Giáo trình Kỹ thuật điện di

Các mô khác nhau có thể được sử dụng để điện di. Đối với nụ (bud), ngọn rễ, hạt, hạt phấn và vật liệu trong ống nghiệm(in vitro) của cây trồng bậc cao việc nghiền cho đồng nhất (homogenize) và cho năng suất nồng độ enzyme đủ trong dịch trích thô là việc dễ dàng. Riêng với các vật liệu khác như mô tượng tầng (cambial tissues) hoặc lá kim (needle) cần có phương thức khác để làm đồng nhất như sau: Hỗn hợp các mãnh mô nhỏ (< 5mm) với PVP (Polyclar AT, 25% (v/v)) không hoà tan, cẩn thận để trong ly plastic 100ml, đổ nitơ lỏng vào. Nghiền với thiết bị Ultra Turrax T25/N 18. Sau khi khuấy mạnh với tốc độ cao (10-20 giây), cho nitơ lỏng bốc hơi, bảo quản bột trong -80oC. 2.2 Dịch trích (extraction buffer) 0,05-0,1 M TrisHCl (pH 7,0-7,5) chứa 2-3% (w/v) polyvinylpyrrolidone (PVP-40) hoà tan, 0,05% (v/v) 2-mercaptoethanol. 2.3 Dung dịch gel và điện cực (bảng 1, các thí dụ dùng cho cây đại mộc). 2.4 Các dung dịch nhuộm các hệ enzyme được chọn lọc: Các dung dịch gốc: 10% MgCl2 1mg PMS/ml nước cất NAD NADP: 2mg/ml nước cất Dung dịch nhuộm: 0,08 M Tris-0,04MHCl (pH8,0) 2.5 Thành phần gel: 11% (10-12%) tinh bột Toronto 2-3% saccharose (hay 6-8M urea trong trường hợp đệm Tris-citric) Đệm gel : 200ml cho mỗi gel 20 x 12 cm, 3 hay 4 mãnh để nhuộm khác nhau. 2.6 Thiết bị cơ bản Lò sóng viba để tạo gel nhanh Khuôn gel (gel mould) Thiết bị điện di với hệ thống làm lạnh Bộ nguồn (500mA, 500V) Thiết bị cắt gel ( 0,2-0,5 mm dây điện hay dây đờn) Sấy gel ( tuỳ chọn) 20 2.7 Phương pháp Chuẩn bị gel 1. Đun nóng 2/3 đệm gel trong lò vi sóng trong 2-3 phút. 2. Khuấy tinh bột và saccharose, hay urea trong phần còn lại 1/3 của đệm gel cho đến khi dịch huyền phù (suspension) không còn chứa vón cục. 3. Thêm 2/3 đệm gel được đun nóng và đun hỗn hợp 2-3 phút trong lò vi sóng. 4. Hút chân không để không còn bọt khí. 5. Đổ hỗn hợp vào miếng kính bên trong khuôn ( chú ý: nếu mặt trên không đậy và gel được cắt thành từng mãnh, mãnh phía trên không thể dùng để nhuộm). 6. Làm nguội khoảng 20 phút bằng cách đưa vào tủ lạnh ở 4 oC. Làm đồng nhất và cách đưa mẫu vào gel 7. Phá vở (rupture) mẫu bằng cơ học trong dịch trích bằng tay hay chày nghiền (grinding pestle). Có thể dùng nitơ lỏng để nghiền. 8. Dùng giấy lọc 3MM đã cắt (dài 20mm, rộng 2-4mm) nhúng vào dịch trích thô. Mỗi mẫu giấy lọc đưa vào một giếng, tránh làm lẫn tạp với giếng khác. 9. Để chạy gel, cắt gel có chiều dầy 2cm. Chen mẫu giấy lọc có chưa isoenzyme vào và để luôn trong quá trình chạy gel. Sửa vị trí mẫu giấy lọc cho đúng vị trí. 10. Điện di Để chạy điện di, đổ đầy chất đệm (để tiết kiệm dịch đệm để chạy nhiều lần, đệm cực đã dùng từ hai bể chứa đệm (buffer tank) có thể hỗn hợp lại), làm bảo hoà cầu nối (vải hay giấy thấm để phía trên mặt gel, tránh bọt khí) với dịch đệm. Gắn điện vào hệ thống ( 30V/cm đối với khoảng cách cầu nối 12cm), chạy gel trong vài giờ (3-5 giờ). 11. Nhuộm gel 12. Khi chạy điện di xong, cắt gel tinh bột nằm ngang bằng dao cắt và chuyển gel nhẹ nhàng lên các khay riêng. Nhuộm gel tương ứng cho từng hệ enzyme theo mong muốn. 13. Phân tích điện di đồ hay phổ điện di enzyme (zymogram). 