàm lượng protein trong cây giảm, trong khi đó hàm lượng nitơ lại tăng. Biểu hiện triệu chứng ở lá già trước. Đối với cây ăn quả, khi thiếu P thì tỷ lệ đậu quả kém, quả chín chậm và trong quả có hàm lượng axit cao. 1.4. THÀNH PHẦN VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY: Môi trường nuôi cấy bao gồm các khoáng vô cơ, các chất hữu cơ như chất điều hòa sinh trưởng thực vật, vitamin, đường, nước dừa, nấm men, khoai tây,… trong đó, các khoáng vô cơ là quan trọng nhất trong các thành phần môi trường nuôi cấy. 1.4.1. Các khoáng vô cơ 1.4.1.1. Tầm quan trọng của các khoáng vô cơ đối với mô tế bào thực vật a. Khoáng đa lượng Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật không khác nhiều so với cây trồng trong tự nhiên. Trong nhóm này gồm 3 nguyên tố chính: N, P, K. Đạm (N) giữ vai trò tạo lập protein cho cây, giúp hình thành cơ quan, thân lá rễ phát triển, quang tổng hợp mạnh. Thiếu đạm cây màu nhợt nhạt, ốm yếu, cây sinh trưởng kém, cằn cỗi… Để cung cấp nguồn đạm ta dùng những chất sau: - CO(NH2)2 : Urê (46% N) - (NH4)2SO4 : Sulfat ammonium (22% N). - KNO3 : Nitrat kali (14% N). - NH4NO3 : Nitrat ammonium (34% N). - NaNO3 : Nitrat natri (16,4% N). - Ca(NO3)2 : Nitrat calci. (15,5% N). Lân (P): giúp cây hô hấp và quang hợp, tạo sự hấp thu đạm được dễ dàng. Lân giúp cây ra hoa, ra rễ, kích thích ra hoa, làm hoa bền ít rụng… Các chất có thể cung cấp lân: - Super Lân (20% P2O5) Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ks. Nguyễn Ngọc Quỳnh SVTH: Nguyễn Hoàng Mỹ Duyên -35- - (NH4)2HPO4 : Diamonium phosphat DAP (46% P2O5) - (NH4)3 HPO4.3H2O : Trianium phosphat (15,21% P) - KH2 PO4 : Phosphate kali (10,35% P) Kali (K): Tạo các bó mạch trong cây, giúp cây cứng cáp, chắc, đứng thẳng, giúp cây ra hoa… Các chất cung cấp kali như: - KCl : Clorua kali (60% K2O). - K2SO4 : Sulfat kali (48% K2O). - KNO3 : Kali natri (44% K2O). - KH2PO4 : Phosphate (40% K2O). b. Nhóm trung lượng: Gồm các nguyên tố: Ca, Mg, S. Calcium (Ca): tạo vách tế bào, giúp cây cứng chắc,… Các chất cung cấp Ca như: CaCl2 (Calci Clorua), Ca(NO3)2 (Calci nitrat). Đối với các chất chứa Ca không nên hòa tan với các chất khác vì dễ gây kết tủa, cây không hấp thu hiệu quả. Cây thừa Ca sẽ hấp thu đạm nhiều trở nên quá mập, tàn lá rợp xuống, dễ bị gãy. Thiếu Ca cây ít hấp thu đạm làm cho cây không phát triển rễ, lá nhỏ lại, cây ốm yếu không đứng thẳng được. Magnesium (Mg): thành phần tạo nên diệp lục tố cho cây, làm lá cây phát triển, lá xanh. Có thể dùng MgSO4 hay MgHPO4 để cung cấp Mg cho cây. Nếu dư Mg lá sẽ có màu xanh đặm nhưng đọt non lại bị khô héo. Thiếu Mg bộ rễ sẽ phát triển to, mập nhưng thân lá lại èo uột, không cân đối giữa rễ và thân lá. Sulfur (S): là thành phần của tế bào chất giúp cây tăng trưởng. Thường S có chứa sẵn trong các chất có gốc SO4 như: K2SO4, MgSO4,… Thiếu S thì cây lan cằn cõi, lá bị vàng như bị thiếu đạm, cây trở nên èo uột, ốm yếu. c. Nhóm vi lượng Nhóm này rất cần thiết cho lan mặc dù lan cần rất ít (không quá 5mg/lít). Một số nguyên tố vi lượng như: Bo, Zn, Cu, Mo,Mn, Fe… Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ks. Nguyễn Ngọc Quỳnh SVTH: Nguyễn Hoàng Mỹ Duyên -36- Sắt (Fe): đóng vai trò tạo diệp lục tố, giúp cây quang tổng hợp tốt, làm cho lá cây có màu xanh. Thiếu sắt làm lá cây có màu xanh lợt, cây không quang hợp tốt, cây ngừng phát triển, đầu rễ kém phát triển có thể dùng FeEDTA để