Đồ án Nghiên cứu khả năng đáp ứng phát sinh hình thái của lát mỏng tế bào phát hoa đồng tiền (gerbera jamesonii) trong điều kiện in vitro

ng thường để loại bỏ vi sinh vật được. Để giải quyết vấn đề này, đầu tiên người ta sử dụng các chất khử trùng. Nhằm tăng cường hiệu quả khử trùng, người ta thường rửa sơ mô cấy với xà phòng để loại bỏ bụi đất và gia tăng sự tiếp xúc với các chất khử trùng hoặc sử dụng dung dịch Tween-20 như là chất hoạt động bề mặt. Sau khi khử trùng phải rửa sạch mẫu cấy bằng nước cất vô trùng 3 - 5 lần. e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 16 - Một số chất khử trùng thường sử dụng như: 9 Chlorur thủy ngân (HgCl2): Là chất khử trùng rất hiệu quả, thường dùng với lượng rất thấp từ 0,01% - 0,05%, chất này rất khó đào thải, vì vậy cần cẩn thận khi tiếp xúc. 9 Sodium hypochlorite NaOCl: Có trong các dung dịch tẩy trắng 5 - 20% (v/v). Thời gian khử trùng từ 5 – 30 phút, sau đó rửa sạch bằng nước cất vô trùng 3 – 5 lần. Chất này ngấm vào trong mô thực vật, làm cản trở sự tăng cường của mô về sau. 9 Calcium hypochlorite Ca(OCl)2: Nồng độ khoảng 5 – 10% (v/v), xử lý mô cấy từ 5 – 30 phút. 9 Ethyl hay isopropyl alcohol 70% (v/v): Thường sử dụng để lau sạch các vật liệu nuôi cấy trước khi khử trùng hoặc dùng để ngâm nguyên liệu trước hoặc sau khi xử lý với NaOCl hoặc Ca(OCl)2 trong khoảng 1 -5 phút. 9 Nước oxy già (H2O2): Là một chất oxy hóa cực mạnh, có thể sử dụng ở nồng độ 3 – 10% trong 1 – 30 phút trước khi rửa bằng nước cất vô trùng khi sử dụng. Sự kết hợp giữa NaOCl và H2O2 là rất độc với mô thực vật, do đó phải rửa thật sạch. 9 Khí Clo (Cl2): Thường được sử dụng nhiều trong khử trùng hạt khô. 9 Sodium dichloroisocyanurate (NADCC): Chất này ít độc đối với mô thực vật, không cần rửa lại mẫu cấy bằng nước cất vô trùng sau khi xử lý bằng chất này. 2.2. Kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào 2.2.1. Giới thiệu Những biểu hiện về cơ chế kiểm soát quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật là những kiến thức cơ bản được áp dụng rỗng rãi. Để phân tích những cơ chế này, chúng ta cần thiết lập một chương trình biệt hóa cho một mẫu thí nghiện có sẵn trong nuôi cấy in vitro trước khi cố gắng giải thích câu hỏi: làm thế nào để một chương trình biệt hóa được thực hiện, ví dụ như trong cơ thể thực vật. e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 17 - Từ giai đoạn phôi đến giai đoạn trưởng thành, sự biệt hóa tế bào thực vật trải qua nhiều sự kiện liên kết với nhau, và cuối cùng tạo thành những hình dạng, chức năng, cấu trúc phức tạp. Tất cả các sự kiện này xảy ra trong một mối liên quan hệ thống rất nhạy cảm với các nhân tố môi trường. Những tác động này thống nhất trên toàn bộ cơ thể sinh vật. Tuy nhiên, trong đó những hiểu biết hết về sự kích thích, tiến trình, vận chuyển của chúng đến các tế bào đích không thể dùng để nghiên cứu, mặc dù hiện nay những kỹ thuật về sinh học phân tử rất mạnh. Các khái niệm về mạng lưới ức chế, trong đó sự tăng trưởng, phát triển và lão hóa bắt nguồn