21 Bảng 2.1 Thành phần hóa chất pH dùng cho đệm điện cực, đệm gel và các hệ enzyme có thể áp dụng Stt pH đệm điện cực pH đệm gel Các hệ enzyme 1 0,04M LiOH-0,19M 0,05M Tris-0,01 M citric AAT, ACO, AP+, boric acid/8,1 acid /8,1* PGI (ACP, GDH, PEPCA), NDH, PER. 2 0,06M NaOH-0,03 M 0,07M tris-0,02M HCl/8,7 ACP,EST,MNR,PER, boric acid/8,0 AP+, (PGI, PGM), AAT 3 0,14M tris-0,044 M 1 Đệm điện cực: 3 Nước DIA,GDH, G6PDH, citric acid/7,5 (tối thiểu)/7,5 MDH, MNR, NDH, PGM, SKDH,IDH, 6PGDH 4 0,14 M tris-0,044M 0,04M tris-0,001M EDTA MDH, PEPCA, citric acid/7,5 0,04M histidine HCl/6,2 6PGDH 5 0,14 M tris-0,049M 1 Đệm điện cực: 3 Nước PEPCA, PGM, SKDH citric acid/6,5 (tối thiểu)/6,5 6 0,04 M citric acid, chuẩn 1 Đệm điện cực: 10 Nước DIA, IDH, MDH, PGM độ với N (3-aminopropyl)- (tối thiểu)/7,0 morpholine/7,0 * Thêm 10% đệm ly trích + AP: alanine và leucine aminopeptidase 22 Bảng 2.2 Các hệ enzyme, dung dịch nhuộm và cách pha hoá chất. Hệ enzyme, EC No., Dung dịch nhuộm (100ml) Thành phần cấu trúc, loại biến dưỡng Đệm/pH Acid phosphatase 0,2M acetic acid 200 mg Na-naphthyl acid ACP 3.1.3.2, mo, II 0,08M NaOH/5,0 phosphate, 90mg Fast Garnet, 4ml MgCl2 Aconitase TrisHCl/8,0 190mg cis-aconitic acid/8,0, ACO 4.2.1.3,mo,I 25mg MTT, 7ml NADP, 3,3ml MgCl2, 3,3ml PMS, 0,6ml Isocitrate dehydrogenase Aminopeptidase 0,05M tris- 50mg L-leucine β- AP 3.4.11.1,mo,II 0,05M maleic naphthylamide-HCl (có thể acid/ 5,4 thay: L-alanine β-napthyla- mide-HCl), 50mg Fast Black K salt Aspartate aminotransferase TrisHCl/8,0 540mg L-aspartic acid/8,0, AAT (=GOT) 70mg α-ketoglutaric acid, 2..6.1.1,di,I 220mg Fast Blue BB salt,10mg pyridoxal-5'- phosphate Diaphorase* TrisHCL/8,0 50mg NADH,2mg 2,6 DIA 1.6.99-,te,II dichlorophenol indophenol, 20 mg MTT Esterase 0,2M NaH2PO4- 100mgcho mỗi α và β-naphthyl EST 3.1.1.1,mo,II 0,16M Na2HPO4 acetate trong 10ml acetone, /6,4 100mg Fast Blue RR salt Glucose-6-phosphate TrisHCl/8,0 120mg D-glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH di-Na- salt, 25mg MTT, 13,5 1.1.1.49, di,I ml NADP, 3,5 ml MgCl2, 3,5 ml PMS Glutamate dehydrogenase TrisHCl/8,0 1,1g L-glutamic acid mono GDH 1.4.1.2,po,II Na- salt, 25mg MTT, 13,5ml NAD, 3,5 mlPMS Isocitrate dehydrogense TrisHCl/8,0 125ml DL-isocitric acid, tri- IDH 1.1.1.42, di, I Na-salt, 25mg MTT, 13,5 ml NADP, 3,5ml MgCl2, 3,5ml PMS 23 Malate dehydrogenase TrisHCl/8,0 150mg 0,5 M DL-malic MDH 1.1.1.37,di,I acid/7,0, 25mg MTT, 13,5ml NAD, 3,5ml MgCl2 , 3,5 ml PMS Menadione reductase* TrisHCl/8,0 100mg menadionbisulfite, MNR 1.6.99.3,di,po,II acid/7,0, NADH, 20 mg MTT NADH-dehydrogenase TrisHCl/8,0 60mg NADH, 20mg MTT NADH 1.6.99.3, di,po,II Peroxidase 0,2 M acetic acid 150mg 3-amino-9-ethyl- PER 1.11.1.7, mo,II 0,08 M NaOH/5,0 carbazole, 8,3ml 30% hydrogen peroxide, 10,4 ml acetone Phosphoenolpyruvate TrisHCl/8,0 165mg 2-phosphoenol carboxylase pyruvate, 330mg NaHCO, 5ml PEPCA 4.1.1.31, di,I MgCl2, 330mg Fast Blue BB salt 6-Phosphogluconate TrisHCl/8,0 75mg