Khóa luận Đánh giá tình trạng nhiễm Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus, Tomato Spotted Wilt Virus trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) và cây đậu phộng (Arachis hypogaea L.) tại tỉnh Tây Ninh bằng kỹ thuật Elisa và chẩn đoán Tobacco Mosaic Vi

của TSWV TSWV có phổ ký chủ rất rộng, trên 600 loài và 70 họ thực vật, trải dài trên khắp các lục địa. Nó bao gồm những cây cảnh như Aster, Vinca, Impatiens, Ranunculus, Zinna và các cây trồng như Capsicum annuum, Lycopersicon esculentum, Lactuca sativa và Solanum tuberosum, và Arachis hypogaea. Trong số đó, cỏ dại là nguồn chứa TSWV chính (Y.Antignus và cộng sự, 1997). 2.4.5 Con đƣờng truyền bệnh TSWV được truyền từ cây này sang cây khác thông qua nhiều loài bọ trĩ khác nhau. Có ít nhất 4 loài bọ trĩ: Thrips tabaci Lind, Western Flower Thrips (bọ trĩ hoa) (Frankliniella occidentalis), Frankliniella schultzei (Trybom), Frankliniella fusca (Hind). Trong đó, do có sự phân bố rộng rãi nên Western Flower Thrips (Frankliniella occidentalis) và Onion Thrips (bọ trĩ hành) (Thrips tabaci) là các vectơ chính truyền bệnh. Bọ trĩ (Thrips) là những côn trùng có kích thước rất nhỏ (0,5 1mm), khó thấy bằng mắt thường, thân thon, di chuyển nhanh nhẹn bằng cách nhảy, con trưởng thành có thể bay. Chúng thường di chuyển với số lượng lớn và bay theo gió tới hàng dặm. Con trưởng thành màu nâu đen hay đen, ấu trùng màu vàng rơm. Con cái sinh sản không cần con đực, đẻ trứng vào mô mềm của thân cây, lá hay hoa. Một ổ trứng có từ 50 – 60 trứng, ấp trứng trong 7 ngày. Sau khi trứng nở, ấu trùng sẽ ăn ngay, trong khoảng 6 – 7 ngày trước khi bắt đầu chuyển vào giai đoạn “ngủ”. Ấu trùng ăn mô bị nhiễm khoảng 15 phút, chúng đưa virus vào bên trong cơ thể. Thời gian ăn càng kéo dài thì khả năng mang virus càng tăng lên. Chỉ ấu trùng mới có khả năng mang virus. 17 Sau đó, chúng không ăn nữa, chui vào đất, sâu khoảng 8 cm, trở thành nhộng, và bắt đầu “ngủ”. Kết thúc giai đoạn “ngủ”, chúng trở thành bọ trĩ trưởng thành, có cánh và lên mặt đất. Thời gian để từ trứng trở thành bọ trĩ trưởng thành phụ thuộc vào nhiều yếu tố: Nhiệt độ, độ ẩm, điều kiện phát triển. ( Ấu trùng bọ trĩ chưa lan truyền bệnh cho cây ngay được mà phải chờ đến khi chúng trưởng thành. TSWV sản sinh trong bọ trĩ sẽ tốt hơn khi bọ trĩ ở trong ký chủ thực vật của nó. Có hai lý do để cần thời gian cho bọ trĩ trưởng thành: Thời gian để virus di chuyển bên trong cơ thể bọ trĩ, từ miệng vào tuyến nước bọt, để truyền cho cây khác. Con non không có cánh nên khả năng di chuyển sang cây khác khó thực hiện được, vì vậy phải đợi trưởng thành di chuyển dễ dàng hơn. Mỗi năm có nhiều thế hệ bọ trĩ sinh ra và trưởng thành, nên số lượng của chúng khá nhiều. Vòng đời trung bình của bọ trĩ vào khoảng 30 ngày. 2.4.6 Điều kiện phát triển bệnh TSWV thích nghi với điều kiện thời tiết ấm áp, nhiệt độ dao động từ 20oC đến 37 o C. Nhiệt độ cao, ẩm độ thấp gây bất lợi cho bọ trĩ. Nhiệt độ lạnh trong mùa đông cũng