Khảo sát quá trình lên men acid lactic bởi lactobacillus delbrueckii

tinh khiết. [5] 2.1.6.2. Phương pháp sản xuất hiện đại: Phương pháp thẩm tích điện và trao đổi ion Phương pháp này khác với phương pháp truyền thống ở 2 nội dung: Thay đổi giống và môi trường lên men. Thay đổi phương pháp thu nhận acid lactic. Giống và môi trường lên men: Giống dùng trong quá trình lên men là Lactobacillus acidophilus. Lượng giống cho vào để lên men là 5% so với dung dịch lên men. Dung dịch chứa đường: 40 – 100 đường trong 1000ml 1% dầu bắp thô 1 – 4% nước chiết bắp Người ta bổ sung khá nhiều khoáng vi lượng vào môi trường lên men. Nhiệt độ lên men 40 – 50 oC Điều chỉnh pH trong suốt quá trình lên men là 4,8 – 5,7 bằng NaOH [5] Phương pháp thu nhận acid lactic Sau khi lên men người ta dùng CaCO3 đưa pH dung dịch lên men đến pH 6,5 và thực hiện các điều kiện cho việc tạo thành lactic canxi như phương pháp truyền thống. Toàn bộ dung dịch, cả phần lactate và sinh khối được đưa vào thiết bị thẩm tích điện (eletro dialysis) để thu nhận lactate canxi ở dạng lỏng và sinh khối vi sinh vật. Sinh khối vi sinh vật có khả năng lên men sẽ được chuyển ngược lại để lên men mẻ kế tiếp. Lactat canxi được cô đặc chân không và chuyển sang máy thẩm tích điện trích ly (water spiltting eletrodialysis ) để thu nhận acid lactic. Dung dịch acid lactic sẽ được đưa qua cột trao đổi ion để tách các ion Ca+ và các cation khác. Acid lactic sau khi thu được sẽ có độ tinh thiết 99%. [5] 2.1.6.3.Phương pháp thu nhận acid lactic Phương pháp thu nhận acid lactic ở pH > pKa Đầu tiên người ta cho dung dịch lên men tiếp xúc với chất hấp thụ alamin 336 (tricaprylylamin hòa tan trong methyl iso butylketone). Tiếp đến, chất hấp phụ sẽ tiếp xúc với ammoniac và trialkylamin phân tử thấp là trimethylamin (TMA). TMA sẽ được tạo thành trimethylamonium (TMAm), sau đó TMA và hơi nước sẽ được tái sử dụng, còn acid lactic sẽ được thu nhận. Phương pháp tách pha Acid lactic được chuyển thành lactat canxi ở dung dịch lên men. Dung dịch này được chuyển qua thiết bị lọc. Phần sinh khối được tái sử dụng. Phần lactat hòa tan được cô đặc đến khoảng 40 – 70% khối lượng ban đầu. ( Người ta điều chỉnh pH bằng NaCO3 đến pH 6,0 – 6,5 để tạo ra lactate natri). Lactat natri được đưa vào thiết bị chứa trialkylamin và khí CO2 ở áp suất 75pSi. Lúc này dung dịch sẽ tạo thành hai pha: * Pha hữu cơ gồm chất hấp phụ acid lactic. * Pha hòa tan gồm muối carbonate natri và acid carbonic. Người ta thu hồi acid lactic từ pha hữu cơ bằng phương pháp chưng cất chân không với áp suất 2 – 10mmHg, ở nhiệt độ 80 – 240 oC. [5] 2.2. Giới thiệu về rỉ đường mía. 2.2.1. Thành phần cấu tạo Rỉ đường mía là phần còn lại của dung dịch đường sau khi đã tách phần đường kính kết tinh. Số lượng và chất lượng của rỉ đường phụ thuộc vào giống mía, điều kiện trồng trọt, hoàn cảnh địa lý và trình độ kỹ thuật chế biến của nhà máy đường. Thông thường rỉ đường mía thu được bằng 3 ÷ 4% trọng lượng mía đưa vào chế biến. Thành phần chính của rỉ đường là đường, các chất phi đường và nước. Rỉ đường mía có khoảng 20% nước, 62% đường và 10% chất phi đường hoặc cao hơn một chút. Đường trong rỉ đường bao gồm 25 – 40% saccaroza. 