từ mối tương quan có thể điều chỉnh giữa: i) cơ quan, mô, tế bào, ii) các cụm tế bào khác nhau, iii) các bào quan trong tế bào đâ đưa GS. K. Trần Thanh Vân đến với khái niệm hệ thống lớp mỏng tế bào (TCL) vào đầu những năm 70 thế kỷ XX. Với hệ thống này SG. K. Trần Thanh Vân cố gắng tách một hoặc một vài lới trong tế bào; và cố gắng chương trình hóa lại chúng trong nuôi cấy in vitro, trong đó “biệt hóa” là một tiêu chí quan trọng. Tất cả các quá trình biệt hóa đó được kiểm soát một cách riêng biệt hoặc tái chương trình hóa theo trình tự thời gian hoặc không gian tùy theo người nghiên cứu và không bị áp đặt bởi quá trình phát triển cá thể. 2.2.2. Định nghĩa hệ thống lớp mỏng tế bào Hệ thống lớp mỏng tế bào – thin cell layer – TCL bao gồm các mẫu cấy có kích thước nhỏ được cắt ra từ những bộ phận khác nhau của thực vật (thân, lá, rễ, phát hoa, các bộ phận của hoa, lá mầm, phôi). Nếu mẫu cấy được cắt theo chiều dọc được gọi là lTCL, nếu được cắt theo chiều ngang gọi là tTCL. Các lTCL (1 mm x 0,5 hay 10 mm) chỉ chứa một loại mô như lớp đơn của tế bào biểu bì hoặc một vài lớp (3 – 6 lớp) của tế bào vỏ, ngược lại các tTCL (dày khoảng 0,2/0,5 mm đến vài mm) bao gồm một số tế bào thuộc các mô khác nhau (mô biểu bì, mô vỏ, thượng tầng, mô ruột hay tế bào nhu mô) (Tran Thanh Van và Gendy, 1996). tTCL và lTCL có đặc điểm chung là mỏng. Đặc điểm mỏng đóng vai trò quan trọng vì các phân tử đánh dấu sự biệt hóa có thể định vị in situ ở những tế bào đích hay những tế bào đáp ứng. Quá trình định vị này cho phép giới hạn các tế bào cảm ứng không mong muốn (Tran Thanh Van, 2002). e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 18 - Khi cắt mẫu, mô thực vật bị tổn thương, nhiều enzyme hoặc các polysacharide sinh ra rất cần cho quá trình cảm ứng sự sinh trưởng và phát triển của thực vật (Tran Thanh Van và Mutaftschiew, 1990). Lý do cơ bản của việc ứng dụng một vài tế bào trong hệ thống TCL là chúng có mối liên hệ mật thiết với các tế bào bị thương (nơi xảy ra tổng hợp cấu tạo vách tế bào mới và nơi phóng thích của oligosacharide) và chất dinh dưỡng cùng các yếu tố khác bên tong môi trường để “kiểm soát” sự phát sinh hình thái. Tuy nhiên, cũng bởi vì lý do đó có thể nói chúng khá phụ thuộc vào môi trường, lát mỏng có ưu điễm là đồng nhất, nên dễ phản ứng một các đồng nhất với môi trường. Ngược lại các mẫu cấy lớn hơn (như thân hoặc các mảnh lá) cho thấy sự phân cực mạnh trong phản ứng với môi trường và có thể chứa các hợp chất nội sinh cao hơn, bao gồm các chất sinh trưởng thực vật nên chúng không phụ thuộc nhiều vào môi trường. Một hệ thống đa bào như hệ thống TCL được định nghĩa như tre6nmang những tổ chức không gian và thời gian cố hữu. Khác với khi sử dụng một tế bào tách ra hay tế bào trần, sau khi tách chúng tạo nên vách tế bào và hình thành nên cụm tế bào mới với tổ chức không gian và thời gian khác biệt với sự tổ chức trước khi tiến hành quá trình tách ra từ mô hay cơ quan cho. Hơn nữa hầu hết các trường hợp trong quá trình phát triển của tế bào đơn