Khóa luận Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình nuôi cấy In Vitro của hai giống lan Dendrobium và Cymbidium

BA = 2.5mg/l và NAA = 1mg/l có số chồi cao nhất 2.68. Cũng vào 32 năm 2003 Talukder, Nasiruddin và ctv đã nuôi cấy từ chồi trên môi trƣờng có bổ sung (BA = 0; 1mg/l; 2.5mg/l; 5.0mg/l) và (NAA = 0; 0.1mg/l; 0.5mg/l; 1.0mg/l) sau 40 ngày nuôi cấy đã thu đƣợc số chồi cao nhất 1.9 tại nồng độ BA = 2.5mg/l và NAA = 0.5mg/l. Đây chỉ là vài bƣớc khởi đầu cho quá trình nhân giống in vitro và cũng là tiền đề cho những nghiên cứu sau này trên giống lan Dendrobium. 2.5. Giới thiệu về phôi soma và protocorm 2.5.1. Giới thiệu về phôi soma 2.5.1.1. Khái niệm Phôi vô tính (hay phôi soma) là các thể nhân giống (propagule) có cực tính bắt nguồn từ các tế bào dinh dƣỡng (thƣờng là một tế bào đơn hay một nhóm tế bào), bao gồm cả phần mô phân sinh ngọn và mô phân sinh gốc, do đó có thể hình thành chồi và rễ. 2.5.1.2. Đặc điểm Phôi soma thƣờng là một tế bào đơn và dễ dàng đƣợc tách ra khỏi mẫu cấy để tiếp tục nhân giống để hình thành cây con in vitro hoàn chỉnh. 2.5.1.3. Phân loại Phôi soma bao gồm: phôi soma trực tiếp và phôi soma gián tiếp. - Phôi soma trực tiếp: Đƣợc hình thành trực tiếp từ một tế bào hoặc một nhóm tế bào mà không qua sự hình thành callus. - Phôi soma gián tiếp: Hình thành chủ yếu từ callus. 2.5.1.4. Các loại phôi - Phôi hình cầu. - Phôi hình tim. - Phôi thủy lôi. - Phôi lá mầm. Hình 2.4: Các loại phôi soma. Hình cầu Hình tim Hình thủy lôi Hình lá mầm 33 2.5.1.5. Vai trò - Phôi vô tính giúp cho công tác vi nhân giống và sản xuất với số lƣợng lớn thực vật bằng bioreactor. - Tạo hạt nhân tạo. - Là nguyên liệu cho việc chuyển gen ở thực vật. - Công nghệ nuôi cấy tế bào trần. Hình 2.5: Phôi soma của 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium. 2.5.2. Giới thiệu về protocorm 2.5.2.1. Khái niệm Protocorm là những cấu trúc tế bào nhỏ, và đƣợc phát triển từ phôi hoặc từ nuôi cấy đỉnh chồi sau vài tuần. 2.5.2.2. Đặc điểm Protocorm thƣờng ở dạng hình cầu đƣờng kính 1-2 mm, có màu xanh và dễ dàng đƣợc tách ra để nhân giống in vitro. PHÔI CYMBIDIUM PHÔI DENDROBIUM 34 2.5.2.3. Vai trò Protocorm chủ yếu đƣợc dùng để nhân giống in vitro để hình thành phôi soma, protocorm và có thể còn đƣợc nhân giống để tạo thành cây con. Hình 2.6: Protocorm của 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium. 35 PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu nghiên cứu - Mẫu cấy: Protocorm của 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium - Môi trƣờng ½ MS: Tất cả các thí nghiệm đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng ½ MS là môi trƣờng MS nhƣng nồng độ của các chất khoáng đa lƣợng giảm đi một nửa (½) và có bổ sung các chất kích thích sinh trƣởng: NAA; BA; TDZ. Thành phần của môi trƣờng MS (Murashige & Skoog , 1962). Thành phần Dạng sử dụng Nồng độ 1. Khoáng đa lƣợng NH4NO3 1650 mg/l KNO3 1900 mg/l KH2PO4 170 mg/l MgSO4. 7H2O 370 mg/l CaCl2. 2H2O 440 mg/l 2. Khoáng vi lƣợng H3BO3 6.20 mg/l MnSO4. 4H2O 22.3 mg/l CoCl2. 6H2O 0.025 mg/l CuSO4. 5H2O 0.025 mg/l ZnSO4. 4H2O 8.60 mg/l Na2MoO4. 