15 – 25% đường khử ( glucoza và fructoza ) và 3 – 5% đường không lên men được tạo nên trong quá trình chế biến đường. Ở đây do nhiều lần pha loãng và cô đặc một lượng nhất định saccaroza bị biến thành hợp chất tương tự dextrin do tác dụng của nhiệt. Chất này có tính khử nhưng không lên men được và không có khả năng kết tinh. [2] Ngoài saccaroza, glucoza và fructoza rỉ đường mía còn có một lượng nhỏ các loại đường khác như rafinoza, lactoza, mantoza và xyloza. [3] Các chất phi đường gồm phi đường hữu cơ và phi đường vô cơ. Phi đường hữu cơ chứa nitơ của rỉ đường mía chủ yếu là các acid amin cùng với một lượng rất nhỏ protein và sản phẩm phân giải của nó. Các acid amin từ nước mía dễ dàng đi vào rỉ đường vì phần lớn chúng rất dễ hòa tan trong nước trừ tiroxin và xixtin.. Nitơ tổng số trong rỉ đường mía của Mỹ xê dịch trong khoảng 0.4 ÷ 1.5% trung bình là 0.7% trọng lượng của rỉ đường Hợp chất phi đường không chứa nitơ bao gồm pectin, araban, galactan hoặc các sản phẩm thủy phân của chúng là arabinoza và galatoza, chất nhầy, chất màu và chất thơm. Pectin bị kết tủa trong quá trình chế biến đường nhưng các chất vừa nói không kết tủa và gần như toàn vẹn đi vào rỉ đường (1.22 – 1.56%). Matubara. K. và Kinoshita, S. đã phân tích định tính các loại acid hữu cơ và cho biết các acid sau đây có trong rỉ đường mía của các nước Đông Nam Á : acid aconitic, lactic, malic, xucxinic, glycolic, xitric và lượng nhỏ fumaric, oxalic và gluconic. Riêng acod aconitric có nồng độ khá cao, xấp xỉ 1.0 – 1.5%. Sự có mặt của acid này càng nhiều thì sản lượng đường càng thấp. Đặc biệt các loại mía có vị chua không thể đưa vào sản xuất được. Mía trồng ở những vùng quá nóng như Louisiana và Florida phát triển rất nhanh nên nồng độ aconitic trong mía là 0.1 – 0.2% và trong rỉ đường là 3 – 7%. Do vậy người ta đã tiến hành thu hồi loại acid này làm phụ phẩm của nhà máy đường trước khi đem rỉ đường đi chế biến. Các chất màu của rỉ đường bao gồm các chất caramen, melanoit, melanin và phức phenol-Fe+2. Cường độ màu tăng ba lần khi nhiệt độ tăng thêm 10 oC. Có thể chia các hợp chất màu thành nhiều nhóm: _ Chất caramen: Xuất hiện nhờ quá trình nhiệt phân sacharoza kèm theo lọai trừ nước và không chứa một chút nitơ nào. Khi pH không đổi, tốc độ tạo chất caramen tỉ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. _ Phức chất polyphenol -Fe+2: là Fe+2- brenzcatechin có màu vàng xanh không thể loại hết ở giai đoạn làm sạch nước mía và đi vào rỉ đường. _ Melanoidin: Đây là sản phẩm ngưng tụ của đường khử và acid amin mà chủ yếu là acid aspactic. Sản phẩm ngưng tụ quen biết nhất là acid fuscazinic đóng vai trò quan trọng làm tăng độ màu của rỉ đường. _ Melanin: Được hình thành nhờ phản ứng oxy hóa khử các acid amin thơm nhờ xúc tác của enzyme polyphenol-oxydaza khi có mặt của O2 và Cu+2. Các acid amin thơm thường bị oxy hóa là tiroxin và brenzocatechin. Các melanin thường bị loại hết ở giai đoạn làm sạch nước đường nên chỉ tìm thấy lượng rất nhỏ trong rỉ đường. _ Humin: Được trùng hợp từ 66 – 68 các đơn vị cấu tạo của acid amin. Từ đó phân tích ra khoảng 52 – 53 gốc acid aspactic, 5 gốc acid amino-β-butyric, 2 gốc acid glutamic, 2 gốc β- amino propionic và 1 gốc acid p- butyric, 2 gốc acid -p- amino- izovaleric. _ Ngoài ra rỉ đường còn chứa hợp chất màu nâu có công thức cấu tạo C17-18H26-27O10N. [3] _ Chất keo: Có trong rỉ đường chủ yếu là pectin, chất sáp và chất nhầy. Các chất này ảnh hưởng rất nhiều đến sự phát triển của vi sinh vật tạo thành màng bao bọc quanh tế bào ngăn cản quá trình hấp thụ các chất dinh dưỡng và thải các sản phẩm trao đổi chất của tế bào ra ngoài môi trường. Ngoài ra các chất keo là nguyên nhân chính tạo ra một lượng bọt lớn trong nuôi cấy vi sinh vật, giảm hiệu suất sử dụng thiết bị. _ Các chất phi đường vô cơ chủ yếu là các loại muối tìm thấy trong thành phần tro của rỉ đường. Độ tro của rỉ đường mía thấp hơn độ tro của rỉ đường củ cải đường. Muối Kali có khá nhiều trong rỉ đường tiếp đến là canxi và dư lượng SO2. Điều này dễ hiểu vì muối Kali được dùng để bón cho mía còn muối canxi và gốc sunfat được thêm vào ở giai đoạn xử lý nước mía và tinh luyện đường. Bảng 2.1 Thành phần tro trong chất khô của rỉ đường mía và rỉ đường củ cải (%) [2] Thành phần Rỉ đường củ cải Rỉ đường mía K2O 3.9 3.5 CaO 0.26 1.5 SiO2 0.10 0.5 P2O5 0.06 0.2 MgO 0.16 0.1 Na2O 1.30 Al2O3 0.07 0.2 Fe2O3 0.02 Dư lượng CO2 3.50 - Dư lượng SO2 0.55 1.6 Cl- 1.60 0.4 Tổng số 11.52 8.0 2.2.2. Thành phần các chất sinh trưởng Ngoài các nguyên tố kim loại và các á kim kể trên, rỉ đường mía còn chứa nhiều các nguyên tố khác với lượng cực kỳ nhỏ chỉ có thể tính bằng mg/kg rỉ đường như: Fe 115 mg, Zn 34 mg, Mn 18 mg, Cu 4.9 mg, B3.0 mg, Co 0.59 mg và Mo 0.2 mg. Rỉ đường mía rất giàu các chất sinh trưởng như acid pantotenic, nicotinic, folic, B1, B2 và đặc biệt là biotin. Rỉ đường mía Mĩ không thua kém cao ngô là loại vẫn thường dùng làm nguồn cung cấp chất sinh trưởng cho một số loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật. Bảng 2.2 Thành phần một số chất sinh trưởng của rỉ đường mía và cao ngô (µ/100gam) [3] Loại chất sinh trưởng Rỉ đường mía Cao ngô Mexico Cuba Mĩ B1 140 - 830 640 B2 - - 250 510 B6 700 - 650 910 Acid nicotinic - - 2100 8900 Acid pantotenic 12000 - 2140 510 Acid folic - - 3.8 12 Biotin 65 10.8 120 49 2.2.3. Vi sinh vật trong rỉ đường mía: Có rất nhiều vi sinh vật trong rỉ đường mía. Đa số chúng từ nguyên liệu, một số nhỏ từ không khí, và đất vào dịch đường. Loại nào chịu được tác dụng nhiệt hay tác dụng của hóa chất thì tồn tại. Có thể phân chúng thành 3 loại: Vi khuẩn, nấm men và nấm mốc. Trong đó lọai đầu là nguy hiểm hơn cả vì nó gồm nhiều giống có khả năng sinh bào tử. Người ta chia rỉ đường làm 3 loại tùy theo số lượng vi sinh vật tạp nhiễm ( Bảng 2.3): Bảng 2.3 Phân loại rỉ đường theo số lượng vi sinh vật tạp nhiễm[3] Loại rỉ đường Số lượng vi sinh vật trong 1 gram rỉ đường Đánh giá và xử lý I 100,000 Rất tốt, không cần xử lý II 100,000 – 1,000,000 Trung bình, cần thanh trùng. III 1,000,000 – 5,000,000 Nhiễm nặng, cần xử lý nghiêm ngặt bằng hóa chất và tác dụng nhiệt. 