Đồ án Tìm hiểu kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ FISH (Florescence In Situ Hybridization) trên vi sinh vật

mang lại kết quả thuyết phục. Do tín hiệu từ các hạt đất không chứa vi khuẩn cao, nên rất khó để chứng minh sự khác biệt giữa các tín hiệu đặc trưng và các tín hiệu nhiễu. Đầu dò REX72 gắn nhãn huỳnh quang tạo ra tín hiệu yếu màu xanh lá cây tương phản lại màu nền từ xanh lục sẫm đến nâu sẫm do các đầu dò không đặc trưng và sự tự phát huỳnh quang của các hạt đất. Vì vậy, chúng tôi sử dụng ba chất huỳnh quang có màu sắc khác nhau nhằm tăng cường tín hiệu và đưa ra sự tương phản màu sắc giữa các tế bào mục tiêu với nền. Đầu tiên DAPI, một thuốc nhuộm huỳnh quang của DNA, được sử dụng để nhận biết tất cả các vi sinh vật với tín hiệu màu xanh. Trong thí nghiệm, DAPI đã dò tìm được khoảng 108 loại vi khuẩn trên mỗi gam đất. Thứ hai, các đầu dò LGC252b sẽ được nhuộm với Cy3 để phát hiện các tế bào vi khuẩn Bacillus và bào tử với tín hiệu màu đỏ của nó (màu đỏ tía khi nó bổ sung với các tín hiệu màu xanh của DAPI). Khoảng 40% các hạt phát hiện bởi DAPI cũng được phát hiện bởi LGC353b; các hạt này chủ yếu là có cấu trúc hình cầu, có đường kính nhỏ hơn 1µm và đôi khi phân bố thành cụm (Hình 6a). Các điểm đánh dấu lần thứ ba mang tính đặc hiệu rất cao, đó là sự liên kết giữa các đầu dò REX72 gắn nhãn huỳnh quang với các ribotype DA001 của Bacillus. Với phương pháp nhuộm nhiều lần này, các tế bào có chứa ribotype DA001 cần phải có được màu xanh của DAPI trên DNA, màu đỏ của LGC353b trên các trình tự đích đặc hiệu trong rRNA 16S của Bacillus, và màu xanh lá cây của đầu dò REX72 gắn nhãn huỳnh quang trên các đoạn ribotype. Vì ánh sáng màu xanh, đỏ và xanh lá cây hòa vào nhau sẽ tạo ra ánh sáng trắng (Hình 6b), nên các tế bào có chứa DA001 sẽ mang ánh sáng trắng mà được phân biệt rõ ràng từ các tín hiệu nền và vi khuẩn khác. Trong một số trường hợp, khi quan sát có thể thấy các tín hiệu là các dấu chấm, các tín hiệu này có thể là bào tử hoặc có thể là các tế bào được quan sát theo chiều thẳng đứng. CHƯƠNG 5. ỨNG DỤNG CỦA FISH 21 Mặc dù các tế bào lai với đầu dò REX72 rất nổi bật và phong phú, nhưng các nhà nghiên cứu vẫn gặp phải những vấn đề khi dò tìm các tín hiệu tích cực. Để giải quyết điều này, các nhà nghiên cứu phải điều chỉnh nồng độ của vi khuẩn giống như của các hạt trong huyền phù. Khi các mẫu vi khuẩn từ đất được pha loãng dưới 200 lần (sau khi ly tâm), các nhà nghiên cứu không thể phát hiện được các tín hiệu tích cực trong tất cả các tín hiệu huỳnh quang có màu sáng. Khi mẫu chuẩn bị đã được pha loãng hơn 1000 lần, số lượng các tín hiệu là quá thấp cho các tài liệu hình ảnh đại diện. Điều này tương ứng với phạm vi pha loãng vào khoảng 103 đến 104 vi khuẩn trên 1µl. Kết quả thu được đã chỉ ra rằng ribotype DA001 thực sự có nguồn gốc từ một trong những chủng vi khuẩn chiếm đa số trong đất ở đồng cỏ Drentse A (Hà Lan). Hình ảnh và kích thước của các tín hiệu tích cực cho thấy rằng các tế bào dinh dưỡng Bacillus ribotype DA001 có tồn tại. Tuy nhiên, đến bây giờ những