2H2O 0.25 mg/l KI 0.83 mg/l 3. Sắt – EDTA FeSO4. 7H2O 27.8 mg/l Na2EDTA. 2H2O 37.8 mg/l 4. Vitamin Myo-Inositol 100 mg/l Thiamin. HCl 0.10 mg/l Pyridoxin. HCl 0.50 mg/l Nicotinic acid 0.50 mg/l Glycin 2.00 mg/l 36 5. Các chất khác Đƣờng 30.0 mg/l Agar 7.00 mg/l 6. pH môi trƣờng 5.6 – 5.8 * Thời gian và địa điểm nghiên cứu - Thời gian: từ 15/3/2005 – 15/6/2005. - Địa điểm: tại phòng nuôi cấy mô - Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học - Trƣờng Đại Học Nông Lâm.TPHCM. 3.2. Phƣơng pháp 3.2.1. Bố trí thí nghiệm - Đề tài đuợc thực hiện trên 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium, trên mỗi giống lan thực hiện 2 thí nghiệm, các thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần gặp lại. Mỗi nghiệm thức cấy 3 bình, mỗi bình 3 mẫu cấy. 3.2.1.1. Nội dung 1: Trên giống lan Cymbidium. a) Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của BA và NAA đến quá trình nuôi cấy in vitro của giống lan Cymbidium. - Thí nghiệm gồm 11 nghiệm thức. Nghiệm thức MS BA (mg/l) NAA (mg/l) 1 ½ 0 0 2 ½ 1 0 3 ½ 3 0 4 ½ 5 0 5 ½ 7 0 6 ½ 10 0 7 ½ 1 0.5 8 ½ 3 0.5 9 ½ 5 0.5 10 ½ 7 0.5 11 ½ 10 0.5 - Tổng số bình: 99. - Số mẫu cấy: 297. 37 b) Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của TDZ và NAA đến quá trình nuôi cấy in vitro của giống lan Cymbidium. - Thí nghiệm gồm 9 nghiệm thức. Nghiệm thức MS TDZ (mg/l) NAA (mg/l) 1 ½ 0 0 2 ½ 0.05 0 3 ½ 0.1 0 4 ½ 0.5 0 5 ½ 1 0 6 ½ 0.05 0.5 7 ½ 0.1 0.5 8 ½ 0.5 0.5 9 ½ 1 0.5 - Tổng số bình: 81. - Số mẫu cấy: 243. 38 3.2.1.2. Nội dung 2: Trên giống lan Dendrobium. a) Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của BA và NAA lên quá trình nuôi cấy in vitro của cây lan Dendrobium. - Thí nghiệm gồm 11 nghiệm thức. Nghiệm thức MS BA (mg/l) NAA (mg/l) 1 ½ 0 0 2 ½ 1 0 3 ½ 3 0 4 ½ 5 0 5 ½ 7 0 6 ½ 10 0 7 ½ 1 0.5 8 ½ 3 0.5 9 ½ 5 0.5 10 ½ 7 0.5 11 ½ 10 0.5 - Tổng số bình: 99. - Số mẫu cấy: 297. 39 b) Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của TDZ và NAA đến quá trình nuôi cấy in vitro của giống lan Dendrobium. - Thí nghiệm gồm 9 nghiệm thức. Nghiệm thức MS TDZ (mg/l) NAA (mg/l) 1 ½ 0 0 2 ½ 0.05 0 3 ½ 0.1 0 4 ½ 0.5 0 5 ½ 1 0 6 ½ 0.05 0.5 7 ½ 0.1 0.5 8 ½ 0.5 0.5 9 ½ 1 0.5 - Tổng số bình: 81. - Số mẫu cấy: 243. 3.3.2. Các chỉ tiêu theo dõi. 3.3.2.1. Sau 60 ngày nuôi cấy. Quan sát số lƣợng phôi soma, protocorm, chồi và chiều cao chồi của tất cả các mẫu cấy trên 2 giống lan Cymbidium và Dendrobium: a) Số phôi soma / mẫu cấy = phôi soma / mẫu cấy. b) Số protocorm / mẫu cấy = protocorm / mẫu cấy. c) Số chồi / mẫu cấy = số chồi / mẫu cấy . d) Chiều cao chồi = chiều cao các chồi / số chồi. 40 3.3.2.2. Sau 90 ngày nuôi cấy. Tiến hành đếm số chồi, số lá , số rễ và đo chiều cao của chồi trên tất cả các mẫu cấy. a) Số chồi / mẫu cấy = số chồi / mẫu cấy. b) Số lá / chồi = số lá các chồi / số chồi. c) Số rễ / chồi = số rễ các chồi / số chồi. d) Chiều cao chồi = chiều cao các chồi / số chồi. 3.2.4. Phân tích thống kê. Số liệu thu thập đƣợc xử lý trên máy vi tính bằng chƣơng trình Microsoft Excel và chƣơng trình thống kê Statgraphics 7.0 (dựa vào giá trị prob trong bảng ANOVA) để có (hoặc không) phân hạng, nếu có thì sử dụng trắc nghiệm phân hạng LSD để đánh giá kết quả thí nghiệm. 