cung cấp Fe cho cây. Đồng (Cu): thiếu đồng dễ làm ngọn lá khô, cây không phát triển, ra chồi nhiều ở dưới gốc. Lá bạc tái mất màu xanh và đầu lá đốm trắng rồi khô héo. Dùng CuSO4 để cung cấp cho cây. Kẽm (Zn): Zn giữ vai trò sản sinh tổng hợp protein và auxin. Thiếu Zn làm thân ngắn lại, lá mọc chụm ở đầu. Nguyên nhân là do tưới thúc phân lân quá nhiều để kích thích ra hoa. Có thể dùng ZnSO4 để cung cấp Zn cho cây, đồng thời giảm tưới lân. Mangan (Mn): thiếu mangan lá vàng nhạt, ở lá già thường có chấm vàng. Dùng MnSO4 để cung cấp Mn cho cây. Molyden (Mo): điều hòa tăng trưởng của cây. Có thể dùng Na2MoO4 (Molypdat Natri) để cung cấp Mo cho cây. 1.4.1.2. Các môi trường nuôi cấy thông dụng Thành phần và nồng độ các khoáng vô cơ có thể khác nhau tùy thuộc các loại môi trường khác nhau, cụ thể được nêu trong bảng 1.2. Bảng 1.2. Thành phần các khoáng vô cơ trong một số môi trường thông dụng MS: Murashige và Skoog (1962); White (1963); B5: Gamborg (1968); N6: Nitsch and Nitsch (1969); WP: Lloyd and McCown (1980). mg/l môi trường Hóa chất MS White B5 N6 WP H4NO3 (NH4)SO4 MgSO4.7H2O KCl 1650 370 720 65 134 246 463 185 400 370 Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ks. Nguyễn Ngọc Quỳnh SVTH: Nguyễn Hoàng Mỹ Duyên -37- KNO3 KH2PO4 K2SO4 NaH2PO4.H2O Na2SO4 CaCl2.2H2O Ca(NO3)2.4H2O Na2EDTA.2H2O FeSO4.7H2O Fe2(SO4)3 H3BO3 CoCl2.6H2O CuSO4.5H2O MnSO4.H2O MnSO4.4H2O MoO3 Na2MoO4.2H2O KI ZnSO4.7H2O 1900 170 440 37,3 27,8 6,2 0,025 0,025 16,9 0,25 0,83 8,6 80 19 200 300 2,5 1,5 0,001 7 0,0001 0,75 3 2528 150 150 37,2 27,8 3 0,025 0,025 10 0,25 0,75 2 2830 400 166 37,2 27,8 1,6 4,4 0,8 1,5 170 990 96 556 37,2 27,8 6,2 0,25 22,3 0,25 8,6 Trong đó, môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) được sử dụng phổ biến nhất (theo Smith và Gould) và thành phần các khoáng vô cơ của môi trường này được áp dụng cho thí nghiệm của đề tài này. Các vitamin rất cần thiết cho sự phát triển và tăng trưởng của thực vật. Vitamin thường có chức năng xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Các vitamin thường dùng trong nuôi cấy mô là Thiamine (vitamin B1), acid nicotinic (B3), Pyridoxine (B6) và Myo- inositol, B5, B12. 1.4.3. Các chất điều hòa sinh trưởng Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ks. Nguyễn Ngọc Quỳnh SVTH: Nguyễn Hoàng Mỹ Duyên -38- Tùy thuộc vào mục đích nuôi cấy mà loại và liều lượng sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác nhau. Trong nuôi cấy mô thực vật có các nhóm chất điều hòa quan trọng là auxin, cytokinin, gibberellin, acid abscisic và ethylen. Nhóm auxin (gồm IAA, NAA, IBA,..) chủ yếu được sử dụng để kích thích sự phân bào và tạo rễ. Ở liều lượng cao, auxin thường gây nên các đột biến. Nhóm cytokinine (gồm kinetin, BA, zeatin,..) đẩy nhanh sự phân chia tế bào, sự nhân chồi và sự phát triển chồi. 1.4.4. Hydrate carbon (đường) Khi được nuôi cấy in vitro, thường thì các tếâ bào thực vật không có khả năng quang hợp nên nó đòi hỏi phải cung cấp nguồn carbon cho các hoạt động biến dưỡng của tế bào. Nguồn carbon bổ sung vào môi trường nuôi cấy thường dưới hai dạng đường là glucose và sucrose. Các nguồn carbonhydrate khác cũng được tiến hành thử nghiệm như lactose, galatose, rafinose, maltose và tinh bột nhưng các nguồn carbonhydrate này có hiệu quả kém hơn so với glucose và sucrose. Đường có thể bị caramel hóa nếu bị hấp khử trùng quá lâu (Peer, 1971 và Ball, 