hay tế bào trần có sự hình thành mô sẹo, phôi sinh dưỡng trộn lẫn tế bào không phải là phôi như các tế bào ống và rễ. Ngược lại, hệ thống TCL có sự hình thành phần đó với số lượng lớn hơn. Không nhữ chúng được tiếp xúc trực tiếp với môi trường mà còn được chương trình hóa một cách riêng biệt hoặc kết hợp tương ứng với không gian và thời gian (Tran Thanh Van, 1973). Việc giản số lượng tế bào trong phương pháp lớp mỏng tế bào có ý nghĩa quan trọng vì ảnh hưởng đến quá trình phát triển hoặc các chương trình biệt hóa mô, cơ quan. Bên cạnh đó, khoảng thời gian để quá trình phát sinh hình thái xuất hiện tương đối ngắn (trung bình khoảng sau 14 ngày sau khi cấy). Tần suất cũng khá cao, gần 100% mẫu có phản ứng. Như trên mẫu lTCL của cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) có kích cỡ 1 x 10 mm bao gồm 3 – 6 lớp tế bào biểu bì và được thu nhận từ cánh hoa, các cơ quan sau đây đươc biệt hóa trực tiếp trên bề mặt TCL (mà không e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 19 - trài qua quá trình mô sẹo trng gian): i) 50 hoa trong chương trình hoa, ii) 500 -700 chồi trong chương trình chồi, iii) 15-20 rễ trong chương trình rễ. Các tính chất mong muốn khác có được trong phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào là sự đồng nhất về sinh lý, di truyền, và có thể ứng dụng phương pháp này cho mọi thực vật. Tuy nhiên điều kiện môi trường lý tưởng phù hợp cho sự tồn tại của mẫu TCL còn phụ thuộc vào loài và phải thử nghiệm lại tất cá các điều kiện in vitro gồm chất dinh dưỡng, chất điều hòa sinh trưởng, ánh sáng, nhiệt độ (Tran Thanh Van, 1980). 2.2.3. Một số nghiên cứu ứng dụng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu để ứng dụng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào trên các đối tượng như cây lương thực, ngũ cốc và dược liệu. Amaranthus edulis Là cây hai lá mầm C4 rất quý, thuôc họ Amaranthaceae. Hạt của cây được quan tâm rất nhiều do có chừa hàm lượng protein (16 – 18%) và lysin cao. Các nghiên cứu liên quan đến tái sinh chồi in vitro đối với nhiều loài đã được báo cáp trên mô sẹo xuất phát từ mặt lá, trụ dưới lá mầm, cuống lá, thân,phát hoa và cả thân cây Amaranthus. Tuy nhiên, thời gian trung bình cần để tái sinh chồi khoảng 4 – 6 tuần và tần số tái sinh rất thấp đối với các kiểu di truyền được thí nghiệm (Bagga và cộng sự, 1987). Trong một nỗ lực để thu được tần số tái sinh cây cao hơn trong một thời gian ngắn đối với cây A. edulis, Bui và cộng sự (1998) đã sử dụng hệ thống nuôi cấy TCL để cảm ứng biệt hóa chồi in vitro. Chỉ sau một tuần nuôi cấy, 100% mẫu cấy tTCL từ rễ, lá mầm và trụ dưới đều hình thành mô sẹo dạng bở và xốp. 100% mẫu cấy tTCL được cắt từ ngọn và vùng có sự tái sinh chồi trực tiếp không thông qua mô sẹo. Beta vulgaris L. Có nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng để nhân giống in vitro đối với cây củ cải đường. Sự hình thành chồi nách từ đỉnh chồi của cây con (Hussey và Hepher, 1978) và sự phát triển của chồi nách từ các phân đoạn thể phát hoa