41 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Giống lan Cymbidium 4.1.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của BA và NAA lên quá trình nuôi cấy in vitro của giống lan Cymbidium. Trong quá trình nuôi cấy in vitro ngƣời ta thƣờng sử dụng BA, hoặc kết hợp giữa nồng độ BA cao và nồng độ thấp NAA để tăng hiệu quả nhân giống in vitro (khả năng phát sinh phôi soma, protocorm và chồi). Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của BA và NAA đến khả năng phát sinh phôi soma, tạo protocorm và hình thành chồi của cây Cymbidium in vitro sau 60 ngày nuôi cấy Nghiệm thức Số phôi soma Số protocorm Số chồi Chiều cao / mẫu cấy / mẫu cấy / mẫu cấy chồi (cm) ½ MS 0 A 2.22 A 1.56 A 2.17 D ½ MS+1mg/l BA 0 A 3.00 AB 1.78 ABC 1.90 CD ½ MS+3mg/l BA 0 A 3.67 BC 2.33 C 1.85 CD ½ MS+5mg/l BA 3.44 C 4.33 CD 2.22 BC 1.50 BC ½ MS+7mg/l BA 3.89 C 5.11 D 1.44 A 0.97 A ½ MS+10mg/l BA 4.89 D 6.22 E 1.33 A 0.83 A ½ MS+1mg/l BA+0.5mg/l NAA 1.67 B 3.56 BC 1.56 A 1.06 AB ½ MS+3mg/l BA+0.5mg/l NAA 3.56 C 4.44 CD 1.78 ABC 0.99 A ½ MS+5mg/l BA+0.5 mg/l NAA 3.78 C 4.67 D 1.67 AB 0.83 A ½ MS+7mg/l BA+0.5mg/l NAA 4.22 CD 6.11 E 1.78 ABC 0.78 A ½ MS+10mg/l BA+0.5mg/l NAA 5.11 D 6.78 E 1.89 ABC 0.77 A CV% 1.81% 1.1% 1.92% 1.97% *Các giá trị theo sau bởi chữ cái trong cùng một cột không cùng ký tự biểu hiện sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05. 42 Nhận xét: Qua thống kê trắc nghiệm phân hạng các nghiệm thức của thí nghiệm trên cho thấy sau 60 ngày nuôi cấy in vitro, có những biểu hiện nhƣ sau: *Số lƣợng phôi soma: Dựa vào bảng 4.1 cho thấy có sự ảnh hƣởng giữa các yếu tố môi trƣờng nuôi cấy lên quá trình phát sinh phôi soma. Những môi trƣờng ½ MS; ½ MS + 1mg/l BA; ½ MS + 3mg/l BA không thấy sự phát sinh phôi soma, do ở những môi trƣờng nuôi cấy này nồng độ BA thấp chƣa kích thích sự phân chia tế bào mạnh để phát sinh phôi. Còn ở những môi trƣờng nuôi cấy có nồng độ BA cao (BA= 5mg/l; 7mg/l; 10mg/l) có sự phát sinh phôi soma. Ngoài ra, khi kết hợp giữa BA và NAA vào môi trƣờng nuôi cấy thì khả năng phát sinh phôi soma cao hơn khi sử dụng BA. Môi trƣờng ½ MS + 7mg/l BA số phôi phát sinh là 3.89, còn ở môi trƣờng ½ MS + 7mg/l BA + 0.5mg/l NAA thì khả năng phát sinh phôi là 4.22, môi trƣờng có BA = 10mg/l là 4.89 còn ở môi trƣờng kết hợp giữa BA= 10mg/l + NAA= 0.5mg/l là 5.11. Qua đó chứng tỏ NAA có vai trò trong quá trình phát sinh phôi soma. Nhƣ vậy BA và NAA có ảnh hƣởng lớn đến quá trình phát sinh phôi soma trong nhân giống in vitro. *Số lƣợng protocorm: Trong nhân giống in vitro ngoài việc phát sinh phôi soma còn có sự tạo protocorm. Quan sát số lƣợng protocorm ở bảng 4.1 cho thấy giữa các môi trƣờng nuôi cấy có sự khác biệt nhau. Sau 60 ngày nuôi cấy, số protocorm hình thành phụ thuộc vào môi trƣờng nuôi cấy, ở môi trƣờng ½ MS số protocorm (2.22) và số protocorm tăng lên ở những môi trƣờng có bổ sung nồng độ BA cao (BA = 5mg/l; 7mg/l; 10mg/l). Ngoài ra khi kết hợp giữa BA và NAA thì số protocorm tăng cao hơn khi sử dụng BA. Dựa vào bảng trắc nghiệm phân hạng 4.1 cho thấy ở những môi trƣờng ½ MS + 10mg/l BA; ½ MS + 7mg/l BA + 0.5mg/l NAA và ½ MS + 10mg/l BA + 0.5mg/l có số protocorm hình thành cao nhất và khác biệt so với các môi trƣờng khác. *Số lƣợng chồi: Sau 60 ngày nuôi cấy, bên cạnh sự phát sinh phôi soma và tạo protocorm còn có sự hình thành chồi. Tuy nhiên khả năng hình thành chồi không cao và không thấy 43 có sự khác biệt lớn giữa các nghiệm thức lên sự hình thành chồi khi bổ sung nồng độ BA và NAA càng tăng. Nhƣ vậy ở giai đoạn sau 60 ngày nuôi cấy in vitro thì BA và NAA không ảnh hƣởng lớn đến quá trình hình thành chồi. *Chiều cao chồi: Dựa vào bảng trắc nghiệm phân hạng 4.1 cho thấy giữa các môi trƣờng nuôi cấy không có ảnh hƣởng đến sự phát triển chiều cao chồi. Ở môi trƣờng đối chứng (½ MS) và môi trƣờng có bổ sung BA thấp (BA = 1mg/l, BA = 3mg/l) có chiều cao chồi cao nhất và khác biệt với các nghiệm thức còn lại. Chiều cao chồi thấp ở những nồng độ có bổ sung BA cao (BA= 5mg/l; 7mg/l; 10mg/l) là do ở các môi trƣờng này chủ yếu là tạo protocorm và phát sinh phôi soma nên ức chế sự phát triển của chồi. Hình 4.1: Chồi lan Cymbidium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trƣờng có bổ sung BA. Hình 4.2: Chồi lan Cymbidium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trƣờng có bổ sung BA và NAA. 44 Trong nhân giống in vitro, sau 60 ngày nuôi cấy khả năng phát sinh phôi soma, tạo protocorm đƣợc biểu hiện rõ, nhƣng sau 90 ngày nuôi cấy các phôi soma và protocorm đều phát triển thành chồi, tuy còn một số protocorm và phôi soma chƣa hình thành chồi (ở số lƣợng ít). Đo đó sau 90 ngày nuôi cấy, quan sát sự sinh trƣởng và phát triển của chồi. Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của BA và NAA đến sự sinh trƣởng và phát triển của chồi lan Cymbidium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro Nghiệm thức Số chồi Số lá Số rễ Chiều cao / mẫu cấy / chồi / chồi chồi (cm) ½ MS 2.11 A 2.11 AB 1.99 2.97 E ½ MS + 1mg/l BA 3.00 AB 2.50 BC 0 2.33 BCD ½ MS + 3mg/l BA 3.22 AB 2.08 A 0 1.98 ABC ½ MS + 5mg/l BA 4.56 CD 2.14 AB 0 1.82 AB ½ MS + 7mg/l BA 5.33 DEF 2.04 A 0 1.83 ABC ½ MS + 10mg/l BA 6.11 EF 2.11 AB 0 1.83 ABC ½ MS+1mg/l BA+0.5mg/l NAA 2.78 AB 2.62 C 0 2.85 DE ½ MS+3mg/l BA+0.5mg/l NAA 3.83 BC 2.60 C 0 2.36 CD ½ MS+5mg/l BA+0.5mg/l NAA 5.00 CDE 2.03 A 0 2.17 BC ½ MS+7mg/l BA+0.5mg/l NAA 5.78 DEF 2.04 A 0 2.03 ABC ½ MS+10mg/l BA+0.5mg/l NAA 6.44 F 2.00 C 0 1.63 A CV% 1.62% 1% 2.34% 1.32% *Các giá trị theo sau bởi chữ cái trong cùng một cột không cùng ký tự biểu hiện sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05. Nhận xét: *Số lƣợng chồi: Dựa vào bảng trắc nghiệm phân hạng 4.2 cho thấy có sự ảnh hƣởng của các môi trƣờng nuôi cấy lên sự hình thành chồi lan in vitro. Ở các nghiệm thức 6 (½ MS + 10mg/l BA) và 11 (½ MS +10mg/l +0.5mg/l NAA) cho thấy số chồi hình thành cao nhất và có sự khác biệt với các nghiệm thức còn lại. Ngoài ra ở những môi trƣờng có bổ sung kết hợp BA và NAA luôn cho thấy số chồi hình thành cao hơn so với môi trƣờng chỉ có BA. Nhƣ vậy BA và NAA có ảnh hƣởng lớn đến sự hình thành chồi trong nhân giống in vitro. 