1953) và sẽ ức chế phản ứng với các hợp chất amino (phản ứng Millard). Sự caramel hóa xảy ra khi đường bị đun nóng, thoái biến và hình thành melanoidin, một chất sẫm màu và có phân tử lượng cao, ức chế sự phát triển của tế bào. 1.4.5. Một số yếu tố khác trong môi trường nuôi cấy mô lan 1.4.5.1. Các chất hấp thụ phenol Khi phát triển phương pháp nuôi cấy mô để nhân giống, vấn đề thường gặp nhất ở 1 số loài lan là hàm lượng phenol tiết ra từ mô nuôi cấy quá cao, phenol sẽ khuếch tán vào môi trường, làm oxy hóa các chất trong môi trường, gây độc cho mô nuôi cấy, kết quả là mẫu cấy sẽ bị hóa nâu và chết (Morel, 1974; Flamee và Boesman, 1977; Fast, 1979). Nhiều phương pháp loại trừ chất tiết này và đặc biệt là các sản phẩm oxy hóa của chúng được thực hiện, chẳng hạn như dùng chất chống oxy hóa, enzym ức Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ks. Nguyễn Ngọc Quỳnh SVTH: Nguyễn Hoàng Mỹ Duyên -39- chế phenol, polyvinylpyrrolidone (PVP), than hoạt tính, và nhiều loại chất hấp thụ khác. Hầu hết các phương pháp này đều kèm với việc cấy chuyền mẫu sau 2 – 3 tuần sang môi trường mới. Đối với nuôi cấy mô lan trong môi trường lỏng thường bổ sung chất PVP. Sử dụng than hoạt tính là biện pháp thường được sử dụng trong nuôi cấy mô thương mại. Khi bổ sung than hoạt tính ở nồng độ xác định và môi trường nuôi cấy mô các hợp chất phenol trong môi trường sẽ được loại bỏ, giúp mô sinh trưởng tốt (Arditti và Ernst, 1993; Park và cộng sự, 2000). 1.4.5.2. Nước dừa và các dịch chiết khác Nước dừa là nguồn cung cấp đạm dồi dào do thành phần chứa nhiều acid amin, acid hữu cơ. Ngoài ra, nước dừa còn chứa nhiều carbohydrate như sucrose, glucose và fructose. Môi trường chứa auxin và 10 – 20% nước dừa giúp sự phân chia của các tế bào thân đã phân hóa (sự tạo mô sẹo). Người ta tìm cách xác định bản chất hóa học của chất có hoạt tính trong nước dừa nhưng phải sau khi khám phá ra cytokinine vài năm, nước dừa mới được chứng minh chứa zeatin (Letham, 1974). Khi nuôi cấy phôi lan, nước dừa thường được sử dụng để giúp phôi tăng trưởng và nảy mầm (Hegarty, 1955; Niimoto và Sagawa, 1961). Với Dendrobium, nước dừa không ảnh hưởng lên sự nảy mầm của phôi nhưng ức chế sự tăng trưởng của phôi ở các giai đoạn đầu nảy mầm (Kotomori và Murashige, 1965). Một số trường hợp khác, phôi Phalaenopsis lại tăng sinh mô sẹo và chậm phát sinh cơ quan khi bổ sung nước dừa vào môi trường (Ernst, 1967b). Bên cạnh đó, nước chiết cà chua là cũng một nguồn dinh dưỡng tốt cho phôi lan nảy mầm và tăng trưởng (Meyer, 1945c; Vacin và Went, 1949; Griffith và Link, 1957). Tác dụng kích thích tăng trưởng của nước cà chua được thấy rõ ở phôi Cattleya Sudan x C. percivaliana, các phôi tăng trưởng giới hạn và biệt hóa thành cơ quan, tạo cụm mô phân sinh và tăng sinh bình thường. Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ks. Nguyễn Ngọc Quỳnh SVTH: Nguyễn Hoàng Mỹ Duyên -40- Các nhà trồng lan chuyên nghiệp còn sử dụng nhiều loại dịch chiết khác như dịch chiết gỗ bulô (Zimmer và Pieper, 1976), dịch chiết bò, dịch chiết lúa mì, lúa mạch, cà rốt, nấm men, khoai tây, nấm đảm, peptone và nhiều loại nước trái cây khác (Knudson, 1922; Lami, 1927; Curtis, 1947b; Mariat, 1952; Withner, 1953). Nhưng đáng tiếc là hiệu quả tác dụng của các loại dịch chiết dinh dưỡng này lên sự tăng trưởng của phôi vẫn chưa được biết rõ, có thể trong thành phần các dịch chiết này chứa