nỗ lực của các nhà nghiên cứu nhằm nuôi cấy được loài Bacillus này vẫn chưa thành công. FISH không những cung cấp hình ảnh chụp nhanh trong từng thời điểm nhất định mà còn được sử dụng để kiểm soát các mạng lưới vi khuẩn trong dòng chảy liên tục của trầm tích nước biển [22], trong suốt quá trình thay đổi theo mùa của hồ núi cao [108] và thành phần các sinh vật phù du đáp ứng lại với sự gia tăng thảm sinh vật nguyên sinh [64]. Hơn nữa, những loài vi sinh vật hoang hóa hoặc mới được định danh gần đây trong ngành vi khuẩn đã được phát hiện bằng cách sử dụng FISH, như các chủng của loài Holophaga/Acidobacterium [90], một chủng Bacillus hoang trong đất đồng cỏ Hà Lan [37], và gần đây là chủng Aquabacterium trong hệ thống nước uống ở Berlin (Đức) [68]. CHƯƠNG 5. ỨNG DỤNG CỦA FISH 22 Hình 5. Kết quả hiển thị cho quá trình lai. (a)Phát hiện các vi khuẩn Bacillus ribotype DA001 với ba chất nhuộm khác nhau trên một mẫu đất trích ly được pha loãng 320 lần. Độ phóng đại 1200 lần. (b)màu sắc dự kiến của ba chất nhuộm trên lý thuyết. (c)Phản ứng của đầu dò LGC353b với một mẫu cố định của B.cereus riêng rẽ nhằm chứng minh tính thấm của các bào tử. Độ phóng đại 1600 lần. (d)Thuốc nhuộm DAPI [37]. Tất cả những nghiên cứu này có một ý nghĩa to lớn đối với sự hiểu biết về thành phần và môi sinh của cộng đồng vi khuẩn tự nhiên và động lực quần thể của chúng để phản ứng lại những tác động của tự nhiên và loài người. 5.2. Hệ vi sinh vật trong nước thải Ardern và Lockett (1914) đã phát triển hệ thống hoạt hóa bùn đầu tiên để thanh lọc nước thải tại Manchester. Tuy nhiên, vai trò của quần thể vi sinh vật trong quá trình này vẫn chưa được hiểu hết. Bởi vì những kỹ thuật nuôi cấy thông thường đã được thực hiện là quá chọn lọc để cung cấp một bức tranh toàn diện và đáng tin cậy của toàn bộ mạng lưới vi khuẩn [69,147], phân tích tập hợp các phân tử rRNA đã tìm thấy nhiều ứng dụng rộng rãi cho kỹ thuật phân tích của một số môi trường như bình phản ứng sinh học hay nhà máy xử lý chất thải. Các chuỗi trình tự được tạo ra bằng những kỹ thuật phân tích phân tử như kỹ thuật PCR đã được sử dụng để tạo ra các đầu dò oligonucleotide mới cho FISH để nghiên cứu các quần thể vi khuẩn, như trong bùn hoạt tính [11,127,130]. Gần đây, vào năm 1999 Bond và cộng sự đã tiến hành xác định các nhóm vi khuẩn trong bùn với sự tăng cường loại bỏ photpho sinh học. Một số nhóm nhà nghiên cứu khác thì tập trung vào Actinomycetes có CHƯƠNG 5. ỨNG DỤNG CỦA FISH 23 chứa acid mycolic được cho là có chứa nhiều sợi nhỏ tạo bọt trong nhà máy xử lý nước thải [116,117,127]. Ngoài các cá thể của nhóm khuẩn cổ, đặc biệt là methanogen (một loại khuẩn cổ kị khí có khả năng tạo khí methal), đã được tìm thấy bằng phương pháp FISH trong quá trình phân hủy kị khí và trong hạt bùn nhỏ, mặc dù khả năng tự phát huỳnh quang của chúng rất mạnh [118,132]. Gần đây, sự kết hợp giữa FISH và bộ vi cảm biến cho phép phân tích đồng thời quần thể vi khuẩn và các hoạt động trao đổi chất, qua đó phát hiện ra các vi khuẩn kị khí nằm trong các khe nhỏ thiếu oxy trong môi trường hiếu khí [126]. 