45 *Số lƣợng lá, rễ và chiều cao chồi: - Số lá: Số lá hình thành không có sự khác biệt giữa các nghiệm thức, số lá không tăng khi nồng độ BA và NAA tăng. - Số rễ: Bảng trắc nghiệm phân hạng cho thấy chỉ ở môi trƣờng đối chứng (½ MS) là có sự hình thành rễ. Chứng tỏ tại các nồng độ BA và NAA của thí nghiệm không ảnh hƣởng đến sự hình thành rễ. - Chiều cao chồi: Bảng 4.2 cho thấy các môi trƣờng ½ MS và ½ MS + 1mg/l BA + 0.5mg/l NAA có chiều cao chồi cao nhất và khác biệt với các nghiệm thức còn lại. Hình 4.3: Chồi lan Cymbidium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trƣờng có bổ sung BA Hình 4.4: Chồi lan Cymbidium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trƣờng có bổ sung BA và NAA. 46 4.1.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của TDZ và NAA lên quá trình nuôi cấy in vitro của giống lan Cymbidium TDZ là chất điều hòa sinh trƣởng thuộc nhóm cytokinin có khả năng kích thích sự tạo chồi rất mạnh, do đó trong nuôi cấy in vitro ngoài BA ngƣời ta thƣờng sử dụng TDZ hoặc TDZ kết hợp NAA để tăng khả năng nhân giống in vitro (phát sinh phôi soma, tạo protocorm và hình thành chồi). Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của TDZ và NAA đến khả năng phát sinh phôi soma, tạo protocorm và hình thành chồi lan Cymbidium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro. Nghiệm thức Số phôi soma Số protocorm Số chồi Chiều cao / mẫu cấy / mẫu cấy / mẫu cấy chồi (cm) ½ MS 0 A 1.67 A 1.67 AB 2.33 D ½ MS+0.05mg/l TDZ 0 A 3.56 BC 2.78 C 2.44 D ½ MS+0.1mg/l TDZ 0 A 4.22 BC 2.56 BC 1.64 C ½ MS+0.5mg/l TDZ 4.22 C 6.11 DE 2.56 BC 1.44 BC ½ MS+1 mg/l TDZ 5.56 D 6.78 E 1.67 AB 0.69 A ½ MS+0.05mg/l TDZ+0.5mg/l NAA 2.22 B 3.44 B 2.89 C 1.39 BC ½ MS+0.1mg/l TDZ+0.5 mg/l NAA 3.78 C 4.89 CD 1.56 AB 1.25 ABC ½ MS+0.5mg/l TDZ+0.5 mg/l NAA 4.22 C 6.22 DE 1.33 A 1.08 ABC ½ MS+1mg/l TDZ+0.5 mg/l NAA 6.00 D 7.11 E 1.22 A 0.79 AB CV% 2% 1.78% 3.45% 2.95% *Các giá trị theo sau bởi chữ cái trong cùng một cột không cùng ký tự biểu hiện sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05. Nhận xét: Qua thống kê trắc nghiệm phân hạng các nghiệm thức của thí nghiệm trên cho thấy sau 60 ngày nuôi cấy in vitro, có những biểu hiện nhƣ sau: *Số lƣợng phôi soma: Dựa vào bảng 4.3 cho thấy có sự khác biệt nhau giữa các yếu tố môi trƣờng đến sự phát sinh phôi soma. 47 TDZ là chất điều hoà sinh truởng thuộc nhóm cytokinin có hoạt tính mạnh nhằm mục đích cảm ứng tạo phôi vô tính, tuy nhiên ở những môi trƣờng có bổ sung nồng độ TDZ thấp (TDZ = 0.05mg/l; 0.1mg/l) thì cũng không thấy biểu hiện của sự phát sinh phôi soma, còn ở môi trƣờng có nồng độ TDZ cao (TDZ = 0.5mg/l; 1mg/l) khả năng phát sinh phôi soma đƣợc biểu hiện rất rõ. Cũng nhƣ BA khi ta bổ sung kết hợp giữa TDZ và NAA vào môi trƣờng nuôi cấy thì chỉ với nồng độ thấp (TDZ = 0.05mg/l; 0.1mg/l và NAA = 0.5mg/l) thì đã bắt đầu phát sinh phôi soma. Chứng tỏ NAA có vai trò trong quá trình phát sinh phôi khi đƣợc xử lý kết hợp với TDZ. Nhƣ vậy TDZ và NAA có ảnh hƣởng đến khả năng phát sinh phôi soma ở giai đoạn sau 60 ngày nuôi cấy. *Số lƣợng