gluconate-6-phosphate dehydrogenase tri-Na- salt, 25 mg MTT, 6PGDH 1.1.1.44, di,I 13,5ml NADP, 3,5ml MgCl2, 3,5 ml PMS Phosphogluco isomerase TrisHCl/8,0 38mg fructose-6-phosphate 5,3,1,9, di, I Ba-PGI salt, 0,26ml glucose-6- Phosphate dehydrogenase, 25mg MTT, 13,5ml NADP, 3,5ml MgCl2, 3,5ml PMS Phosphoglucomutase TrisHCl/8,0 150mg α -D-glucose-1- PGM 2.7.5.1, mo, I phosphate, 0,13 ml glucose-6- Phosphate dehydrogenase, 25mg MTT, 13,5 ml NADP, 3,5 ml MgCl2, 3,5ml PMS Shikimate dehydrogenase TrisHCl/8,0 115mg shikimic acid, 25mg SKDH 1.1.125, mo,II MTT, 13,5 ml NADP, 3,5ml MgCl2, 3,5ml PMS * DIA và MNR cả hai có liên quan đến con đường hoá sinh của quinone, chúng được nhuộm với cơ chất (substrate) không chuyên biệt. Để tránh nhầm lẫn trong phân loại, ta nên nhuộm đồng thời cho cả hai hệ enzyme nầy Các chữ viết tắt: EC = Enzyme Commission; mo = monomeric, đơn phân; di = dimeric, nhị phân; te = tetrameric; tứ phân; po = polymeric, đa phân; I, II biểu thị loại biến dưỡng (I= primary, sơ cấp; II= secondary, thứ cấp). 24 3. Phương pháp ước lượng tần số allele 3.1 Phương pháp ước lượng tần số allele Tại một locus có 2 allele A và B, số kiểu gen có thể có là A/A, A/B, và B/B với số cá thể tương ứng là N1, N2, và N3. Tổng số cá thể trong quần thể là = N1+N2+N3. Do mỗi locus có hai allele nên tổng số allele trong quần thể sẽ là: 2N = 2 (N1+N2+N3) Số allele A của cá thể AA = 2 A/B = 1 Tổng số alen A = 2N1+N2 Tần số allele A = qA = (2N1+N2)/2N (1) Tương tự, tần số allele B= qB = (N2+2N3)/2N (2) với qA+ qB =1 Trường hợp lấy mẫu ta có n1, n2, và n3 ta tính như sau: qA = (2n1+n2)/2n ± √(2n1+n2) (2n3+n2)/8n3 (3) σ(qA) = √ qA (1- qA)/2n (4) Với allele A1, A2, ..., Am ta có hệ phương trình như sau: qA1 = (2n1.1 + n1.2 + n1.3 + ...+n1.m)/2n qA2 = (n1.2 + 2 n2,2 + n2.3 + ...+n2.m)/2n (5) : qAm =(nm.1 + nm.2 + nm.3 + ...+nm.m)/2n Sai số chuẩn được tính là: σ(qA1) = √ qA1 (1- qA1)/2n σ(qA2) = √ qA2 (1- qA2)/2n (6) : σ(qAm) = √ qA1 (1- qAm)/2n Thí dụ: locus 6 Pgd của quần thể cá green mussel ở Thailand có allele A, B, và C. Bảy quần thể được thu thập các tỉnh Trat, Rayong, Chon Buri, Samut Sakhon, Phetchaburi, Songkhla, và Phuket (Hình 2.1) được phân tích. Điện di đồ của tất cả các cá thể cá được trình bày qua Hình 2.2. Tần số kiểu gen tại locus 6Pgd của 7 quần thể cá green mussel tại Thailand được trình bày trong Bảng 2.3. 25 Hình 2.1 Địa diểm các quần thể cá trơn được lấy mẫu tại Thái Lan 26 27 28 29 30 Bảng 2.3 Tần số kiểu gen tại locus 6Pgd của 7 quần thể cá green mussel của Thailand Quần thể Kiểu gen Số A/A B/B C/C A/B A/C B/C cá thể Trat 0 37 1 4 1 7 50 Rayong 0 34 0 2 0 5 41 Chon Buri 0 48 0 10 1 10 69 Samut Sakhon 0 72 0 8 2 7 89 Phetchaburi 1 32 0 8 0 8 49 Songkhla 1 34 0 8 0 4 47 Phuket 0 23 0 4 1 3 31 Áp dụng công thức (5) ta có: qA = (2 x 0 + 4 +1) /2 x 50 = 0,050 qB = ( 2 x 37+ 4 + 7) /2 x 50 = 0, 850 qC = ( 2x 1 + 1 + 7) /2 x 50 = 0,100 Sai số chuẩn là: σ(qA) = √0,050 (1-0,050) /2 x 50 = 0,021 σ(qB) = √0,850 (1-0,850) /2 x 50 = 0,036 σ(qC) = √0,100 (1-0,100) /2 x 50 = 0,030 3.2 Kiểm định sự