2.2.4. Lực đệm của rỉ đường mía Lực đệm là loại lực có sức tự cản sự biến đổi phản ứng của rỉ đường khi bổ sung kiềm hoặc axít. Rỉ đường mía có tính đệm đặc trưng. Bình thường pH của rỉ đường mía nằm trong khỏang 5.3 – 6.0 . Trong quá trình bảo quản pH có thể bị giảm do hoạt động của vi sinh vật tạp nhiễm tạo ra các acid hữu cơ. Khi thêm HCl hay H2SO4 vào rỉ đường, acid sẽ tác dụng với các muối kiềm của các acid hữu cơ tự do, qua đó pH của rỉ đường bị thay đổi rất ít khi tiếp tục thêm acid HCl hay H2SO4. Lực đệm của rỉ đường biểu hiện mạnh nhất ờ pH 3.0 – 5.0, trung bình ở pH5.0 – 6.0 và rất ít ở pH 6.0 – 7.07. Mía đường là thế mạnh của Việt Nam, vào năm 2000 đạt năng suất triệu tấn/năm. Do đó khả năng tận dụng nguồn rỉ đường là rất lớn. Hiện nay rỉ đường chủ yếu được ứng dụng sản xuất acid lactic và ethanol. Nghiên cứu của Arti Dumbrepatil, Mukund Adsul, Shivani Chaudhari, Jayant Khire, and Digambar Gokhale tại Ấn Độ, sử dụng nguồn rỉ đường để lên men sản xuất acid lactic, tác giả đã sử dụng nguồn đường trong rỉ đường cung cấp nguồn carbon cho vi khuẩn Lactobacillus delbrueckii subsp, do trong rỉ đường hàm lượng protein rất thấp do đó cần bổ sung cao nấm men cung cấp nitơ cho vi khuẩn. Kết quả khảo sát hàm lượng cao nấm men 0.5g/l cho hàm lượng acid lactic đạt nồng độ tối ưu là 166g/l.[8] 2.3. Cố định tế bào vi sinh vật: 2.3.1. Định nghĩa: Sự cố định tế bào vi sinh vật được xác định như là quá trình gắn tế bào vi sinh vật vào phase riêng biệt tách khỏi phase tự do của dung dịch nhưng vẫn có khả năng trao đổi chất với các phân tử cơ chất có mặt trong phase tự do nói trên. Phase chứa tế bào thong thường không tan trong nước và là polymer cao phân tử có tính ưa nước. Tế bào sau khi cố định có thể sử dụng nhiều lần, không lẫn vào sản phẩm và có thể chủ động ngừng phản ứng nếu mong muốn. 2.3.2. Ưu điểm và nhược điểm của tế bào vi sinh vật cố định: Ưu điểm: Enzyme của tế bào ổn định hơn enzyme ở dạng tự do khi tế bào được gắn trên chất mang polymer tự nhiên, cố định tế bào vi sinh vật không đòi hỏi khâu tách chiết và tinh sạch enzyme, tế bào vi sinh vật cố định có khả năng thực hiện các quá trình gồm nhiều phản ứng enzyme kế tiếp nhau và có thể được sử dụng nhiều lần theo chu kỳ hoặc liên tục, trong tế bào vi sinh vật cố định ,song song với quá trình trao đổi chất còn diễn ra quá trình tái tạo cofactor. Nhược điểm: Protease có mặt trong tế bào vi sinh vật có thể gây hiện tượng thủy giải đối với enzyme mà ta quan tâm, trong tế bào vi sinh vật cố định có thể xảy ra các phản ứng phụ không đặc hiệu, tế bào vi sinh vật cố định gây cản trở khuếch tán bổ sung đối với quá trình vận chuyển cơ chất và sự cản trở này rất khó đánh giá về mặt định lượng, enzyme đặc hiệu của tế bào vi sinh vật cố định có thể giảm hoạt độ riêng.