e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 20 - (Saunden, 1982) là hai phương pháp thường được sử dụng để tạo ra một số lượng lớn chồi. Kỹ thuật TCL đối với cây củ cải đường là một phương pháp tỏ ra rất hiệu quả trong việc nghiên cứu phát sinh hình thái và vi nhân giống (Dectrez và cộng sự, 1988). Brassica napus Brassica napus (cây cải dầu) khá phổ biến trong việc nghiện cứu nuôi cấy mô mở rộng. Klimaszewska và keller (1985) đã tiến hành thí nghiệm với các lát mỏng TCL bao gồm biểu bì và lớp tế bào cận biểu bì được cắt dọc theo lóng thân cây. Chồi có thể được phá hiện ở một đầu cuối cảu mẫu cấy sau 12 – 15 ngày. Hệ thống nuôi cấy này có khả năng tạo ra tần số tái sinh chồi và số lượng chồi trên mỗi mẫu cấy cao. Hơn nữa, nguy cơ nhiễm vi sinh vật của mẫu cấy cũng không còn là một vấn đề nghiêm trọng. Lupinus mutabilis và lipinus albus Đậu lupin là cây trồng quan trọng giúp khắc phục vấn đề thiếu hụt protein trong nguồn dinh dưỡng động vật. Nhưng khả năng thành công bị giới hạn trong quá trình nhân giống đối với nhiều loài đậu lupin đã được báo cáo (Sator, 1985). Mulin và Bellio-Spataru (2000) đã nghiên cứu thành công khả năng tái sinh của mẫu cấy TCL được cắt từ vùng nốt trụ dưới lá mầm của cây Lupinus spp. Phaseolus vulgaris L. Là cây đậu xanh, loại đậu chủ yếu tự thụ phấn, cung cấp nguồn protein lớn trong khẩu phần ăn của người dân các nước Mỹ La Tinh và Đông Phi. Tuy nhiên, cây trồng này rất nhạy cảm với hạn hán và nhiều tác nhân gây bệnh. Việc tạo ra cây đậu chuyển gen có khả năng kháng hạn hoặc mang gen phòng vệ thông qua di truyền sẽ rất có ích, nhưng quá trình chuyển gen chỉ có thể thành công nếu thiết lập được một hệ thống tái sinh có hiệu quả. Cruz de Carvalho và cộng sự (2002) đã phát triển thành công một hệ thống tái sinh chồi trực tiếp bằng tTCL, nhờ đó tăng khả năng áp dụng phương pháp này cho quá trình chuyển gen. e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 21 - Oryza sativa L. Cây lúa đã được trồng như một loại cây lương thực chính yếu cách đêy hơn 7.000 năm và hiện đang nuôi sống hơn 50% dân số thế giới. Trong những năm gần đây, nuôi cấy mô đóng một vai trò rất quan trọng trong việc cải tiến chất lượng cây lúa. Tuy nhiên, cũng như các loài đơn tử diệp khác, không phải tất cả các loài lúa đều đáp ứng như nhau với các điều kiện tái sinh khi nuôi cấy trong ống nghiệm và cần có một quy trình gồm nhiều bước đòi hỏi một khoảng thời gian dài để phát triển thành cây hoàn chỉnh. Nhut và cộng sự (2000) đã nỗ lực tìm kiếm một phương pháp tái sinh trực tiếp đối với cây lúa bằng cách sử dụng hệ thống nuôi cấy TCL. tTCL được nuôi cấy trong tối 2 tuần và sau đó đưa ra sáng . Vào ngày thứ 7, hơn 93% tTCL hình thành các cấu trúc giống phôi (Embryo-like Structure – ELS) trong môi trường bổ sung 1µM BAP. Các cấu trúc này biệt hóa trực tiếp thành chồi mà không qua trung gian mô sẹo. Tóm lại, cây lương thực, thực phẩm và dược liệu tạo nên một phần không thể thiếu trong đời sống con người. Cho đến nay, có rất nhiều loài thực vật chưa đươc nhân giống in vitro thành công, quá trình cải thiện và nhân giống với số lượng lớn thông qua các phương pháp truyền thống hay phân tử vẫn còn giới hạn. Kỹ thuật TCL cho phép tái sinh thành công các cơ quan in vitro và nhờ sự phát sinh hình thái được kiểm soát đã mở đường cho những thành công trong chuyển gen nhờ vào các đặc tính vốn có của hệ thống. 