5.3. Vi khuẩn cộng sinh Hầu hết các vi sinh vật cộng sinh bắt buộc đều chưa tiến hành nuôi cấy được. Sử dụng rRNA 16S, chúng có thể được định danh và phân cấp phát sinh loài. Việc khoanh vùng vi sinh vật trong những bộ phận khác nhau của vật chủ bằng FISH có thể chứng minh được tính chất cộng sinh của chúng, như Amann và cộng sự (1991) đã làm, người đã xác định được vi khuẩn nội cộng sinh chưa nuôi cấy thuộc chi Holospora trên lông của Paramecium caudatum. Từ khi loài Holospora được tìm thấy trong nhân của các vi sinh vật có lông mịn, nó có thể được nhận biết rõ ràng từ vi khuẩn tiêu hóa hiện diện trong các túi thức ăn. Tương tự, FISH cũng được sử dụng để chứng minh Paramecium caudatum cũng chứa Caedibacter caryophila, một “kẻ” tiêu diệt vi sinh vật nội cộng sinh mà sự phát triển có liên quan đến loài Rickettsia [134]. Gần đây, những vi khuẩn nội cộng sinh mới cũng liên quan đến Rickettsia, điều này đã được chứng minh trên các loài Acanthamoeba [44]. Có một điều thú vị là các giống amip tương ứng đều đã được phân lập từ các lớp mô mỏng giác mạc người. Sarcobium lyticum, một loại vi khuẩn có liên quan mật thiết đến chi Legionella, cũng đã được chứng minh có trong amip được lấy từ mẫu nước bọt của bệnh nhân viêm phổi [135]. Những chứng minh này cho thấy rằng amip không những được xem là nguồn gây bệnh cho con người mà còn là vật truyền cho nhiều loại vi khuẩn cộng sinh khác nhau. Đây có thể là những trường hợp các vi khuẩn nội cộng sinh không bắt buộc như Legionella pneumophila đã được tìm thấy trong tế bào Acanthamoeba castellani [56] và trong Tetrahymena pyriformis có lông CHƯƠNG 5. ỨNG DỤNG CỦA FISH 24 [95]. Trong các môi trường nước nghèo dinh dưỡng, Legionellae có thể sống sót nhưng ở trạng thái vô hoạt, trong đó chúng không bị phát hiện bằng các kỹ thuật nuôi cấy thông thường. Phục hồi những tế bào vô hoạt trở lại trạng thái hoạt động đã được điều khiển thành công bằng FISH trong tế bào chủ tự nhiên Acanthamoeba castellanii [139]. Những nghiên cứu này có một tác động to lớn đối với ngành dịch tễ học của những mầm bệnh này. Sử dụng các cách thức lai tại chỗ (ISH) khác nhau, vi khuẩn nội cộng sinh đã được tìm thấy trong mang của động vật thân mềm hai vỏ Solemya reidii. . Sinh vật này đã xử lý như một khuôn mẫu để đánh giá kỹ thuật cố định metacrylate và tách acetone nhằm tăng cường độ tín hiệu và nâng cao độ nhạy của ISH trên các đoạn mô [153]. Gần đây, Methanobrevibacter – một loài có liên quan với vi khuẩn cổ – đã được tìm thấy bằng FISH trong một lượng nội bào của Reticulitermes speratus, một loài mối cánh được thu thập từ các quần đảo Nhật bản [128]. 