[5] 2.3.3. Các yêu cầu đòi tế bào vi sinh vật cố định: Sự mất hoạt tính enzyme trong quá trình cố định tế bào phải ở mức độ thấp, các tế bào phải có khả năng chiếm thể tích riêng của thiết bị phản ứng nhiều nhất nhằm làm tăng năng suất thể tích. Cơ chất và sản phẩm tạo ra phải có khả năng khắc phục được hàng rào cản trở khuếch tán, chất xúc tác (tế bào gắn vào chất mang ) phải dễ dàng khuấy trộn được và bền về mặt cơ học. Chất xúc tác phải ổn định trong khoảng nhiệt độ họat động của quy trình công nghệ cũng như phải bền đối với hóa chất và pH sử dụng trong quy trình công nghệ, phải thực hiện được việc tái sinh chất xúc tác dựa vào họat động của quá trình trao đổi chất đặc thù với từng cơ thể vi sinh vật. [5] 2.3.4. Giới thiệu về chất mang Cellulose vi khuẩn ( Bacterial Cellulose – BC ) Cellulose là một lọai polymer sinh học phong phú nhất trên trái đất, không những được xem như thành phần chính của sinh khối thực vật, mà còn là đại diện polymer ngọai bào của vi sinh vật. BC phụ thuộc vào những sản phẩm đặc trưng của quá trình trao đổi chất nguyên thủy và chủ yếu là màng bảo vệ, trong khi cellulose thực vật đóng vai trò cấu trúc tế bào. Cellulose được tổng hợp bởi vi khuẩn thuộc giống Acetobacter, Rhizobium, Agrobacterium, và Sarcina (Jonas và Farah, 1998). Các sinh vật tổng hợp Cellulose hiệu quả nhất là vi khuẩn sinh acid acetic, Gram (-) Acetobacter xylinum (phân loại như Gluconacetobacter xylinus, Yamada và cộng sự, 1997; Yamada,2000), loại vi khuẩn được sử dụng làm vi sinh vật mẫu dùng trong những nghiên cứu ứng dụng và nghiên cứu cơ bản trên cellulose. Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của BC là độ tinh sạch hóa học. Đây là đặc điểm phân biệt cellulose vi khuẩn với cellulose thực vật, loại cellulose thường liên kết với hemicellulose và lignin. Do những đặc tính duy nhất được tạo ra từ cấu trúc hạt cực mịn, BC có nhiều ứng dụng trong ngành giấy, dệt sợi và công nghệ thực phẩm; được xem như vật liệu sinh học trong nghành mỹ phẩm và y khoa (Ring và cộng sự, 1986). Ứng dụng rộng hơn của loại polysaccharide này phụ thuộc vào quy mô sản xuất và chi phí của nó.Vì vậy,các nghiên cứu cơ bản được tiến hành cùng những nghiên cứu chuyên sâu về lĩnh vực cải tiến giống và phát triển quá trình sản xuất. Hình thái đại thể của BC phụ thuộc nghiêm ngặt vào những điều kiện nuôi cấy ( Watanabe và cộng sự,1998,a; Yamanaka và cộng sự,2000). Trong các điều kiện tĩnh, vi khuẩn tích lũy các mãng (BC-S) cellulose trên bề mặt môi trường nước luộc thịch chứa dinh dưỡng ở mặt phân giới ( phân cắt phase) khí-lỏng giàu oxy. Các sợi phụ cellulose nhô ra từ các lỗ sắp theo thứ tự đường thẳng ở bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết tinh thành các vi sợi và ép sâu hơn vào môi trường tăng trưởng.Vì thế, màng mỏng giống như da, nâng đỡ quần thể tế bào A.xylinum bao gồm các dãi cellulose chồng lên nhau và xoắn vào nhau tạo thành các mặt phẳng song song và vô tổ chức (Jonas và Farah,1998). Các sợi BC-S liền kề nhau thường ích phân nhánh và nối liền nhau hơn các sợi của BC được tạo trong môi trường cấy lắc (BC-A), ở dạng những thể hạt không đều nhau, những dãi hình sao và hình sợi, phân tán đều trong nuôi cấy lỏng ( Vandamme và cộng sự, 1998) Tính chất BC là dạng polymer có độ tinh sạch cao hơn so với các dạng cellulose khác, không chứa lignin và hemicellulose. BC có thể bị phân hủy hoàn toàn. Trọng lượng nhẹ, kích thước ổn định, sức căng và độ bền sinh học cao Khả năng nổi bật của cellulose vi khuẩn là giữ nước tốt. Trong điều kiện ngập nước, nước có thể vận chuyển vào