làm giảm đáng kể số lượng bọ trĩ. TSWV phát triển trong suốt giai đoạn sinh trưởng, sinh dưỡng của cây, giai đoạn mà virus được bọ trĩ lan truyền từ cây này sang cây khác, từ vùng này sang vùng khác. Virus này có thể qua đông trên nhiều loại cây trồng. Khi nhiệt độ xuống thấp, bọ trĩ mang virus qua đông dưới dạng côn trùng nằm trong đất. Khi xuân tới, thời tiết ấm áp, bọ trĩ sẽ di chuyển từ cỏ dại sang cây trồng để truyền bệnh. Do đó, TSWV cứ lây Hình 2.6 Bọ trĩ trƣởng thành dài 1mm 18 nhiễm từ năm này sang năm khác, từ vụ này đến vụ khác từ những loài bọ trĩ ký sinh trên cây (Ray Cerkauskas, 2004). 2.4.7 Triệu chứng bệnh trên cây nhiễm TSWV Triệu chứng cây nhiễm TSWV rất đa dạng, tùy thuộc vào tuổi cây, điều kiện môi trường, mức độ lây nhiễm, số lượng và thành phần các virus gây hại cho cây ký chủ. Sự nhiễm bệnh cho cây ký chủ được biểu hiện thấy trên những tế bào biểu bì, được truyền bệnh thông qua những vết thương do bọ trĩ cắn. Triệu chứng của bệnh sẽ xuất hiện trong vòng từ 2 đến 4 ngày, hoặc từ 10 ngày đến 6 tuần, có khi lại lâu hơn. Những cây con có thể bị héo và chết trong vòng 1 tuần kể từ khi nhiễm bệnh. Cây nhiễm TSWV có triệu chứng chung là xuất hiện các vòng tròn đồng tâm, những đốm héo trên lá non do sự hoại tử của các mô, có đốm lấm chấm. Đầu tiên những đốm này có màu vàng, nhưng sau đó những vùng bị chết sẽ chuyển sang màu nâu đỏ. Từ cây con đến cây trưởng thành đều có thể bị TSWV tấn công. Khi bị nhiễm virus, cây trồng bị cằn cỗi, còi cọc, chồi phát triển nghiêng về một bên (ne ngọn). Hình thái của cây thay đổi: Lá cây nhăn nheo, vặn vẹo, như bóp nát, thân cây bị uốn cong, ngã, rủ xuống, phát triển bất thường. Cây bị bệnh không phát triển trong nhiều tuần, lá rụng dần và chết. Cây trồng bị nhiễm bệnh vào giai đoạn đang phát triển thì có thể không ra quả hoặc có quả nhưng rất nhỏ, có các đốm nhỏ hay các vòng hoại tử hay thể khảm trên vỏ quả. Đặc điểm này làm giảm đi giá trị cảm quan khi sử dụng hay dùng thương phẩm. Tuy nhiên, triệu chứng này có thể giống với các bệnh do các virus khác, vi khuẩn, nấm hay stress môi trường gây ra. Vì thế cách chẩn đoán bệnh theo triệu chứng bên ngoài chỉ là cách xác định bệnh nhất thời nên có thể không chính xác. 19 Cây thuốc lá Lá thuốc lá Lá đậu phộng Cây đậu phộng Lá cà chua Trái cà chua Trái ớt Thân Hình 2.7 Triệu chứng nhiễm TSWV trên một số thực vật ( 20 2.4.8 Khống chế bệnh do TSWV Cần phải loại ra và tiêu hủy nhanh chóng những cây có biểu hiện bệnh và những cây nghi ngờ nhiễm bệnh tiềm ẩn. Cây con rất dễ bị nhiễm TSWV, do đó nên trồng cây con trong nhà kính hoặc sử dụng màng che cẩn thận, phun thuốc diệt côn trùng để ngăn ngừa bọ trĩ tấn công. Có mật độ trồng phù hợp để tránh sự di chuyển của các loài bọ trĩ từ những vùng nhiễm bệnh đến. Sử dụng cây trồng sạch bệnh, cây kháng bệnh. Hạn chế việc trồng liên tục cùng một loại cây trên cùng một vùng đất. Tránh trồng những cây nhạy cảm với TSWV trong những vùng đang bị ảnh hưởng của TSWV. Loại bỏ các loài cỏ dại và cây mọc tự nhiên quanh khu vực trồng trọt. Bỏ hoang các cánh đồng bị nhiễm sau khoảng 3 – 4 tuần. Trồng xen cây nhạy cảm với cây không nhạy cảm để kháng bệnh. Khống chế bọ trĩ bằng các biện pháp sinh học để có hiệu quả và có lợi nhất, mà không gây ô nhiễm môi trường. Sử dụng nhiều loại thuốc trừ sâu khác nhau, đúng liều lượng và thời gian hợp lý để tiêu diệt được nhiều loài bọ trĩ cùng một lúc và đạt được kết quả tốt nhất. Thay đổi liên tục các loại thuốc trừ sâu để tránh sự kháng thuốc. 2.5 Giới thiệu về Tobacco Mosaic Virus (TMV) 2.5.1 Nguồn gốc của TMV Năm 1892, nhà bác học Nga D. I. Ivanopski khi nghiên cứu về bệnh hoa lá thuốc lá đã phát hiện thấy một loại “nguồn gây bệnh”, không phải là vi khuẩn, không nhìn thấy dưới kính hiển vi quang học mà có thể lọt qua ống lọc vi khuẩn. Năm 1898, M. Baijerinck, Đan Mạch, cũng đã phát hiện và xác nhận nguồn gây bệnh đó mang tên tượng trưng là “virus” có nghĩa là “chất độc”. Năm 1939, Kaushe Pfankuch và Ryska sử dụng kính hiển vi điện tử quan sát thấy virus khảm thuốc lá TMV. Điều này đã giúp cho việc nghiên cứu và phát hiện nhóm virus gây hại thực vật phát triển nhanh chóng và thu được nhiều thành tựu to lớn. TMV là virus thực vật đầu tiên được phát hiện (Võ Thị Thu Oanh, 2002). 21 2.5.2 Cấu trúc của virus TMV TMV hình que, dạng ống thẳng cứng, không di động, chiều dài 300 nm, đường kính 18 nm, trọng lượng phân tử 39,4 triệu Da (Caspa, 1963). Lớp vỏ gồm 2134 phân tử protein, chiếm 95% trọng lượng phân tử, mỗi phân tử protein gắn kết với 3 nucleotide kề cận trên sợi RNA và với các protein khác xung quanh, tạo thành cấu trúc xoắn từ phải qua quanh phân tử RNA (16,3 phân tử protein cho 1 vòng xoắn). Mỗi phân tử protein chứa 158 amino acid. Genome của virus là RNA dương tính. RNA gồm 6401 ribonucleotide, cũng có cấu trúc xoắn tương tự, nằm chính giữa cách 1 bán kính khoảng 4 nm, nhờ đó mà RNA không bị phân hủy bởi enzyme cellulase của lớp vỏ protein. ( 2.5.3 Phân loại TMV TMV thuộc giống Tobamovirus và là một thành viên trong loài virus có cấu trúc giống xoắn alpha. 2.5.4 Dãy ký chủ của TMV TMV có dãy ký chủ rộng lớn, 199 loài và 30 họ, nhưng ký chủ tự nhiên lại có giới hạn, hầu hết thuộc họ Solanaceae: Thuốc lá, cà chua, tiêu, là những cây trồng dễ bị ảnh hưởng nhất. Chưa có vectơ sinh học nào được tìm thấy. 2.5.5 Con đƣờng truyền bệnh Hầu hết những côn trùng ăn lá đều có thể truyền TMV, nhưng không có hiệu quả. TMV có khả năng xâm nhiễm và lây lan rất cao. Bệnh dễ lây lan đến mức chỉ cần có 1 cây bệnh thì có thể lây sang 8 – 10 cây khác. Hình 2.8 Cấu trúc virus TMV 22 Virus dễ dàng truyền qua các vết thương cơ giới, tiếp xúc cơ học trong quá trình trồng trọt hay do sự cọ xát vào nhau giữa lá khỏe và lá bị bệnh. Vì vậy, côn trùng không phải là tác nhân chủ yếu trong việc truyền virus. TMV còn có thể lây sang từ các sản phẩm như thuốc điếu, thuốc nhai. Virus chủ yếu tồn tại trong xác cặn bã (thân, rễ cây) vụ trước còn lại trên mặt luống, đây cũng là nguồn lây bệnh đáng kể, hay có thể từ các cây dại gần khu vực vườn ươm như: Cà dại và cây thù lù cạnh (Physalis angulata L.), là những cây rất mẫn cảm với virus này. Nếu trên ruộng đã có một số cây nhiễm virus thì sự lây lan chủ yếu là do người trồng. Nếu cây con trong vườn ươm đã nhiễm virus thì bệnh sẽ biểu hiện khoảng 1 tuần sau khi trồng. 