5.4. FISH trong y học 5.4.1. Các quần thể vi khuẩn phức tạp a. Khoang miệng Phân tích các quần thể bằng FISH đã thể hiện sự đặc biệt hữu ích trong việc mô tả các hỗn hợp vi khuẩn phổ biến hay các hệ vi sinh vật nhiễm tạp. Những phân tích này đã cho thấy trong khoang miệng người có chứa hơn 300 loài vi khuẩn khác nhau, trong đó có nhiều loài rất phức tạp khi tiến hành nuôi cấy hoặc chưa từng được nuôi cấy. Các bệnh về răng miệng như viêm răng hay viêm lợi có liên quan đến các mạng lưới vi khuẩn đặc thù này. Sử dụng các kỹ thuật nuôi cấy chuyên biệt sẽ chỉ có được sự xem thường đối với đa dạng vi sinh vật. Những lợi ích khi sử dụng kỹ thuật FISH đã được thể hiện trên những vi khuẩn kị khí gram âm, như Porphyromonas gingivalis, Bacterroides forsythus và Prevotella intermedia trong thành phần mảng bám răng của bệnh nhân viêm răng [48,49]. Phân tích sâu hơn trên môi trường phân tử cho thấy một sự đa dạng không ngờ của các loại xoắn khuẩn trong khoang miệng của các bệnh nhân cùng với sự phát triển nhanh chóng CHƯƠNG 5. ỨNG DỤNG CỦA FISH 25 của viêm răng [24]. Số lượng lớn các vi khuẩn hình xoắn và sự đa dạng hình thái của chúng (a) (b) Hình 6. Nhuộm huỳnh quang các lớp vi khuẩn từ bệnh nhân viêm răng. (a) lai với các đầu dò vi khuẩn là EUB338 gắn nhãn FITC (xanh lá cây) để hiển thị hình thái khác nhau của vi khuẩn ở cấp độ đơn bào và TRE I gắn nhãn Cy3 (vàng) để dò tìm các loài phát sinh thuộc xoắn khuẩn nhóm I, hầu hết chưa được nuôi cấy. (b) trên cùng một đối tượng, tiến hành lai với đầu dò TRE I gắn nhãn FITC (xanh lá cây) và TRE II gắn nhãn Cy3 (vàng) dò tìm xoắn khuẩn trong khoang miệng thuộc các loài phát sinh nhóm II [100]. Cần lưu ý rằng sự phân loại xoắn khuẩn theo các nhóm phát sinh loài dựa trên những dữ liệu của rRNA 16S [24]. CHƯƠNG 5. ỨNG DỤNG CỦA FISH 26 (a) (b) Hình 7. FISH quan sát trên một màng sinh học sử dụng đầu dò EUB338 và TRE I. (a) độ phân giải thấp với chất mang FluoX Cy3. (b) độ phóng đại cao hơn, các xoắn khuẩn nhóm I (màu vàng), bao quanh là các vi khuẩn khác (màu xanh lá cây), các tế bào máu (đen) được nhóm lại xung quanh một lõi dày đặc các vi khuẩn ở trung tâm. đã được phát hiện thông qua FISH trên các vết bẩn của mảng bám răng (hình 7) [100]. Hơn nữa, cấu tạo và phân bố không gian của các xoắn khuẩn trong khoang CHƯƠNG 5. ỨNG DỤNG CỦA FISH 27 miệng có thể được nghiên cứu trong màng sinh học (Hình 8). Tuy nhiên, vì dữ liệu dịch tễ học về tổ chức của xoắn khuẩn với các bệnh răng miệng độc lập với nhau nên không thể chứng minh được khả năng gây bệnh của chúng, cùng một loại đầu dò oligonucleotide được sử dụng trên các đoạn mô của sinh thiết lấy từ gót chân của các loài thú nuôi bị bệnh viêm da. Các bệnh mãn tính, mô hoại tử hay các bệnh khó xử lý sẽ được kết hợp xử lý với một hỗn hợp vi khuẩn kị khí được tìm thấy ở bệnh viêm răng. Sự phân lớp các nhóm vi khuẩn khác nhau có thể được tìm thấy chỉ trong một mô, cho thấy rằng các loài phát sinh đã biết của xoắn khuẩn có nhiều khả năng xâm lấn mô và duy trì bệnh hơn các xoắn khuẩn khác, que hoặc cầu khuẩn [101]. b. Dạ dày – ruột Vì ruột là phần vi sinh vật phát triển nhiều nhất trong cơ thể con người, sự khỏe mạnh của hệ ruột và sự hình thành các hệ sinh vật bám dính trên thành ruột người là điều cần quan tâm nhất. Một lần nữa, các kỹ thuật nuôi cấy thông thường lại không đánh giá chính xác được số lượng vi khuẩn [57]. Hiện nay, phương pháp FISH khi nghiên cứu các hệ vi sinh vật đường ruột ở người thường chỉ nghiên cứu hạn chế ở nguồn phân