khác biệt tần số allele Kiểm định tính khác biệt tần số allele giữa các quần thể có thể ước lượng theo t- test. Khi tần số allele của một quần thể là X1, sai số chuẩn là SE1, quần thể khác là X2 với sai số chuẩn là X2. Giá trị kiểm định t được tính theo công thức: t = |X1-X2| / √ (SE1)2 + (SE2)2 (7) Với n đủ lớn (>30) giá trị chuẩn của t = 1,960 khác biệt ở mức ý nghĩa 5%. giá trị t phải lớn hơn 1,960 và không khác biệt có ý nghĩa khi giá trị t < 0,960. 31 Bảng 2.4 Tần số allele ở locus 6Pgd của 7 quần thể cá green mussel của Thailand. Quần thể Tần số allele ± sai số chuẩn qA ± σ(qA) qB ± σ(qB) qC ± σ(qC) Trat 0,050±0,021 0,850±0,036 0,100±0,030 Rayong 0,024±0,017 0,915±0,031 0,061±0,026 Chon Buri 0,080±0,023 0,840±0,031 0,080±0,023 Samut Sakhon 0,056±0,017 0,893±0,023 0,051±0,016 Phetchaburi 0,102±0,031 0,816±0,039 0,082±0,028 Songkhla 0,106±0,032 0,851±0,037 0,043±0,021 Phuket 0,081±0,035 0,854±0,045 0,082±0,035 Bảng 2.5 Kiểm tra sự khác biệt tất cả các allele giữa các cặp trong các quần thể cá A allele Quần thể 1 2 3 4 5 6 1.Trat - 2.Rayong 0,943 3.Chon Buri 0,945 1,957 4.Samut Sakhon 0,216 1,325 0,833 5.Phetchaburi 1,385 2,233* 0,574 1,311 6.Songkhla 1,454 2,280* 0,662 1,381 0,091 7.Phuket 0,757 1,479 0,024 0,646 0,454 0,455 B allele Quần thể 1 2 3 4 5 6 1.Trat - 2.Rayong 2,357 3.Chon Buri 0,315 2,621* 4.Samut Sakhon 1,548 0,911 1,839 5.Phetchaburi 0,906 2,834* 0,626 2,194* 6.Songkhla 0,026 1,779 0,280 1,163 0,794 7.Phuket 0,098 1,582 0,336 1,001 0,822 0,064 32 C allele Quần thể 1 2 3 4 5 6 1.Trat - 2.Rayong 1,414 3.Chon Buri 0,630 0,664 4.Samut Sakhon 1,764 0,414 1,006 5.Phetchaburi 0,479 0,601 0,052 0,883 6.Songkhla 1,480 0,500 0,942 0,221 0,885 7.Phuket 0,440 0,545 0,048 0,801 0 0,830 4. Phương pháp ước lượng: Độ biến dị di truyền (genetic variability) 4.1 Độ dị hợp (heterozygosity) Độ dị hợp thường được dùng để ước lượng độ biến dị di truyền trong một quần thể. Độ dị hợp được định nghĩa là tần số tương đối của số cá thể phát sinh tính dị hợp (heterogenesis) cho mỗi locus. Có hai dạng độ dị hợp la độ dị hợp quan sát (Ho) và độ dị hợp lý thuyết (He). Độ dị hợp quan sát là trung bình số cá thể được quan sát thực tế của cá thể phát sinh tính hợp tử tại mỗi locus. Độ dị hợp tử quan sát là (Ho) được tính như sau: Ho = Σtần số kiểu gen dị hợp tử / Σ(kiểu gen đồng hợp + kiểu gen dị hợp) Độ dị hợp tử lý thuyết là: he = 1 - ΣXi2 (8) trong đó Xi là tần số allele thứ i tại một locus trong quần thể X He= Σhe/r (9) với r là số locus 4.2 Ứơc lượng lượng độ dị hợp tử Quá trình tính toán được dựa trên các dữ liệu thu thập cá trơn (catfish) từ các tỉnh Chiang Rai, Prachin Buri, Chachoeng Sao, Pattani và Yala (hình) Tại tỉnh Prachin Buri, độ biến dị được tìm thấy tại các locus Gpi, Me, Mpi và Pgm (Bảng 2.6) 33 Bảng 2.6 Kiểu gen của quần thể cá trơn tại tỉnh Prachin Buri Locus Kiểu gen Số Dị hợp/N Tần số Gpi A/A 73 0 A/B 1 1/74 0,014 Me A/A 21 0 A/B 28 28/60 0,467 Mpi A/B 1 1/74 0,014 B/B 73 0 Pgm A/A 64 0 A/B 9 9/74 0,122 Độ dị hợp/N (bảng 3) chính là độ dị hợp quan sát, tổng giá trị là Ho = (0,014 + 0,467 + 0,014 + 0,122) / 9 = 0,069 Tổng số locus được quan sát là 9. Tần số allele của 5 quần thể cá trơn được trình bày ở bảng 4. Các giá trị từ Bảng trên ta ước lượng độ dị hợp lý thuyết ở các locus biến dị (Gpi, Me, Mpi và Pgm) theo công thức (8) là : Gpi he = 1-(0,9922 + 0,0082) # 0,016 Me he = 1- ( 0,5832 + 0,4172) # 0,486 Mpi he = 1 - (0,9922 + 0,0082) # 0,016 Pgm he = 1 - (0,9392 + 0,0612) # 0,115 Suy ra, He của quần thể cá trơn tại tỉnh Prachin Buri tính theo công thức (9) là: He = (0,016 + 0,486 + 0,016 + 0,115) / 9 # 0,070 với 9 là số locus. Bảng 2.7 Tần số các allele của 5 quần thể cá trơn Locus allele Chiang Rai Prachin Buri Chachoeng SaoPattani Yala α Gpd-1 A 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 α Gpd-2 A 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 Gpi A 1,000 0,992 1,000 1,000 1,000 B 0 0,008 0 0 0 Ldh A 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 ldh A 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 Me-3 A 0,777 0,583 0,622 1,000 1,000 B 0,223 0,417 0,378 0 0 Mpi A 0 0,008 0,015 0 0 B 1,000 0,992 0,985 1,000 1,000 6Pgd A 1,000 1,000 1,000 0,830 0,725 B 0 0 0 0,170 0,275 Pgm A 1,000 0,939 0,909 0,966 1,000 B 0 0,061 0,091 0,034 0 34 Bảng 2.8 trình bày các kết quả ước lượng độ biến dị di truyền của 5 quần thể cá trơn. Độ dị hợp quan sát biến thiên từ 0,041 đến 0,075, trung bình là 0,054. Độ dị hợp lý thuyết biến thiên từ 0,039 đến 0,074, trung bình là 0,053. Bảng 2.8 Độ biến dị di truyền của 5 quần thể cá trơn Độ dị hợp Chiang - Prachin- Chachoeng- Pattam Yala Trung bình Rai Buri Sao Ho 0,046 0,070 0,075 0,040 0,041 0,054 He 0,039 0,071 0,074 0,039 0,044 0,053 5. Phương pháp tính độ phân hoá di truyền (degree of genetic divergence) 5.1 Trung bình khoảng cách di truyền Để quản lý các quần thể như là một nguồn vật liệu chọn tạo giống, việc nghiên cứu độ phân hoá di truyền giữa các quần thể là cần thiết. Khoảng cách di truyền thường được dùng để ước lượng độ phân hoá di truyền giữa các quần thể liên hệ và các quần thể địa phương. Xét hai quần thể X và Y, trong đó nhiều allele phân ly tại một locus. Đặt xi và yi là tần số allele thứ i trong X và Y theo thự tự. Trong quần thể X, xác suất chọn ngẫu nhiên ra hai allele đồng nhất là: jx =Σ xi2 (10) trong quần thể Y là: jy = Σyi2 (11) Xác suất một gen đồng nhất từ X và một gen từ Y là: jxy = Σxiyi (12) Độ phân hoá di truyền giữa hai quần thể X và quần thể Y có thể được tính bằng cách so sánh giữa jx, jy, và jxy. Khoảng cách di truyền (d) giữa hai quần thể X và qùuân thể Y tại một locus được định nghĩa là: d = - ln jxy / √(jxjy) Tính đồng nhất của các gen giữa quần thể X và quần thể Y cho tất cả các locus được định nghĩa là: D = - ln (JXY / √JX JY) (13) trong đó JX, JY, và JXY là các trung bình đại số của jx, jy, và jxy theo thứ tự, cho tất cả các locus, kể cả các locus đơn hình 35 5.2 Cách tính khoảng cách di truyền Nei Ta lấy thí dụ quần thể cá trơn ở Chiang Rai (quần thể X) và quần thể cá trơn Prachin Buri (quần thể Y) để tính khoảng cách di truyền Nei, kết quả tính tần số allele