protocorm: Dựa vào bảng 4.3 cho thấy có sự khác biệt nhau giữa các yếu tố môi trƣờng nuôi cấy đến quá trình tạo protocorm ở giai đoạn sau 60 ngày nuôi cấy. Ở môi trƣờng ½ MS số protocorm tạo ra là 1.67 và số protocorm tăng dần ở những môi trƣờng có bổ sung nồng độ TDZ cao, bảng 4.3 còn cho thấy khả năng tạo protocorm cao khi ta bổ sung kết hợp giữa TDZ và NAA vào môi trƣờng nuôi cấy nhƣ sau: - Ở môi trƣờng ½ MS + 0.5mg/l TDZ số protocorm: 6.11. - Ở môi trƣờng ½ MS + 0.5mg/l TDZ + 0.5mg/l NAA số protocorm: 6.22. - Ở môi trƣờng ½ MS + 1mg/l TDZ số protocorm: 6.78. - Ở môi trƣờng ½ MS + 1mg/l TDZ + 0.5mg/l NAA số protocorm: 7.11. Nhƣ vậy có sự ảnh hƣởng TDZ và NAA đến quá trình tạo protocorm ở giai đoạn 60 ngày nuôi cấy. *Số lƣợng chồi: Dựa vào bảng 4.3 cho thấy không có sự khác biệt lớn giữa các yếu tố môi trƣờng nuôi cấy lên quá trình hình thành chồi. Ở giai đoạn 60 ngày nuôi cấy khả năng phát sinh phôi soma và tạo protocorm là chủ yếu do đó số chồi hình thành không cao, ở những môi trƣờng ½ MS; ½ MS + 0.05mg/l TDZ; ½ MS + 0.1mg/l TDZ không có sự hình thành phôi soma và tạo protocorm do đó số lƣợng chồi cao ở các nghiệm thức này và giảm dần ở các nghiệm thức có nồng độ TDZ cao. Khi ta xử lý kết hợp TDZ và NAA thì số chồi hình thành cũng không cao. 48 Nhƣ vậy ở giai đoạn sau 60 ngày nuôi cấy TDZ và NAA không khích thích quá trình hình thành chồi cao. *Chiều cao chồi: Quan sát bảng 4.3 cho thấy có sự khác biệt giữa các yếu tố môi trƣờng nuôi cấy lên sự phát triển chiều cao chồi. Chiều cao chồi giảm dần ở những môi trƣờng có bổ sung TDZ càng cao, do ở những môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung TDZ cao chủ yếu phát sinh phôi soma và tạo chồi, do đó chồi có chiều cao thấp. Nhƣ vậy chiều cao chồi tỷ lệ nghịch với sự phát sinh phôi soma và tạo protocorm trên môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung TDZ và NAA. Hình 4.5: Chồi lan Cymbidium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trƣờng có bổ sung TDZ. Hình 4.6: Chồi lan Cymbidium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trƣờng có bổ sung TDZ và NAA. ĐC 49 Sau 90 ngày nuôi cấy in vitro đa số phôi soma, protocorm đều hình thành chồi lan, do đó ở giai đoạn này ta chỉ theo dõi sự sinh trƣởng và phát triển của chồi lan. Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của TDZ và NAA đến sự sinh trƣởng và phát triển chồi lan Cymbidium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro. Nghiệm thức Số chồi Số lá Số rễ Chiều cao / mẫu cấy / chồi / chồi chồi(cm) ½ MS 2.22 A 2.00 A 1.67 3.56 D ½ MS + 0.05mg/l TDZ 3.22 AB 2.33 C 0 3.04 C ½ MS + 0.1mg/l TDZ 4.11 BCD 2.24 BC 0 2.35 B ½ MS + 0.5mg/l TDZ 5.22 DE 2.08 AB 0 2.18 AB ½ MS + 1mg/l TDZ 6.44 FG 2.00 A 0 1.93 AB ½ MS+0.05mg/lTDZ+0.5mg/lNAA 3.89 BC 2.37 C 0 3.12 C ½ MS+0.1mg/lTDZ+0.5mg/lNAA 4.67 CDE 2.63 D 0 2.32 B ½ MS+0.5mg/lTDZ+0.5mg/lNAA 5.56 EF 2.17 ABC 0 1.88 A ½ MS+1mg/lTDZ+0.5mg/lNAA 7.22 G 2.10 AB 0 1.77 A CV% 1.66% 0.63% 11.54% 1.12% *Các giá trị theo sau bởi chữ cái trong cùng một cột không cùng ký tự biểu hiện sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05. Nhận