mà thôi. Số lượng Bifidobacterium và vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm Ramulus flavonoid trong các mẫu phân được ước tính bằng cách sử dụng các đầu dò đặc hiệu tương ứng với các chủng, loài vi sinh vật [77,1299]. Sự biến thiên số lượng vi khuẩn, bao gồm các chủng Bacteroides và Clostridium ssp., Streptococcus, Lactococcus và nhóm Clostridium coccoides-Eubacterium rectale trong phân người được theo dõi trong khoảng thời gian 8 tháng [41]. Kỹ thuật này đã được cải tiến tốt hơn bằng cách phát triển khả năng thu nhận hình ảnh tự động và các phần mềm phân tích cho phép đếm bằng kính hiển vi các nhóm vi khuẩn đường ruột một cách nhanh và chính xác [60]. Gần đây, sự khác biệt về phát triển của vi khuẩn đường ruột của trẻ sơ sinh bú sữa mẹ và sữa bột đã được nghiên cứu [58]. Tuy nhiên, sự phân bố không gian sinh lý của hệ vi khuẩn đường ruột người và màng sinh học đường ruột vẫn chưa được hiểu rõ hết. CHƯƠNG 5. ỨNG DỤNG CỦA FISH 28 Hiện nay, một số phương pháp đã được áp dụng thành công trên động vật để nghiên cứu sự phân bố không gian của vi khuẩn đường ruột và để phát hiện toàn bộ mầm bệnh trong môi trường phức tạp này. E.coli đã được phát hiện trong phần đông lạnh của ruột lớn chuột bằng cách sử dụng các đầu dò ứng với các vùng đặc hiệu của 23S rRNA. Trong nghiên cứu này, các tế bào E.coli được quan sát trong chất nhờn nằm trên các tế bào biểu bì mà không hề có sự gắn kết trực tiếp nào đến các tế bào này [112]. Các xoắn khuẩn của loài Brachyspira/Serpulina đã được hiển thị chính xác trong ruột lợn mắc bệnh lỵ (Boye et al., 1998). Brachyspira pilosicoly xâm nhập và định cư trên các bề mặt tế bào biểu bì và các tiểu nang của lợn đã được tiêm phòng [62]. Một nghiên cứu tương tự cũng đã được thực hiện để kiểm tra sự ảnh hưởng của những vi khuẩn hình que gây bệnh viêm phổi trong quá trình xâm lấn vào ruột già của chuột. Trong một nghiên cứu khác khi thí nghiệm trên chuột bị nhiễm bệnh, Nordentoft và cộng sự (1997) đã cố gắng thiết lập một chẩn đoán bằng phương pháp FISH để phát hiện ra chủng Salmonella. Do sự tương đồng về trình tự, nên 16S rRNA hầu như không phân biệt được các chủng thuộc loài Enterobacteriaceae. Vì vậy, các nhà nghiên cứu đã sử dụng một trình tự lấy từ rRNA 23S sử dụng như một trình tự đích cho các đầu dò đặc hiệu phát hiện ra 49 trong 55 chủng gây bệnh thuộc Salmonella nhưng không có loài nào trong 43 loài khác được nghiên cứu thuộc chủng vi khuẩn Enterobacteriaceae. Salmonella cũng được phát hiện trong các đoạn mẫu parrafin của ruột kết và mô phổi bị nhiễm bệnh của chuột cũng như từ động vật đã từng bị nhiễm salmonella. c. Nhiễm khuẩn đường hô hấp Haemophiolus influenzae là nguyên nhân chung cho bệnh viêm đường hô hấp cấp và mãn tính. Khi sử dụng FISH, các dòng vi khuẩn H.influenzae đã được tìm thấy trong các mô hạch nhân ở họng của trẻ em trong giai đoạn xuất hiện triệu chứng. Vi khuẩn còn được phát hiện trong các đại thực bào, như các lớp tế bào dưới biểu mô. Các nhà khoa học đã cùng nghiên cứu và phát hiện ra các tế bào nhiễm bệnh này khi sử dụng FISH để