2.3. Giới thiệu chung về cây hoa Đồng tiền Thuộc họ Cúc (Asteraeae). Tên gọi Gerbera được đặt theo tên nhà tự nhiên học người Đức Traugott Gerbera. Có khoảng 30 – 100 loài sống hoang dã, phân bố Nam Mỹ, châu Phi, Madagascar và cùng nhiệt đới châu Á (Nepal, Trung Quốc). Các loài G.jamesonii được đặt tên khi Robert Jameson cùng một số người đến khu mỏ vàng gần Barberton (phí đông của núi Drakensberg) thuộc khu Transvaal vào năm 1884. Sau đó Bolus, một nhà thực vật học đã gủi mẫu cây gerbera vào vườn thực vật ở Kew (gần London). Cây được hính thức miêu tả bởi Joseph Dalton Hooker, khi thực hiện tạp chí thực vật Curtis năm 1889. Ông miêu tả Gerbera jamesonii – theo đúng danh pháp e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 22 - khoa học cho loài này – ở Nam Phi được biết dưới tên gọi là cúc Transvall hay cúc Barberton. Gerbera rất phổ biến và được trồng làm cây trang trí trong các mảnh vườn hay để cắt cành. Các giống trồng tại vườn chủ yếu là lai ghép chéo giữa Gerbera jamesonii và một loài khác ờ Nam Phi là Gerbera Vindifolia. Giống lai ghép chéo này có tên gọi là Gerbera Hybrida. Cây đa dạng về hình dạng và kích thước hoa, có nhiều màu sắc. Phần trung tâm củ hoa đôi khi có màu đen, thông thường trên một bông các cánh hoa có thể có một vài màu khác nhau. Những cây hoa Đồng tiền là một trong những loại hoa trồng chủ yếu là cắt cành. Được nhập khẩu vào Châu Au từ thế kỷ 19, ngày nay có giá trị thương mại kinh tế cao. Phổ biến ở Hà Lan, Columbia, xung quanh các nước Nam Mỹ và Israel. Tại Việt Nam, hoa Đồng tiền khá phổ biến, có giá trị kinh tế và có thể ra hoa ở miền Bắc vì đây là thời gian hiếm hoa trong năm (Nguyễn Quang Thạch, 2002). Với diện tích 2.000m2 trồng hoa Đồng tiền có thể cho thu nhập khoảng 15 triệu đồng/tháng (Nguyễn Hà và Hồng Nhung, 2007). 2.3.1. Các đặc điểm quan trọng của cây hoa Đồng tiền 2.3.1.1. Vị trí phân loại ¾ Giới: Plantae ¾ Ngành: Magnoliophyta ¾ Lớp: Magnoliosida ¾ Bộ: Asterales ¾ Họ: Asteraceae ¾ Chi: Gerbera ¾ Loài: Gerbera jamesonii Hình 2.2. Cây hoa Đồng tiền (Gerbera jamesonii) e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 23 - 2.3.1.2. Đặc điểm hình thái 9 Thân, lá: thân ngầm, không phân cành, chỉ đẻ nhánh, có chiều cao từ 45 – 63cm, có khoảng 10 lá trên một cây. Lá và hoa phát triển từ thân cây, lá mọc chếch một góc so với mặt đất một góc 15 – 450, hình dáng lá thay đổi theo sinh trưởng của cây (từ hình trứng thuôn đến thuôn dài); lá dài 15 – 25cm, rộng 5 – 8cm, có hình lông chim, xẻ thùy nông hoặc sâu (tùy thuộc vào từng loại giống), mặt thân của lá có lớp lông nhung. 