2.5.6 Điều kiện phát triển bệnh Bệnh dễ xảy ra khi cây dư ẩm, mọng nước. Quá trình lây bệnh trên cây trồng diễn ra chủ yếu vào thời kỳ cây sinh trưởng mạnh. Bệnh lan nhanh vào giai đoạn nhổ cây, xới xáo, vun luống, bẻ ngọn, bấm chồi. Ngoài đồng ruộng, TMV có thể tồn tại với số lượng rất lớn trong rễ hoặc thân cây vụ trước, cho đến khi cây thuốc lá vụ sau được trồng tiếp tục. TMV có trong thân cây hoặc mảnh vụn thuốc lá sau khi thu hoạch xong, sẽ trở nên mất hoạt tính nếu bị nắng mưa phân hủy trong vòng từ 5 đến 6 tháng. Tuy nhiên, chúng có thể tồn tại suốt hơn 2 năm liền trong đất trồng hay các mảnh vụn của thân, rễ nếu các phần này không bị phân hủy. Ngoài ra, loại đất trồng cũng có ảnh hưởng đến thời gian tồn tại của virus. 2.5.7 Triệu chứng bệnh trên cây nhiễm TMV TMV có biểu hiện triệu chứng dạng khảm trên thuốc lá. Lá non bị biến dạng, cong xuống, có khảm, loang lỗ xanh đậm, xanh nhạt, có chổ biến vàng dọc gân lá. Triệu chứng này rõ rệt hơn trên lá non và mô non. Khảm không làm chết cây nhưng nếu bệnh xảy ra cây sẽ bị còi cọc, héo rũ dần. Trong suốt thời gian nhiệt độ không khí cao (khô, nóng), cường độ chiếu sáng mạnh, những lá bị bệnh có thể chết, hiện tượng này gọi là “cháy do khảm”. Trường hợp này vùng chết lan rộng trên lá. Những lá bệnh vặn vẹo, cong queo, kéo dài ra. Trong khi đó, rễ cây bệnh vẫn biểu hiện bình thường. Triệu chứng bệnh thường biểu hiện sau khi trồng từ 7 đến 10 ngày trở lên. Càng nhổ cây con bị bệnh càng muộn thì bệnh ngày càng nặng. 23 (E) (F) (A): Trái cà chua Hình 2.9 Triệu chứng nhiễm TMV trên thực vật (B), (C), (D): Cây thuốc lá (E), (F): Lá thuốc lá ( (A) (D) (B) (C) 24 2.5.8 Khống chế bệnh do TMV Luân canh với cây trồng khác, không phải ký chủ của virus gây bệnh. Tiêu hủy phần còn lại của cây sau thu hoạch. Vệ sinh trong và ngoài khu vực gieo trồng. Chọn vườn ươm trên đất mới hoặc đã luân canh từ 3 vụ trở lên. Sử dụng giống kháng, cây sạch bệnh. Tỉa bỏ cây bệnh ngay sau khi trồng càng sớm càng tốt. Tuyệt đối không hút thuốc trong vườn ươm, ruộng trồng. Khi vào vườn ươm và mỗi 15 – 20 phút làm việc trong luống ươm phải rửa tay chân và công cụ bằng bột giặt hay bằng dung dịch sửa tươi. Không được sử dụng vật dụng có liên quan đến thuốc lá nguyên liệu như: Bao tải đóng kiện, tấm bạt che phủ, sọt đựng lá để che phủ luống ươm và vận chuyển cây con cũng như lá thuốc tươi. Áp dụng hiện tượng kháng chéo: Lây nhiễm chủng virus có độc tính thấp lên cây khỏe nhằm tăng sức chống chịu của cây đối với virus khác có độc tính cao. Cơ sở khoa học của hiện tượng được giải thích bằng giả thiết: Vỏ protein của chủng virus lây nhiễm đầu tiên