dò tìm Haemophilus và sử dụng chất miễn CHƯƠNG 5. ỨNG DỤNG CỦA FISH 29 dịch huỳnh quang để dò tìm các tế bào CD 14. Kết quả cho thấy rằng Haemophilus có thể tồn tại được trong các đơn bào hoặc các đại thực bào. Gần đây, một tập hợp các đầu dò oligonucleotide được thiết kế để dò tìm đặc hiệu đối với các mầm bệnh phân lập từ tế bào xơ gan của bệnh nhân, bao gồm Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus và Candida albicans. Trong một thử nghiệm lâm sàng với các mẫu đờm và mẫu gạc họng, các đầu dò đã phát hiện nhanh chóng và chính xác các vi khuẩn gây cấp tính ở bệnh nhân xơ nang [59]. So với các kỹ thuật nuôi cấy thông thường, sự chính xác của FISH là 100%. 5.4.2. Phát hiện mầm bệnh trong các mô cấy và dụng cụ vô trùng a. Các thiết bị cấy ghép y tế Nhiễm trùng từ các bộ phận nhân tạo như ống thông tĩnh mạch, thiết bị cấy ghép chỉnh hình là một nguyên nhân phổ biến của bệnh nhiễm trùng máu và trục trặc của thiết bị y tế. Do khả năng bám dính và cấu tạo màng sinh học trên các bộ phận nhân tạo, nên các cầu khuẩn là những vi khuẩn thường xuyên bị sót lại trên các màng nhiễm bệnh. Tuy nhiên, việc chẩn đoán các cầu khuẩn này sẽ khó khăn khi quá trình nuôi cấy bị hư hỏng, có thể nguyên nhân là do sinh vật này tạo ra các biến thể nhỏ hơn với tốc tộ phát triển chậm hơn. Trong trường hợp này, có thể FISH sẽ linh hoạt hơn so với các kỹ thuật nuôi cấy khác. Hơn nữa, FISH có thể phân biệt được giữa sự nhiễm khuẩn của thiết bị cấy ghép hay sự nhiễm bẩn của mẫu nhờ vào sự hiển thị chính xác các cầu khuẩn bám trên thiết bị. Khi sử dụng đầu dò 16S rRNA, Staphylococcus aureus và Staphylococcus epidermidis đã được xác định chính xác trong thí nghiệm trên màng sinh học. FISH tiếp tục chứng minh được rằng một biến thể nhỏ của S. aureus có thể tồn tại trong một dòng tế bào nội mạc người. Trong cùng một nghiên cứu, S.epidermidis được phát hiện có trong phần parrafin của mẫu mô liên kết trên một bệnh nhân nới lỏng khớp hông. b. Môi trường máu CHƯƠNG 5. ỨNG DỤNG CỦA FISH 30 Gần đây, khả năng ứng dụng của FISH để định danh các vi sinh vật gây bệnh trong các mẫu máu nhiễm bệnh đã được khảo sát bởi 2 nhóm [61,72]. Bảng trình tự gen và các đầu dò oligonucleotide sử dụng đặc hiệu cho từng loài đã bao quát hầu hết các mầm bệnh điển hình được tìm thấy trên các bệnh nhân bị nhiễm khuẩn, bao gồm staphylococci, streptococci, enterococci, Enterobacteriaceae và nấm. Các nhà nghiên cứu kết luận rằng phương pháp FISH có độ nhạy và đặc hiệu tuyệt vời và kết quả thu được chỉ trong 25 phút cho tới 2.5 giờ, trái lại định danh các loài bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống thường mất từ 24 đến 72 giờ mới hoàn thành. Sự phát hiện nhanh chóng các nguyên nhân mầm bệnh trong máu cho phép ta dễ dàng đưa ra được các phương pháp trị liệu thích hợp, vì thế ta có thể hoàn thiện việc chẩn đoán cho các bệnh nhân bị nhiễm trùng máu. 5.4.3. Nấm Các mầm bệnh có nguồn gốc từ nấm như Candida là những mối đe dọa thường xuyên cho các bệnh nhân suy giảm miễn dịch. Việc chẩn đoán các mầm bệnh bắt đầu gặp phải một số khó khăn