của các quần thể cá trơn. Tại locus αGpd-1, áp dụng công thức (10), xác suất chọn ra hai allele ngẫu nhiên đồng nhất trong quần thể Chiang Rai là: jx = 1 2 + 02 = 1 Áp dụng công thức (11) với quần thể ở Prachin Buri, xác suất chọn hai allele ngẫu nhiên đồng nhất là: jy = 1 2 + 02 = 1 Áp dụng công thức (12), xác suất một gen từ quần thể Chiang Rai và một gen từ quần thể Prachin Buri là đồng nhất là: jxy = (1 x 1) + (0 x 0) = 1 Tương tự, tại locus Gpi, giá trị jx của quần thể ở Chiang Rai là: jx = 1 2 + 02 = 1 giá trị jy của quần thể ở Prachin Buri là: jxy = (1 x 0,992) + (0 x 0,008) = 0,992 Giá trị jx, jy, và jxy được tính theo mỗi locus trong 9 locus, và sau đó lấy tổng các giá trị : jx = 8,653458 jy = 8,367476 jxy = 8,468982 Khoảng cách di truyền Nei giữa hai quần thể Chiang Rai và Prachin Buri được tính theo công thức (13) là: D = 0,0047 Kết quả tính jx, jy , jxy , và khoảng cách di truyền của mỗi cặp của các quần thể cá trơn ở Thailand được trình bày qua bảng 2.9 và bảng 2.10. Bảng 2.9 jx, jy , jxy của các quần thể cá trơn ở Thailand JX và JY Quần thể Chiang Rai 8,653458 Prachin Buri 8,367476 Chachoeng Sao 8,334780 Pattani 8,652112 Yala 8,601250 36 JXY Quần thể 1 2 3 4 5 1. Chiang Rai - 2. Prachin Buri 8,468982 3. Chachoeng Sao 8,461588 8,348594 4. Pattani 8,573000 8,306147 8,318188 5. Yala 8,502000 8,231000 8,241000 8,614500 - Bảng 2.10 Khoảng cách di truyền Nei giữa các quần thể cá trơn Quần thể 1 2 3 4 5 1. Chiang Rai - 2. Prachin Buri 0,0047 - 3. Chachoeng Sao 0,0037 0,0003 - 4. Pattani 0,0093 0,0241 0,0207 - 5. Yala 0,0146 0,0302 0,0283 0,0014 - Trong ma trận khoảng cách di truyền, nếu hai quần thể là đồng nhất khi tần số allele ở 20 locus theo thứ tự, khoảng cách phải bằng không (zero). Nếu hai quần thể bị cô lập do địa lý hay do sinh sản thì hai quần thể có khuynh hướng tích luỹ các allele khác nhau. Sự khác biệt càng lớn thì khoảng cách di truyền càng lớn. Với thí dụ nầy ta thấy khoảng cách di truyền biến thiên trong khoảng 0,0003 đến 0,0302, trung bình chung là 0,0137. Khoảng cách bé nhất là quần thể cá trơn ở Prachin Buri và Chachoeng Sao, khoảng cách lớn nhất là giữa Prachin Buri và Yala. 5.3 Cách vẽ một cây quan hệ di truyền tiến hoá (dendrogram) Để hiểu được mối quan hệ di truyền giữa các quần thể ta cần vẽ cây quan hệ di truyền tiến hoá dựa trên cơ sở trung bình khoảng cách di truyền. Một phương pháp so sánh cặp không đối trọng (unweighted pair method) thường được áp dụng. Theo phương pháp nầy, hai quần thể mà khoảng cách di truyền giữa chúng là nhỏ nhất được xem như là cùng một quần thể và nhằm tạo ra matrix nhỏ hơn. Cách tính như sau: Nếu khoảng cách di truyền giữa hai quần thể (3) và (4) là tối thiểu (D3.4), quần thể (3) và (4) được xem là một nhóm khởi đầu Ma trận sơ cấp (1) (2) (3) (4) (1) - (2) D1.2 - (3) D1.3 D2.3 - (4) D1.4 D2.4 D3.4 - 37 Giá trị D1.(3.4) và D2. (3.4) là trung bình đại số của D1.3 và D1.4, D2,3 và D2,4 theo thứ tự. Ma trận sơ cấp được giảm xuống thành ma trận thứ cấp Ma trận thứ cấp (1) (2) (3)(4) (1) - (2) D1.2 - (3)(4) D1.(3.4) D2.