9 Rễ: thuộc dạng rễ chùm, hình ống, phát triển khỏe, ăn ngang và nối với một phần trên mặt đất, vươn dài tương ứng với diện tích lá tỏa ra. 9 Hoa: hoa là dạng hoa tự đơn hình đầu và bông hoa được tạo bởi hai loại cánh hoa hình lưỡi và hình ống. Cánh hình lưỡi lớn hơn, xếp thành một vòng hoặc một vài vòng phía ngoài; cánh hình ống nhỏ hơn, do sự thay đổi hình thái và màu sắc nên được gọi là mắt hoa hoặc tâm hoa. Trong quá trình hoa nở, cánh hoa hình lưỡi nở trước, cánh hoa hình ống nở sau theo thứ tự từ ngoài vào trong theo từng vòng một. Cụm hoa đầu có bề ngoài dường như là một bông hoa, trên thực tế là một tập hợp của hàng trăm hoa nhỏ riệng biệt. Tùy theo từng giống mà phân cấp theo chiều dài cành và kích thước đường kính hoa. 9 Đồng tiền là cây hoa của vụ Đông xuân nên chịu rét khỏe, chịu nóng kém hơn. Vào mùa hè cây cho hoa có màu sắc và hình dáng kém chất lượng. Nhưng giống hoa kép và màu nhạt chịu nóng tốt nhất, có tuổi thọ cao hơn. Hình 2.4. Cụm đầu hoa (B - C) và hoa Đồng tiền (A) e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 24 - 2.3.1.3. Điều kiện trồng trọt ¾ Nhiệt độ: Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng quyết định sự sinh trưởng, phát triển, nở hoa và chất lượng hoa. Đa số các giống Đồng tiền được trồng hiện nay đều thích hợp ở khoảng nhiệt độ từ 15 – 250C. Nếu nhiệt độ nhỏ hơn 120C hoặc lớn hơn 350C, cây sẽ kém phát triển. ¾ Ẩm độ: Đồng tiền là cây trồng trên cạn, không chịu được úng nhưng lại có sinh khối lớn, bộ lá to, tiêu hao nước nhiều, do vậy khả năng chịu hạn kém. Độ ẩm đất từ 60 – 70%, độ ẩm không khí từ 55 – 65% thuận lợi cho cây Đồng tiền sinh trưởng, phát triển; đặc biệt vào thời gian thu hoạch cần độ ẩm vừa phải để tránh nước đọng trên các vết cắt, gây thối hoa và sâu bệnh phát triển. ¾ Đất đai: Đất cần tơi xốp, nhiều mùn, thoáng khí, tốt nhất là đất thịt pha cát. Có độ pH 6 – 6,5. Đất phải có khả năng giữi nước và thoát nước tốt, không bị ứ đọng trong mùa mưa. ¾ Các yếu tố dinh dưỡng: Các loại phân hữu cơ, phân vô cơ, phân vi lượng có ý nghĩa quan trọng đối với sinh trưởng, phát triển, phẩm chất và năng suất hoa Đồng tiền. ¾ Phân hữu cơ chứa hầu hết các nguyên tố đa lượng và vi lượng mà cây hoa đồng tiền cần, vì tạo nên sự cân đối về dinh dưỡng cho cây, đồng thời cải tạo đất (tăng độ mùn và độ tơi xốp). Phân hữu cơ thường được bón lót (phân phải được hoại mục). ¾ Các nguyên tố vi lượng rất cần thiết cho cây Đồng tiền. Nếu thiếu các nguyên tố vi lượng này sẽ làm cây ít lá, sự hình thành hoa bị ức chế, hoa nhỏ. ¾ Việc bón phân cho cây cần được quan tâm nhiều. Lượng phân bón tính cho 1000m2/năm : 70kg vôi (bón trước khi cày đất), 120kg Super lân, 40kg Ure, 25kg KCl, 70kg NPK (20 – 15 – 15). ¾ Chăm sóc: e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 25 - 9 Cây Đồng tiền không thích hợp với độ ẩm cao, vì vậy phải tùy theo điều kiện thời tiết mà tưới cây vừa đủ ẩm. 9 Sau khi trồng 80 – 90 ngày cây sẽ cho hoa. Số lá, nụ, hoa cần có tỷ lệ hợp lý. Để đảm bảo cho cây sinh trưởng, phát triển tốt thì trung bình mỗi nhánh cây phải có năm lá công năng để cung cấp dinh dưỡng cho cây. 