từ khi các tác nhân gây bệnh trong máu thường vẫn biểu hiện âm tính. Bởi vì khả năng nhạy cảm của các tác nhân kháng nấm thì khác nhau trong loài Candida, nên một phương pháp định danh nhanh và nhận dạng chính xác là điều mà các nhà khoa học mong muốn. Bất chấp hiện tượng tự phát huỳnh quang (đã được thảo luận ở trên), C.albicans/tropicalis và C. parapsilosis đã được phát hiện một cách chính xác khi tiến hành đông lạnh các cơ quan nội tạng, trong thí nghiệm khảo sát về chuột nhiễm bệnh và các mẫu máu bất thường sau khi tế bào máu bị phân giải và được lọc bằng màng polycarbonate [86,87]. Trong những trường hợp này, các đầu dò oligonucleotide được lấy từ rRNA 18S. Aureobasidium pullulans, một loại nấm giống như nấm men phát triển trên các tế bào lá tươi, đã được nghiên cứu bằng phương pháp FISH. Mặc dù loài nấm này không có khả năng gây bệnh tiềm tàng, nhưng chúng có thể rất quan trọng trong việc gây ra bệnh ở thực vật bởi vì loài vi sinh vật này tồn tại khắp nơi và có thể đóng vai trò như một tác nhân điều khiển quá trình sinh học của các tác nhân gây CHƯƠNG 5. ỨNG DỤNG CỦA FISH 31 bệnh ở thực vật. Định lượng bằng hình ảnh bao gồm các phương pháp phân tích thống kê cho phép phân tích sự phát triển toàn diện của A. pullulans trên bề mặt lá [84,133]. Hơn nữa, Sterflinger và Hain (1999) đã phát triển các đầu dò oligonucleotide dùng cho phương pháp FISH trong phát hiện các loài nấm men đen và mô phân sinh của nấm mốc phát triển trên bề mặt kính và nhựa plastic. 5.4.4. Thuốc thú y Các tác nhân gây hoại tử là những mầm bệnh cực kỳ nguy hiểm trong các trang trại nuôi tôm trắng, Penaeus vannamei. Các bệnh này gây ảnh hưởng lớn đến sản lượng tôm, đã được tìm ra ở Texas, Trung Mỹ và Nam Mỹ. Nó có liên quan đến các chủng vi sinh vật không nuôi cấy được như Rickettsia, các vi khuẩn gây hoại tử. Khi sử dụng FISH trên giống tôm Penaeus vannamei bị nhiễm bệnh đã phát hiện ra một số vi khuẩn gây hoại tử trong tế bào chất của tế bào biểu mô hình ống bị ung thư [89]. 5.4.5. Các mầm bệnh ở thực vật Hiện tượng mục lớp vỏ ngoài của khoai tây được gây ra bởi Clavibacter michiganensis Sepedonicus. Việc định danh nhanh và chính xác các loại vi khuẩn này là điều rất quan trọng để kiểm soát và triệt tiêu mầm bệnh này. Phép chẩn đoán đã được nâng cao bằng việc ứng dụng phương pháp FISH - sử dụng rRNA 16S làm đầu dò và sau đó kích thích phát huỳnh quang bằng cách sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu với dòng tế bào trên, bởi vì hai chỉ tiêu độc lập này giúp ta chắc chắn rằng việc nhận dạng là chính xác [84]. Ralstonia solanacearum, một loại vi khuẩn về mặt di truyền có liên hệ rất gần với chủng Pseudomonas, là một tác nhân gây bệnh mục héo hoặc hóa nâu ở khoai tây. Tiến hành xác định mầm bệnh này bằng FISH, rRNA 23S được thiết kế để sử dụng làm đầu dò. Kết hợp với kích thích phát huỳnh quang gián tiếp bằng cách sử dụng một kháng thể đa dòng của Ralstonia solanacearum, việc nhận dạng các vi CHƯƠNG 5. ỨNG DỤNG CỦA FISH 32 khuẩn trong đất, trong các mẫu nước hay trong các mô bị thối của cây cà độc dược là điều hoàn toàn có thể làm được [160]. 