sẽ cản trở tách RNA ra khỏi vỏ protein của virus sau, do đó ức chế sự nhân lên của virus này. 2.6 Giới thiệu về Cucumber Mosaic Virus (CMV) 2.6.1 Nguồn gốc Bệnh do CMV được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1916 (Doolittle, 1916), là một trong số những bệnh cây sớm nhất được biết là do virus gây ra. Sau đó, chúng xuất hiện ở nhiều nơi khác nhau tại Mỹ, cuối cùng lan tới châu Âu và châu Phi (Price, 1934) và những nơi khác trên thế giới. 2.6.2 Cấu trúc của virus CMV CMV hình tròn, đường kính 28 nm, trọng lượng phân tử vào khoảng 5,8 triệu đến 6,7 triệu Da, trong đó chứa 18% RNA và 82% protein. Genome của nó là ssRNA, có kích thước 8621 kb. Genome chia ra làm 3 phần: Phần lớn nhất dài 3389 kb, phần thứ hai dài 3035 kb và phần thứ ba dài 2197 kb (Gould và Symons, 1977). Tỷ lệ cơ bản của các nucleotide: G: 24%, A: 23%, C: 23%, U: 30%. Cuối đầu 5’ của RNA có 1 mũ methylnucleotide và không có poly (A) ở đầu 3’. Genome có cấu trúc giống như tRNA 25 hoạt động, có khả năng nhận tyrosine. Không tìm thấy 1 nucleic acid nào trong virion mà không thuộc genome virus. Virion được tìm thấy trong tất cả các bộ phận của cây ký chủ và trong tế bào chất. Trong tế bào chất nó có dạng kết tinh (thường là hình thoi, hình lục giác, hình cầu răng cưa, hay dạng lõm). ( 2.6.3 Phân loại CMV Cucumber Mosaic Virus thuộc họ Bromovidae. Họ này gồm 5 giống: Cucumovirus, Alfamovirus, Bromovirus, Ilarvirus và Oleavirus. Trong đó, CMV thuộc giống Cucumovirus. CMV gồm có nhiều dòng, bao gồm: A – CMV, E – CMV, L – CMV, N – CMV, P – CMV, Z – CMV và WAI// WAII, nó được chia ra làm 2 nhóm kháng nguyên, ToRS và DTL (Devergne, 1975). 2.6.4 Dãy ký chủ của CMV CMV có dãy ký chủ rộng lớn, 191 loài trong 40 họ. Trong số đó, chịu ảnh hưởng của virus này nhiều nhất là ớt (Capsicum annum L.), cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.) và chuối (Musa L. spp.). Một số cây trồng ký chủ như: Các loại dưa, cà chua, rau spinach, cần tây, tiêu, cải xoong, củ cải đường, củ cải, su su, thanh yên, bầu bí, đậu lima, hành tây, cây anh đào, khoai tây, đại hoàng, cà rốt, thì là, ngò tây (Chupp và Sherf, 1960), mướp (Huang và cộng sự, 1987), atiso (Chabbouh và Cherif, 1990). Một số cây cảnh làm ký chủ: Cúc, cây phi yến, phong lữ, lay ơn, cây vòi voi, dạ lan hương, vạn thọ, bìm bìm, dừa cạn, dã yên thảo, trúc đào, hoa mõm chó và các loại cây có hoa rực rỡ (Chupp và Sherf, 1960; Agrios, 1978). Hình 2.10 Cấu trúc virus CMV 26 2.6.5 Con đƣờng truyền bệnh CMV có thể truyền bằng con đường cơ học nhưng vì không là virus bền vững như TMV nên không được truyền bởi những người tiếp xúc với cây bệnh. Virus lây lan chủ yếu qua rệp thuốc lá, có hơn 60 loài, bao gồm: Myzus persicae, Acrythosiphon pisum và Aphis craccivora. Có 2 loại rệp: Có cánh và không cánh, nhưng thường là không cánh. Rệp không cánh hình quả trứng màu xanh và đỏ. Khi thiếu thức ăn, rệp mọc cánh để có thể di chuyển sang nơi khác. Rệp non chịu đói kém hơn rệp trưởng thành và nhạy