9 Để cây phát triển tốt, phải thường xuyên ngắt bỏ lá già vàng úa, lá sâu, bệnh. Tỉa lá tạo độ thông thoáng cho cây, giảm sâu và phòng trừ sâu bệnh. 9 Thu hoạch: Thời gian thu hái hoa c1o ảnh hưởng rất lớn đến độ bền của hoa khi cắm bình, do đó thời thu hái tốt nhất là khi cuống hoa đừng thẳng, các cánh hoa phải mở phẳng ra; cây lấy hoa đang ở tình trạng sinh trưởng mạnh. Cắt hoa vào lúc sáng sớm hoặc chiều mát, lúc này cuống hoa dang chứa nhiều nước, tươi được lâu. 2.3.2. Một số phương pháp vi nhân giống đối với cây hoa Đồng tiền Hiện nay hoa Đồng tiền được nhân giống chủ yếu bằng hai phương pháp: truyền thống (tách cụm) và vi nhân giống (từ chồi đỉnh, cụm hoa đầu, lá và rễ). Phương pháp nhân giống truyền thống không cung cấp đủ số lượng theo nhu cầu thị trường vì hệ số nhân chậm. Trong khi đó hệ số của phương pháp vi nhân giống cao hơn và tốc độ nhanh hơn, tuy nhiên vẫn còn nhiều nghi ngại về tính biến dị soma xuất hiện ở các dòng in vitro thế hệ sau, các dòng cấy chuyển sau này không còn giữ đúng đặc tính ban đầu của cây mẹ. Từ năm 1962, Murashige và Skoog đã tìm ra được môi trường tái sinh cho cây thuốc lá là môi trường MS, ngày nay môi trường này đã được sử sụng chủ yếu trong môi trường nuôi cấy in vitro đối với cây hoa Đồng tiền. Những nghiên cứu liên quan đến tái sinh chồi in vitro ở nhiều loài Gerbera jamesonii đã được báo cáo đối với các mẫu cấy từ lá và cuống lá (S Kuma, J.K Kanwa và D.R Sharma, 2004); mẫu từ lá, cuống lá và mô rễ (Azlina, Rosna Mat Taha và Asmah Awal, 2008); chồi cây Gerbera jamesonii Bolus (J.K. Kanwar và D.R sharma, 2008); phát hoa Gerbera hyhrid (Chen-young Chun và Min-chang e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 26 - Huang, 1985). Chuyển gen vào cây Đồng tiền: Teresa Olikowska và Danuta Kucharka, 1996; Purnima Tyagi and S. L. Kothari, 2004; các tác giả V. Nagaraju, G.S.L. Srinivas và G.Lakshmi Sita (1998) đã nghiên cứu và chuyển được các gen nptII và uidA cho cây hoa Đồng tiền dòng RCGH 164 bằng vi khuẩn Agrobacterium. Các kết quả thu được từ các thí nghiệm cho thấy mẫu cấy từ hạt, lá và cuống lá đều tạo được nhiều chồi trên mỗi mẫu cấy. Sự tái sinh từ phát hoa, cụm hoa đầu bị hạn chế, ít tạo được chồi và mô sẹo phát triển mạnh. Trong một nghiên cứu của Chenna Reddy Aswah và Mewa Lal Choudhary (2002) lấy mẫu nguyên liệu ban đầu là mô sẹo từ lá có sẵn, tần số tái sinh là 83,3% đối với các mẫu cấy. Tạo được chồi và rễ chuyển sang môi trường đất với tỉ lệ sống là 95%. Tại Việt Nam, việc ứng dụng nuôi cấy mô cho cây Đồng tiền cũng đang phát triển mạnh. Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (2002) đã phát triển quy trình nhân nhanh cây Đồng tiền, Các phương pháp nghiên cứu tạo giống mới bằng cách chuyển gen cũng được áp dụng cho các đối tượng hoa cây cảnh. Nghiên cứu tạo giống hoa Đồng tiền bằng kỹ thuật chuyển gen đã góp phần tạo được nguồn vật liệu ban đầu phục vụ công tác tạo giống hoa có các đặc tính như mong muốn (Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, 2002), với