(3.4) - Kế đến, nếu khoảng cách di truyền của D2.(3.4) là tối thiểu, quần thể (2) và (3)(40 sẽ trở thành một nhóm. Ma trận thứ cấp sẽ trở thành ma trận sau cùng. Ma trận sau cùng (1) (2)(3)(4) (1) - (2)(3)(4) D1.(2.3.4)- Cách tính cụ thể như sau: Bảng 2.11 Ma trận sơ cấp khoảng cách di truyền giữa các quần thể Quần thể 1 CR 2 PB 3 CS 4PT 5 YL 1. Chiang Rai - 2. Prachin Buri 0,0047 - 3. Chachoeng Sao 0,0037 0,0003 - 4. Pattani 0,0093 0,0241 0,0207 - 5. Yala 0,0146 0,0302 0,0283 0,0014 Giá trị nhỏ nhất là 0,0003 giửa Prachin Buri và Chachoeng Sao nên trở thành một nhóm, khoảng cách di truyền của nhóm mới nầy với các nhóm khác như sau: CR - nhóm (PB, CS) = (0,0047 +0,0037)/2 = 0,0042 PT - nhóm (PB, CS) = (0,0241 + 0,0207)/2 = 0,0224 YL - nhóm (PB, CS) = (0,0302 + 0,0283)/2 = 0,0293 38 Bảng 2.12 Ma trận thứ cấp khoảng cách di truyền của các quần thể 1. CR 23 PB/CS 4PT 5YL 1 Chiang Rai - 2,3 PB/CS 0,0042 - 4 Pattani 0,0093 0,0224 - 5 Yala 0,0146 0,0293 0,0014 - Trong ma trận thứ cấp, giá trị khoảng cách di truyền nhỏ nhất là 0,0014 giữa hai quần thể Pattani và Yala. Áp dụng cùng phương pháp, ma trận thứ cấp trở nên nhỏ hơn như sau: Bảng 2.13 Ma trận cấp ba khoảng cách di truyền 1 CR 2.3 PB/CS 4.5 PT/YL 1 Chiang Rai - 2.3 PB/CS 0,0042 - 4.5 PT/YL 0,0120 0,0259 - Bảng 2.14 Ma trận sau cùng 1.2.3 CR/PB/CS 4.5 PT/YL 1.2.3 CR/PB/CS - 4.5 PT/YL 0,0190 - 39 Từ các giá trị trên ta vẽ biểu đồ sau: 0 0,005 0,01 0,015 0,02 Khi khoảng cách di truyền giữa các quần thể PB và CS là 0,0003 là tối thiểu trong ma trận sơ cấp nên gộp chung thành một nhóm (Hình). Kế đến, giá trị khoảng cách di truyền tối thiểu giữa hai quần thể PT và YL có thể gộp chung thành một nhóm với khoảng cách là 0,0014. Trong ma trận thứ ba, quần thể CR, PB, và CS tạo thành một nhóm với khoảng cách di truyền là 0,,0042. Tổng cộng 5 quần thể có thể nhóm lại với khoảng cách di truyền là 0,0190 (# 0,02). Kết luận: PB và CS; PT và YL có mối quan hệ rất gần về mặt di truyền. Kết quả nầy phù hợp với khoảng cách địa lý. Khoảng cách 0,01 được xem là ở mức độ chủng (race). Với khoảng cách nầy ta có thể phân 5 quần thể thành hai nhóm. Cách phân nhóm nầy biểu thị sự phân hoá các chủng khác nhau giữa miền Bắc và miền Nam Thailand. PB CS PT YL CR PB CS CR PB CS PT YL Hình 2.3 Mối quan hệ tiến hóa di truyền giữa các quần thể cá trơn tại Thái Lan. Khoảng cách Nei 40 Tài liệu tham khảo Gerhard Muller-Starck (1998) Isozyme. In Molecular tools for screening biodiversity: Plants and animals. Chapman & Hall. p 75-81. Markert C.L., Moller F. (1959) Multiple forms of enzymes: tissue, ontogenetic, and species specific patterns. Proceedings of the National Academy of Sciences. USA 45: 753- 763. Motoyuki Hara and Uthairat Na-Nakorn (1996) Development of sustainable aquaculture Technology in Southeast Asia: Focused on genetics and physiology.Under the Cooperative research program between JICA, Japan and Faculty ò Fisheries in Kasetsart University, Thailand. Pp79. Lewontin R.C., Hubby J. L. (1966) A molecular approach to the study of genic heterozygosity in natural