xét: *Số lƣợng chồi: Dựa vào bảng 4.4 cho thấy có sự ảnh hƣởng khác nhau giữa các yếu tố môi trƣờng lên khả năng hình thành chồi ở giai đoạn sau 90 ngày nuôi cấy. Số chồi hình thành ở giai đoạn này rất cao, khả năng hình thành chồi càng cao ở những môi trƣờng có bổ sung nồng độ TDZ cao hoặc TDZ kết hợp NAA nhƣ sau: - Ở môi trƣờng ½ MS + 0.5mg/l TDZ số chồi hình thành: 5.22 - Ở môi trƣờng ½ MS + 0.5mg/l TDZ + 0.5mg/l NAA số chồi hình thành: 5.56 - Ở môi trƣờng ½ MS + 1mg/l TDZ số chồi hình thành: 6.44 - Ở môi trƣờng ½ MS + 1mg/l TDZ + 0.5mg/l NAA số chồi hình thành: 7.22 Nhƣ vậy có sự ảnh hƣởng TDZ và NAA lên khả năng hình thành chồi ở giai đoạn sau 90 ngày nuôi cấy. 50 *Số lá, rễ và chiều cao chồi: - Số lá: Khi ta bổ sung TDZ hoặc TDZ kết hợp NAA ở nồng độ càng cao vào môi trƣờng nuôi cấy thì bảng 4.4 cho thấy số lá cũng không tăng. - Số rễ: Khi ta bổ sung TDZ vào môi trƣờng nuôi cấy thì cũng chỉ có ở môi trƣờng ½ MS là có sự hình thành rễ. - Chiều cao chồi: Bảng 4.4 cho thấy chiều cao chồi giảm trong khi đó số chồi lại tăng cao. Hình 4.7: Chồi lan Cymbidium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trƣờng có bổ sung TDZ. Hình 4.8: Chồi lan Cymbidium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trƣờng có bổ sung TDZ và NAA. 51 4.2. Lan Dendrobium Để kiểm tra ảnh hƣởng của các chất điều hòa sinh trƣởng đến quá trình nuôi cấy in vitro, cho nên ngoài việc thực hiện trên giống lan Cymbidium ta còn thực hiện trên giống lan Dendrobium. 4.2.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của BA và NAA lên quá trình nuôi cấy in vitro của cây lan Dendrobium Sau 60 ngày nuôi cấy in vitro, kết quả thí nghiệm cho thấy các nghiệm thức đều cho kết quả tốt. Các mẫu cấy đều tạo protocorm và hình thành chồi, riêng phôi soma thì ở những môi trƣờng có bổ sung nồng độ BA cao hoặc BA kết hợp NAA mới có sự phát sinh phôi soma. Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của BA và NAA đến khả năng hình thành phôi soma, protocorm và chồi lan Dendrobium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro Nghiệm thức Số phôi soma Số protocorm Số chồi Chiều cao / mẫu cấy / mẫu cấy / mẫu cấy chồi (cm) ½ MS 0 A 1.44 A 3.33 CD 1.11 D ½ MS+1mg/l BA 0 A 2.56 AB 5.11 E 0.94 CD ½ MS+3 mg/l BA 0 A 3.11 B 6.11 E 0.83 BCD ½ MS+5 mg/l BA 7.22 C 5.78 DE 1.89 AB 0.76 ABC ½ MS+7 mg/l BA 7.67 CD 6.22 EF 2.11 AB 0.69 ABC ½ MS+10mg/l BA 8.67 DE 7.11 FG 3.33 CD 0.49 A ½ MS+1mg/l BA+0.5 mg/l NAA 0 A 3.33 BC 6.11 E 0.99 CD ½ MS+3mg/l BA+0.5 mg/l NAA 5.33 B 4.56 CD 1.67 A 0.77 ABC ½ MS+5 mg/l BA+0.5 mg/l NAA 7.33 C 6.22 EF 2.33 ABC 0.70 ABC ½ MS+7 mg/l BA+0.5 mg/l NAA 7.78 CD 7.22 FG 2.89 BCD 0.78 ABC ½ MS+10 mg/l BA+0.5 mg/l NAA 9.11 F 8.22 G 3.44 D 0.63 AB CV% 1.32% 1.38% 1.7% 2.15% *Các giá trị theo sau bởi chữ cái trong cùng một cột không cùng ký tự biểu hiện sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05. 