nguồn mẫu cấy là callus Đồng tiền giống Ferrari. Phương pháp đã sử dụng vi khuẩn chủng EHA 105 mang vector ITB2c mang gen để chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens. Vì tính biến di soma xuất hiện ảnh hưởng đến đời sau, nên R Bhatia cùng các cộng sự (2009) đã thực hiện nghiên cứu nhằm đánh giá ảnh hưởng nguồn gốc mẫu cấy đến tính biến dị soma bằng ISSR maker. Kết quả cho thấy dòng in vitro tái sinh từ chồi và cụm hoa đầu có tính ổn định di truyền cao hơn từ mô lá. e Phần 3 – Vật Liệu và phương pháp f GVHD: CN. Bùi Vn Th Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH Phaàn 3: VAÄT LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP e Phần 3 – Vật liệu và phương pháp f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 30 - 3.1. Vật liệu 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng chính được sử dụng trong nghiên cứu là cây hoa Đồng tiền kép (Gerbera jamesonii). Cây cho hoa màu cam, chiều dài cành hoa từ 40 – 50cm, đường kính hoa khoảng 13 – 15cm. Nguồn mẫu được sử dụng để tiến hành thí các nghiệm là phát hoa được chọn từ các cửa hàng hoa. Các phát hoa được chọn là một đoạn gần sát cụm hoa, phải còn non có sức sống tốt, lấy chiều dài khoảng 4cm và không bị hư, thối. 3.1.2. Mẫu cấy Hoa được mua về phòng thí nghiệm, dùng dao cắt một đoạn phát hoa tính từ phía dưới cụm đầu hoa một đoạn có chiều dài khoảng 4cm, được dùng làm mẫu cấy ban đầu cho các thí nghiệm. 3.1.3. Môi trường nuôi cấy Môi trường được sử dụng là môi trường khoáng cơ bản của Murashige và Skoog (1962) có bổ sung thêm đường sucrose (30g/l), agar (8g/l) và các chất điều hòa tăng trưởng thực vật. Tùy theo mục đích của các thí nghiệm mà môi trường có thể được bổ sung riêng lẽ hoặc kết hợp với các chất điều hòa tăng trưởng ở những nồng độ khác nhau. Các loại môi trường trên sau khi bổ sung chất điều hòa sinh trưởng được điều chỉnh về pH = 5,8 (bằng NaOH 1N hay HCl 1N) và hấp khử trùng bằng autoclave trong 25 phút ở nhiệt độ 1210C và áp suất 1 atm. 3.1.4. Điều kiện nuôi cấy 9 Thời gian chiếu sáng: 10 giờ/ngày 9 Cường độ chiếu sáng: 2500 lux 9 Nhiệt độ: 25 ± 20C 9 Độ ẩm trung bình: 75 – 80% e Phần 3 – Vật liệu và phương pháp f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Môi trường & CNSH - 31 - 3.2. Phương pháp thí nghiệm 3.2.1. Khử trùng mẫu Phần mẫu sau khi được cắt ra được cho vào bình erlen và tiến hành tuần tự theo các bước khử trùng mẫu sau: Khử trùng sơ bộ 9 Đặt mẫu dưới vòi nước chảy trong 15 phút để rửa sạch bụi và các chất bẩn bám trên mẫu. 9 Ngâm mẫu vào dung dịch nước rửa chén Sunlight pha loãng trong 5 phút. 9 Rửa lại bằng nước máy 3 – 4 lần và đưa vào tủ cấy. Khử trùng bên trong tủ cấy 9 Chuyển mẫu sang một erlen khác đã được hấp khử trùng. 9 Tiến hành lắc khử trùng bằng cồn 700 trong 1 phút. 9 Tiếp tục lắc khử trùng mẫu bằng dung dịch Javel nồng độ 5 - 7% riêng lẽ và 5 – 7% kết hợp thêm 2 – 3 giọt Tween 80% trong các khoảng thời gian khác nhau. 9 Rửa lại bằng nước cất vô trùng 4 – 5 lần. 9 Ngâm mẫu trong nước cất vô trùng để chuẩn