cảm với điều kiện bất lợi của môi trường, thuốc hóa học. Trong quá trình sinh trưởng phát dục rệp non lột xác 3 lần. Trong đó, thành trùng là vectơ quan trọng nhất. Tuy nhiên, tất cả các giai đoạn ấu trùng của rệp đều có thể truyền bệnh. Khi chích hút trên lá bệnh, nó thu nhận virus vào vòi hút chỉ trong 5 giây và truyền sang cây khỏe trong 10 giây. Do truyền theo kiểu virus không bền vững nên khi chúng vừa chích hút xong trên cây bệnh lập tức bay sang cây khỏe gần đó truyền bệnh ngay. Vòng đời trung bình của rệp từ 7 đến 8 ngày, có thể có từ 15 đến 17 vòng đời trong năm. CMV còn được truyền thông qua hạt nhưng ở mức độ không ổn định trong 19 loài ký chủ, bao gồm một số cỏ dại, thực vật ký sinh. 2.6.6 Điều kiện phát triển bệnh CMV sống tốt trong cơ thể rệp không ăn là 8 giờ và trong rệp đang ăn thì ít hơn 4 giờ. Tuy nhiên, rệp mất khả năng mang virus phụ thuộc vào nhiều yếu tố gồm: Nhiệt độ, loài, hành vi tìm thức ăn của chúng, và thời gian di chuyển từ cây bệnh sang cây khỏe. Khả năng rệp truyền CMV sẽ giảm đi sau 2 phút và sẽ mất khả năng lây bệnh sau 2 giờ. CMV xuất hiện trên thuốc lá trong suốt mùa vụ, đồng thời luôn tìm thấy dạng khảm trên nhiều cây trồng khác quanh năm. Điều này phần nào giải thích tại sao CMV tồn tại trên thuốc lá từ năm này sang năm khác. CMV được giữ trong rễ của các cỏ dại lâu năm, hoa và cây trồng trong suốt mùa đông và phát triển trở lại vào mùa xuân lúc rệp truyền virus cho những loại cây trồng nhạy cảm với bệnh. 27 2.6.7 Triệu chứng bệnh trên cây nhiễm CMV Triệu chứng CMV rất đa dạng tùy theo dòng thuốc lá, lại dễ nhầm lẫn với các triệu chứng do virus khác gây ra như Tobacco Etch Virus (TEV), Tobacco Mosaic Virus (TMV). Triệu chứng xuất hiện trên cây bệnh trong khoảng từ 6 đến 8 tuần sau khi trồng. Trên lá bệnh xuất hiện đốm vòng vàng nhạt, khảm nhẹ, chết hoại, hình thành lá mới kéo dài, thùy lá co lại hình sợi, lá bị vặn xoắn, phiến lá bất thường, dày, hơi phồng rộp (u lồi) dọc theo gân phía mặt dưới lá. Các lá còn non có mép bị uốn cong về phía dưới, gân chính và các gân phụ nổi rõ, hơi cong queo, thun cuốn lại, thỉnh thoảng có màu nâu nhạt. Nếu nhiễm nhẹ, các triệu chứng trên chỉ xuất hiện ở các tầng lá phía trên của cây. Cây bị bệnh ngả vàng, lùn, khoảng cách giữa các đốt ngắn lại, hoa biến dạng, thường không cho quả, nếu có thì quả nhỏ, màu nhợt nhạt, lớn chậm. 2.6.8 Khống chế bệnh do CMV Sử dụng giống kháng bệnh, làm sạch cỏ dại xung quanh ruộng. Luân canh với cây trồng không là ký chủ của bệnh. Loại bỏ ngay cây bệnh. Bấm ngọn, bẻ chồi triệt để sẽ làm mất nguồn thức ăn ưa thích của rệp và loại bỏ một phần rệp tập trung ở búp chồi, giảm thu hút rệp có cánh bay đến. Phòng trừ rệp bằng các loại thuốc như: Confider, Oncol, Lanate 0,1% và bằng con đường sinh học. Do khả năng sinh sản của rệp rất lớn nên rất dễ xuất hiện rệp kháng thuốc. Vì thế, sau 3 ngày phun thuốc phải kiểm tra lại, nếu thấy số lượng rệp không giảm thì phải thay thuốc khác. 28 (A) (B) (C) (D) (E) Hình 