52 Nhận xét: Qua thống kê trắc nghiệm phân hạng các nghiệm thức của thí nghiệm trên cho thấy sau 60 ngày nuôi cấy in vitro, có những biểu hiện nhƣ sau: *Số lƣợng phôi soma: Dựa vào bảng 4.5 cho thấy có ảnh hƣởng khác nhau giữa các yếu tố môi trƣờng nuôi cấy lên sự phát sinh phôi soma của giống lan Dendrobium ở giai đoạn sau 60 ngày nuôi cấy. Ở môi trƣờng ½ MS, ½ MS + 1mg/l BA, ½ MS + 3mg/l BA và ½ MS + 1mg/l BA + 0.5mg/l NAA cho thấy không có sự phát sinh phôi soma, chứng tỏ lan Dendrobium đòi hỏi nồng độ BA cao mới có khả năng phát sinh phôi soma. Quan sát ở những môi trƣờng có bổ sung nồng độ BA cao (BA = 5mg/l; 7mg/l; 10mg/l ) thì khả năng phát sinh phôi soma rất cao, chứng tỏ khả năng phát sinh phôi của lan Dendrobium rất nhậy cảm với môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung nồng độ BA cao và khả năng phát sinh phôi soma càng cao khi ta bổ sung kết hợp giữa BA và NAA vào môi trƣờng nuôi cấy, cho thấy kết quả nhƣ sau: - Ở môi trƣờng ½ MS + 7mg/l BA số phôi: 7.67 - Ở môi trƣờng ½ MS + 7mg/l + 0.5mg/l NAA số phôi: 7.78 - Ở môi trƣờng ½ MS + 10mg/l BA số phôi: 8.67 - Ở môi trƣờng ½ MS + 10mg/l BA + 0.5mg/l NAA số phôi: 9.11 Nhƣ vậy BA và NAA thích hợp cho sự phát sinh phôi soma trong nuôi cấy in vitro. *Số lƣợng protocorm: Dựa vào bảng 4.5 cho thấy có sự khác biệt giữa các yếu tố môi trƣờng lên khả năng tạo protocorm ở giai đoạn 60 ngày nuôi cấy. Ở môi trƣờng đối chứng (1/2 MS) số protocrm hình thành là 1.44, khả năng hình thành protocorm tăng ở những môi trƣờng có bổ sung BA cao, do BA có vai trò kích thích sự phân chia tế bào nên nồng độ BA cao thì khả năng phân chia tế bào càng cao. Vì vậy số protocorm tạo thành nhiều. Nhƣng vai trò của BA đƣợc kích thích mạnh khi ta kết hợp bổ sung BA với NAA, do đó môi trƣờng có bổ sung BA và NAA thƣờng cho thấy khả năng tạo protocorm cao. 53 Qua đó cho thấy BA và NAA có vai trò đến khả năng tạo protocorm ở giai đoạn sau 60 ngày nuôi cấy. *Số lƣợng chồi: Dựa vào bảng 4.5 cho thấy có sự khác biệt giữa các môi trƣờng nuôi cấy lên khả năng hình thành chồi. Ở giai đoạn này khả năng hình thành chồi của Dendrobium cũng không cao, do mẫu cấy chủ yếu là phát sinh phôi soma và tạo protocorm. Số chồi hình thành cao ở những môi trƣờng nuôi cấy không có sự phát sinh phôi soma và tạo nhiều protocorm nhƣ: ½ MS + 1mg/l BA số chồi là 5.11, ½ MS + 3mg/l BA số chồi là 6.11 và ở môi trƣờng ½ MS + 1mg/l BA + 0.5mg/l NAA số chồi 6.11. Còn ở các môi trƣờng khác của thí nghiệm thì số chồi giảm. Nhƣ vậy ở giai đoạn 60 ngày nuôi cấy BA và NAA không có ảnh hƣởng lớn đến khả năng hình thành chồi. *Chiều cao chồi: Chiều cao chồi luôn giảm dần ở những môi trƣờng có bổ sung BA hoặc BA kết hợp NAA cao, do BA chỉ kích thích sự phân chia chia tế bào chứ không kích thích sự tăng trƣởng. Hình 4.9: Chồi lan Dendrobium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trƣờng có bổ sung BA. 54 Hình 4.10: Chồi lan Dendrobium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trƣờng có bổ sung BA và NAA. Sau 90 ngày nuôi cấy số lƣợng chồi gia tăng rất rõ, số lƣợng protocorm và phôi soma đều phát triển thành chồi do đó ở giai đoạn này ta chỉ quan sát sự sinh trƣởng và phát triển của chồi. Bảng 4.6: Ảnh hƣởng của BA và NAA đến sự sinh trƣởng và phát triển chồi lan Dendrobium in vitro sau 90 ngày nuôi cấy Nghiệm thức Số chồi Số lá Số rễ Chiều cao