các sợi cellulose. Khả năng kết sợi tạo tinh thể tốt. Tính bền cơ học tốt, khả năng chịu nhiệt tốt. Lớp màng cellulose được tổng hợp trực tiếp, vì vậy việc sản xuất các sản phẩm mong muốn không cần qua bước trung gian. Chẳng hạn như sản xuất giấy không cần qua bước phân hủy, còn vải thì không cần bước se chỉ. Đặc biệt là vi khuẩn có thể tổng hợp được các loại màng mỏng và sợi cực nhỏ. Trong cấu trúc BC thu được trong điều kiện là nuôi cấy tĩnh có các trục đơn giúp cho cấu trúc lớp màng tạo nên chặc chẽ hơn. [5] Vi sinh vật tổng hợp BC BC được tổng hợp bởi một vài giống vi khuẩn, trong đóa chủng Acetobacter phổ biến nhất Các giống vi sinh vật tổng hợp BC được giới thiệu trong bản sau: Bảng 2.4 Các chủng vi sinh vật tạo màng cellulose [5] Chủng vi sinh vật Cấu trúc cellulose Acetobacter Màng mỏng, ngọai bào bao gồm các dải hẹp tạo thành Achromobacter Sợi nhỏ Aerobacter Sợi nhỏ Agrobacterium Sợi nhỏ, ngắn Alcaligenses Sợi nhỏ Pseudomonas Sợi nhỏ đan vào nhau Rhizobium Sợi nhỏ, ngắn Sarcina Cellulose vô định hình Zoogloea Không xác định A. xylinum ( tương tự A. aceti spp. Xylinum, A. xylinus) là chủng tổng hợp BC hiệu quả nhất. Hiện nay, chủng này được tái phân lập và được xếp thuộc giống Gluconacetobacter như G. xylinus ( Yamada và cộng sự, 1998,2000) cùng với các loài khác ( G. Hansensii, G. Europaeus, G. Oboediens và G. Intermedius). Chức năng sinh lý học Trong môi trường sống tự nhiên, phần lớn vi khuẩn tổng hợp polysaccharide ngoại bào. Các tế bào vi khuẩn tổng hợp cellulose được bẫy trong mạng lưới polymer, mà mạng này thường xuyên nâng đỡ khuẩn lạc ở mặt phân giới lỏng-khí. Vì thế, các chủng tạo thành BC có thể sống trong nước thải. Chất nền polymer tham gia trong sự dính chặt của tế bào lên trên bất kỳ bề mặt nào có thể được sử dụng và tạo điều kiện cho sự cung cấp dinh dưỡng. Nồng độ của chúng trong lưới polymer được tăng cường đáng kể do các tính chất hấp phụ so với môi trường nước xung quanh. Một số tác giả cho rằng cellulose tổng hợp bởi A. xylinum cũng đóng vai trò dự trữ và có thể được sử dụng bởi các vi sinh vật khi đói. Sự phân hủy của nó sau đó sẽ được xúc tác bởi exo và endoglucanase. Sự có mặt đồng thời của hai chất này được tìm thấy trong nuôi cấy lỏng một số chủng A. xylinum sản sinh cellulose. [5] Do độ nhớt và các đặc tính hút nước của lớp cellulose, khả năng kháng lại các thay đổi bất lợi của các tế bào sản sinh BC (sự giảm hàm lượng nước, biến đổi pH, sự xuất hiện các chất độc, các sinh vật gây bệnh...) trong môi trường sống tăng lên và các tế bào này có thể sinh trưởng sâu hơn và phát triển bên trong màng. Người ta cũng khám phá ra rằng cellulose bảo vệ các tế bào vi khuẩn khỏi sự bức xạ tia tử ngoại. 23% tế bào vi khuẩn sản sinh acid acetic được bao bởi BC sống sót một giờ khi sử lý với sự nhiễu xạ tia tử ngoại. Việc loại bỏ polysaccharide bảo vệ làm giảm mạnh khả năng sống của các tế bào vi khuẩn. 2.3.5. Các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật 2.3.5.1. Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trên chất mang Phương pháp liên kết cộng hóa trị Đây là phương pháp liên kết tế bào với các polymer đã được họat hóa.Bản chất liên kết cộng hóa trị là nối tế bào vi sinh vật với chất mang thông qua ”cầu nối” nào đó. Cầu nối này phải có kích thước không lớn lắm và có hai đầu, một đầu nối polymer còn đầu kia nối với tế bào. Phương pháp hấp phụ Đây được coi là phương pháp tiêu biểu đầu tiên về cố định tế bào vi sinh vật. Trong quá trình cố định vi sinh vật bằng cách hấp phụ có các liên kết sau được hình thành: Liên kết tĩnh điện Van Der Walls: Giữ tế bào và bề mặt chất mang tạo nên một sự chênh lệch điện thế giữa bề mặt chất mang và bề mặt tế bào. Giúp tế bào và chất mang gắn liền nhau. Lực mao quản: Chất mang có các mao quản,khi được ngâm trong các hiền phù vi sinh vật sẽ hình thành các lực mao quản kéo huyền phù vi sinh vật vào trong lòng chất mang. Liên kết ion: Bề mặt chất mang và vi sinh vật có mang các ion trái dấu, nhờ vậy tế bào vi sinh vật liên kết với chất mang 2.3.5.2. Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong chất mang Đối với tế bào vi sinh vật, trong một số trường hợp không nhất thiết phải gắn chặt tế bào vào chất mang polymer và có thể giữ nó bên trong polymer, lúc này polymer tạo thành bao xung quanh tế bào. Mạng lưới này có lỗ nhỏ tới mức không cho tế bào chui qua khỏi mạng, nhưng đồng thời đủ lớn để cơ chất và sản phẩm tạo ra có thể ra vào dễ dàng. Có một số cách bao gói tế bào như sau: Nhốt trong gel Gel là polymer tổng hợp như polyacrylamide, hydroxyletyl-2-metacrylate. Hay alginate hoặc carrageenan cũng có khả năng tạo gel rất tốt. Phương pháp nhốt trong gel là phương pháp dựa trên cơ sở tạo màng bọc hay polymer. Các chất tham gia phản ứng và sản phẩm có thể thẩm thấu ra ngoài hay vào trong thông qua màng bọc này và tế bào vẫn ở nguyên trong gel. Nguyên tắc thực hiện đơn giản: Tế bào được trộn vào trong 1 polymer, sau đó tiến hành quá trình trùng hợp với sự có mặt của tác nhân khâu mạch, khi đó tế bào sẽ được bao bọc trong khuôn gel mới. [5] Nhốt trong các sợi nhỏ của sợi tổng hợp Cho dòng chảy tuần hoàn bên trong sợi, do đó hạn chế được sự phân cực bề mặt và sự bịt lắp thường gặp với các màng. Các sợi được dùng thường là các sợi nhân tạo. Các sợi này thường có độ bền acid, kiềm, các loại ion và các dung môi hữu cơ hòa tan. Phương pháp này thường đơn giản trong thao tác hoạt động và không đòi hỏi cải biến hóa học đối với chất mang polymer sợi. Polymer tạo sợi sử dụng trong cố định tế bào thường có giá rẻ và phổ biến ở số lượng đáng kể. [5] 2.3.5.3. Cố định vi khuẩn L.delbrueckii bằng BC Với những tính chất và cấu tạo của BC, ta thấy BC là chất mang thích hợp để cố định vi khuẩn bằng phương pháp hấp phụ, kích cỡ của sợi cellulose phù hợp với việc cố định tế bào vi khuẩn L.delbrueckii lên BC. Mạng lưới này là vật chống đỡ cho quần thể vi sinh vật luôn ở bề mặt tiếp giáp giữa môi trường lỏng với không khí, làm cho các tế bào có thể bám chặt trên bề mặt môi trường và giúp tế bào thâu nhận chất dinh dưỡng dễ dàng hơn so với khi tế bào ở trong môi trường lỏng không có mạng lưới cellulose. Nhờ tính dẻo dai và tính hút nước, các lớp cellulose giúp các tế bào vi khuẩn kháng lại được những thay đổi không thuận lợi trong môi