5.4.6. Phát hiện các mầm bệnh bằng phương pháp lai không sử dụng chất huỳnh quang Một vài nghiên cứu trong y học sử dụng các đầu dò đánh dấu bằng digoxygenin hoặc enzyme cũng nên được đề cập. Trong năm 1988, Mycoplasma pneumonieae, loại DNA được tìm thấy trong các mầm bệnh của bệnh nhân viêm nha chu bằng phương pháp lai tại chỗ (ISH) sử dụng đầu dò được đánh dấu bằng biotin [120]. Một nghiên cứu duy nhất của ISH khi xác định Mycobacterium leprae trong các phần sinh thiết của da (Arnoldi et al., 1992) đã sử dụng phương pháp dò tìm cảm ứng bằng enzyme. Chlamydia trachomatis được định vị với đầu dò đánh dấu bằng diagoxygenin trong lớp tế bào ở mô của bệnh nhân mắc hội chứng Reiter [15]. Karttunen và cộng sự (1996) đã sử dụng sản phẩm PCR là 520 cặp base được đánh dấu với digoxygenin để mà quan sát Helicobacter pylori trong mẫu sinh thiết dạ dày. Sử dụng hệ thống khuếch đại tín hiệu tích tụ (CARD-ish), Yersinia enterocolitica đã được phát hiện trong các dòng tế bào bị nhiễm bệnh, lá lách của chuột và các tế bào bệnh củ người [105]. Trong trường hợp này, các plasmid DNA được đánh dấu với biotin bằng phương pháp Nick translation, tạo ra các đoạn chứa từ 100-500 cặp base. Các tác nhân gây bệnh ở động vật được phát hiện bằng ISH bao gồm các vi sinh vật nội bào trong biểu mô ruột của lợn bị bệnh [47], Anaplasma marginale trong tế bào hồng cầu của bò [46] và Chlamydia trong mô của các loài chim. CHƯƠNG 6. TRIỂN VỌNG PHÁT TRIỂN 33 CHƯƠNG 6. TRIỂN VỌNG PHÁT TRIỂN CỦA FISH 6.1. Trên thế giới FISH là một phương pháp dò tìm nhanh chóng, rẻ tiền và dễ dàng thực hiện. Nó đặc biệt hữu ích khi dò tìm các vi khuẩn phát triển chậm, khó nuôi cấy hay không thể nuôi cấy. Nếu được áp dụng trên các mẫu máu hoặc dịch não tủy, nó có thể chẩn đoán nhanh và chính xác mức độ nhiễm trùng của các bệnh nhân bệnh nặng. Một bước quan trọng trong việc nhận dạng lâm sàng vi sinh vật sẽ được thực hiện nếu FISH có thể được tiến hành tự động. Hệ thống phân tích hình ảnh tự động đã được thử nghiệm. Tuy nhiên, việc tự động hóa trong xử lý mẫu cũng như kiểm soát hợp lý các kết quả bằng cách sử dụng các hệ thống chuyên môn luôn được yêu cầu. Một hệ thống các công cụ lai tạo đã được tạo ra, nhưng chúng đã không được sử dụng trên bất cứ mẫu vi sinh vật nào cả [23]. Bên cạnh sự giảm bớt những thao tác bằng tay, tự động hóa FISH còn tạo ra được doanh thu rất cao và cải thiện khả năng tái chế các mẫu vi sinh vật lâm sàng trong phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, mặc dù có nhiều ưu điểm nhưng trong tương lai gần, FISH vẫn chưa thay thế được các phương pháp nuôi cấy thông thường. Một cải tiến nữa của kỹ thuật này là kết hợp định vị vi khuẩn với bổ sung những thông tin về tính chất cơ bản của chúng, như biểu hiện gen, quá trình trao đổi chất hay biểu hiện kháng nguyên. Kỹ thuật phóng xạ tự ghi có thể được sử dụng để mô tả hoạt động trao đổi chất của tế bào. Các hỗn hợp tế bào hay bùn hoạt hóa xác định được ủ với các chất nền hữu cơ và vô cơ được gắn phóng xạ như glucose, acetate h