populations. II. Amount of variation and degree of heterozygosity in natural populations of Drosophila pseudoobscura. Genetics 54: 595-609. Brown A. H. D., Allard R. W. (1969) Inheritance of isozyme differences among inbred parents of a reciprocal recurrent selection population of maize. Crop Science 9: 72- 75. Hamrick J. L., Godt M. J. W. (1989) Allozyme diversity in plant species. p 43-63 in Brown A.H. D., Clegg M. T., Kahler A. L., Weir B.S. (eds) Plant population genetics, breeding, and genetic resources. Sunderland, Mass.; Sinauer Associates. Soltis D. E. and Soltis P. S. (eds) (1989) Isozymes in plant biology. Chapman and Hall, London. 41 Trang tham khảo Một số hệ enzyme trên hạt lúa (J.C. Glaszmann, B.G. de ló Reyes, and G.S. Khush 1988. IRRI paper series, No. 134. Pp15.) Hình 2.4 Điện di đồ lưỡng phân của enzyme glumate osaloacetate transaminase (GOT) Got-3 và Got-1. Hình 2.5 Điện di đồ của esterase (EST,bên trái) và acid phosphatase (ACP-1, bên phải) Hình 2.6 Điện di đồ của acid phosphatase (ACP-2 và ACP-4) 58 Hình 3.4 Một thí dụ phương pháp ÀFLP dùng một cặp mồi (Life Technologies 2002) Bảng 3. 1 Đặc tính của marker phân tử Marker hoặc kỹ thuật Đặc tính Cần phân tích trình tự ADN Khó phát triển Mức độ đa hình Lượng ADN Xác định kiểu gen Tiền RFLP Enzyme cắt giới hạn Không Tương đối dễ làm Thấp – trung bình Cao Không Thấp Finger printing Lai Southern Không Tương đối khó Cao Cao Không Cao ÀFLP Enzyme cắt giới hạn, nối, PCR Không Tương đối dễ - khó Cao Thấp Không Trung bình RAPD Primer ngẫu nhiên Không Tương đối dễ Trung bình - cao Thấp Không Tương đối thấp SSR Locus chuyên biệt lặp lại ngắn Có Khó Cao Thấp Có Trung bình – cao PCR-RFLP Sau PCR dùng enzyme cắt giới hạn Có Tương đối dễ - khó Trung bình Thấp Có cho ADN đơn bội Thấp – trung bình Phân tích trực tiếp trình tự Sau PCR, phản ứng PCR sequencing Có Tương đối dễ - khó Rất cao Thấp Có cho ADN đơn bội Cao Bảng 3.2 Phạm vi ứng dụng của các kỹ thuật ADN mục tiêu Phương pháp Chủ đề cần chú ý Khả năng áp dụng ADN nhân RFLP Phân biệt giống/dòng hoặc các loài liên hệ Tính tương đồng di truyền giữa các loài liên hệ Finger printing Phân biệt dòng vô tính, quan hệ giống/dòng, phân tích quan hệ cha con, ... Tính tương đồng di truyền giữa các quần thể ÀFLP Phân biệt dòng vô tính, quan hệ giống/dòng, phân tích quan hệ cha con, ... Tính tương đồng di truyền giữa các quần thể RAPD Phân biệt dòng vô tính, quan hệ giống/dòng, phân tích quan hệ cha con, ... Tính tương đồng di truyền giữa các quần thể ISSR Phân biệt dòng vô tính, quan hệ giống/dòng, phân tích quan hệ cha con, ... Tính tương đồng di truyền giữa các quần thể SSR Cấu trúc di truyền quần thể, phân tích quan hệ họ hàng hay cha mẹ,... Tính tương đồng di truyền giữa các quần thể PCR-RFLP Phân biệt các loài liên hệ hay giống/dòng Tính tương đồng di truyền giữa các loài liên hệ Sequencing Từ quần thể di truyền đến phân loài ADN lục lạp PCR-RFLP Phân biệt các loài liên hệ hay giống/dòng Tính tương đồng di truyền giữa các loài liên hệ SSR Quan hệ di truyền giữa quần thể, loài,... Phân