trường sống như giảm lượng nước, thay đổi pH, sự xuất hiện các chất độc và các vi sinh vật cạnh tranh. Sau khi được vắt kiệt nước, BC có khả năng hấp phụ và trương nở tốt khi đưa dịch giống vào. Mặt khác, với phương pháp hấp phụ này ta không cần sử dụng thêm những hóa chất đặc biệt, do đó ít gây ảnh hưởng hoạt tính của vi sinh vật, không gây ô nhiễm môi trường và rẻ tiền. Từ những nguyên nhân trên, ta thấy cellulose là 1 loại giá thể phù hợp để cố định vi sinh vật. 2.4. Hệ thống lên men 2.4.1. Các khái niệm chung Một quy trình sàn xuất các sản phẩm công nghệ sinh học có nhiều thiết bị tham gia. Ta có thể chia ra làm bốn nhóm thiết bị như sau: _Thiết bị trước lên men bao gồm các thiết bị chuẩn bị môi trường, tiệt trùng môi trường, nhân giống. _Thiết bị lên men (fermenter). _Thiết bị sau lên men gồm các thiết bị thu hồi sản phẩm, chế biến sảm phẩm lên men thành các dạng thương phẩm. Có thể kể tên các thiết bị như: trích ly, ly tâm, sấy, lọc, kết tinh, hấp phụ, bao gói... _Thiết bị bổ trợ cho nhóm thiết bị trên: các băng tải, thùng chứa... Thiết bị lên men (fermenter) là các thiết bị đóng vai trò chính trong một quy trình sản xuất. Tại đây,các phản ứng sinh hóa diễn ra, chuyển hóa các nguồn cơ chất thành các sản phẩm mong muốn thông qua các vi sinh vật và các enzyme của chúng. Các loại sản phẩm của quá trình lên men thường là: sinh khối của vi sinh vật, sản phẩm trao đổi chất hoặc các loại enzyme sử dụng cho các chuyển hóa sinh hóa khác. 2.4.2. Phân loại fermenter Tùy vào loại sản phẩm, loại vi sinh vật, loại cơ chất, động cơ của quá trình lên men mà cấu tạo, phương thức hoạt động của các fermenter sẽ khác nhau. _Fermenter làm việc liên tục: cơ chất được đưa vào và sản phẩm được tháo ra liên tục. _Fermenter làm việc gián đọan: đây là dạng fermenter có cơ chất được đưa vào một lần từ đầu quá trình lên men. Quá trình lên men diễn ra trong một hệ kín, không có nhập liệu cũng như tháo liệu. Sản phẩm chỉ được lấy ra khi kết thúc thời gian lên men. _Fermenter làm việc bán liên tục: đây là dạng fermenter có cơ chất được nhập liệu theo chu kì, ngoài lượng cơ chất được nhập liệu ban đầu thì sẽ có một lượng cơ chất bổ sung trong khi đang tiến hành lên men. Sản phẩm được tháo ra vào cuối giai đoạn lên men. Thời gian giữa các lần bổ sung cơ chất sẽ được tính toán để thu được hiệu quả cao nhất.[4] 2.4.3. Các kiểu nuôi cấy trong fermenter 2.4.3.1. Nuôi cấy gián đoạn Khi vi sinh vật được nuôi cấy gián đoạn, quá trình sinh trưởng và phát triển sẽ theo các pha: _Pha lag: pha này tính từ lúc bắt đầu nuôi cấy cho đến khi vi sinh vật đạt được tốc độ sinh trưởng cực đại. Trong pha lag vi sinh vật chưa phân chia mạnh, nhưng thể tích và khối lượng tế bào tăng lên rõ rệt. _Pha log: trong pha này vi sinh vật sinh trưởng và phát triển theo lũy thừa, sinh khối vi sinh vật tăng theo hàm mũ: N= N0.a(t/T) N0:mật độ vi sinh ban đầu T:thời gian thế hệ a:hệ số (1<a<= 2 ) t: thời gian nuôi cấy. _Pha ổn định: Quần thể vi sinh vật ở trạng thái cân bằng động học,số tế bào mới sinh ra bằng số tế bào chết đi, tế bào cũng giữ được sự ổn định về kích thước và khối lượng. Kết quả là sinh khối đư