một số hợp chất kích thích tăng trưởng giúp cho sự phát triển bình thường của phôi. Vì phôi lan có nhu cầu đặc biệt về nguồn đạm, do vậy có thể các thành phần đạm trong dịch chiết có tác dụng kích thích sự tăng trưởng của phôi. 1.4.5.3. Ảnh hưởng của pH Độ pH hầu hết được chỉnh ở 5,6 – 5,8 trước khi hấp khử trùng. Độ pH ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của các ion trong môi trương khoáng, khả năng đông tụ agar và sự tăng trưởng của tế bào. Murashige vàø Skoog (1962) nhận thấy rằng độ pH 5,7 – 5,8 thích hợp để duy trì sự hòa tan các chất khoáng trong môi trường MS. pH của môi trường thường giảm từ 0,6 – 1,3 đđơn vị sau khi hấp khử trùng (Sarma et al., 1990). Arditti (1967) đã tóm tắt ảnh hưởng của pH lên sự tăng trưởng của một số phôi lan. Đối với phần lớn các giống nghiên cứu thì pH khoảng 5 đến 6 là phù hợp. Nồng độ H+ trong môi trường dường như quyết định vào thời điểm nảy mầm của phôi, vì sau khi nảy mầm pH môi trường thấp hơn vẫn không gây độc cho sự tăng trưởng (Knudson, 1951). Tuy nhiên có quá nhiều môi trường khác nhau được sử dụng để nuôi cấy phôi, do vậy ảnh hưởng của pH lên sự tăng trưởng của phôi lan vẫn chưa được khẳng định rõ ràng. 1.5. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 1.5.1. Nghiên cứu sự ảnh hưởng của Phosphore đến quá trình phát triển của thực vật Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ks. Nguyễn Ngọc Quỳnh SVTH: Nguyễn Hoàng Mỹ Duyên -41- Sự hấp thu phosphate tùy thuộc vào loài thực vật và thường không thay đổi và tương ứng với sự tăng trưởng của mẫu cấy đã được ghi nhận. Phosphate trong môi trường nuôi cấy không đủ cung cấp cho huyền phù tế bào Cardamine pratensis, lượng phosphate này chỉ đủ cho tế bào hấp thu trong 5 ngày, tuy nhiên, nồng độ này hoàn toàn đủ với huyền phù tế bào Silene alba (Bister – Miel và cộng sự, 1985). Phosphate trong môi trường nuôi cấy cũng không đủ cho nhu cầu của một số loài thực vật khi cấy quá nhiều mẫu trên một lượng môi trường có hạn, và lượng phosphate này sẽ được hấp thu hết trong vòng vài tuần lễ (Barroso và cộng sự, 1985; Shingha và cộng sự, 1987; Lumsden và cộng sự, 1990). Trong một số trường hợp nuôi cấy, khi tăng nồng độ phosphate lên đến 1,86 mM lại có lợi cho sự tăng trưởng của mẫu cấy (Jones và Murashige, 1974); 2,48 mM (Murashige và cộng sự, 1972; Murashige, 1974; Jakobek và cộng sự, 1986); 3,1 mM (Miller và Murashige, 1976) hoặc 3,71 mM (Thorpe và Murashige, 1968; 1970). Ví dụ như để cảm ứng sự tạo chồi bất định từ mô sẹo hoặc làm tăng tốc độ nhân chồi trong môi trường nuôi cấy chồi. Do Phosphore ảnh hưởng đến quá trình tạo protein, axit nucleic… (các hợp chất hữu cơ ưa nước) nên Phosphore có khả năng làm tăng hàm lượng nước liên kết keo nhờ vậy mà tăng khả năng trao đổi nước (Alecseev và Gusev, 1954) P có khả năng tăng tính chống chịu của thực vật (chịu hạn, chịu nóng, chịu rét …) vì vậy P không chỉ ảnh hưởng đến tốc độ mà cả chiều hướng quá trình trao đổi chất. Cây trồng rất mẫn cảm với Phosphore, thiếu Phosphore sẽ ảnh hưởng lớn đến năng suất và phẩm chất sản phẩm đối với cây ăn quả thiếu Phosphore sẽ ảnh hưởng đến sự lớn lên của quả, nở hoa, chín của quả (bị ức chế) (theo Penningfield và Kuzmann-1966/1967). Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ks. Nguyễn Ngọc Quỳnh SVTH: Nguyễn Hoàng Mỹ Duyên -42- 1.5.2. Nghiên cứu sự ảnh hưởng của Kali đến quá trình phát triển của thực vật Sự