2.11 Triệu chứng nhiễm CMV trên một số thực vật (F) (A): Trái ớt (B): Trái dưa leo (C): Trái cà chua (D): Cây cà chua (E): Cây thuốc lá (F): Rau diếp ( 29 2.7 Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh do virus gây ra 2.7.1 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử. Trong tế bào ký chủ, virus thường ở dạng kết tinh vô định hình hoặc có hình dạng đặc trưng bởi vô số cá thể virus kết hợp với nhau. Các tinh thể này đôi khi rất khó quan sát thấy. Vì vậy, để tìm hiểu hình thái và cấu trúc của virus thực vật cũng như mô thực vật bị nhiễm bệnh, người ta sử dụng kính hiển vi điện tử với độ phóng đại lớn. Phương pháp trực tiếp và đơn giản nhất là sử dụng dung dịch chứa virus chiết từ lá cây bệnh hay đã được làm tinh khiết cố định bằng hóa chất trên lưới đồng để quan sát dưới kính hiển vi điện tử. Có thể sử dụng kháng huyết thanh khi dùng phương pháp xem trực tiếp để phân biệt trong trường hợp nghi ngờ mẫu có lẫn virus khác. Ngoài ra, người ta còn dùng lát cắt cực mỏng bằng máy cắt tiêu bản hiển vi và nhuộm mẫu được cắt, sau đó quan sát sự hiện diện của virus trong các tế bào thực vật bị nhiễm bệnh được cắt. 2.7.2 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng cây chỉ thị Cây chỉ thị thực chất cũng là những cây ký chủ (có thể là cây trồng hay cây dại) nhưng có triệu chứng bệnh rất điển hình và biểu hiện bệnh nhanh chóng. Phương pháp chẩn đoán bằng cây chỉ thị là một phương pháp khá chính xác trong nghiên cứu bệnh virus thực vật. Cây chỉ thị được chia làm hai nhóm: Nhóm cây nhiễm bộ phận: Là những cây chỉ thị mà khi truyền bệnh nhân tạo sẽ có vết chết cục bộ ngay trên bề mặt lá mà không di chuyển đến những bộ phận khác của cây. Nhóm cây nhiễm hệ thống: Là những cây chỉ thị mà khi truyền bệnh nhân tạo sẽ tạo sự chết hệ thống trên toàn cây. 2.7.3 Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng Triệu chứng bệnh là biểu hiện bên ngoài, phản ánh những đặc điểm riêng biệt của một loại bệnh do một nguyên nhân nào đó gây ra. Do đó, đối với các loại bệnh này, chẩn đoán theo triệu chứng bệnh là một phương pháp nhanh chóng, khá chính xác. Vì vậy, có thể căn cứ vào triệu chứng bên ngoài thể hiện những đặc trưng điển hình về hình thái vết bệnh, màu sắc vết bệnh, vị trí và bộ phận bị bệnh mà chẩn đoán bệnh. 30 Tuy nhiên, trong một số trường hợp cũng dễ dẫn đến những nghi hoặc và nhầm lẫn, nhất là trong trường hợp chẩn đoán các bệnh có cùng một triệu chứng bên ngoài tương tự nhau nhưng thực chất lại do các ký sinh vật khác nhau gây ra. Triệu chứng bệnh tuy có tính chất ổn định nhưng vẫn có thể biến đổi ít nhiều tùy thuộc vào đặc điểm của giống cây và điều kiện ngoại cảnh. Do đó, trong những trường hợp phức tạp cần phải tiến hành chẩn đoán bệnh bằng các phương pháp bổ sung khác. 2.8 ELISA ( Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 2.8.1 Nguyên lý ELISA Kỹ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng: Kháng nguyên, kháng thể và cơ chất tạo màu, gồm hai bước: Phản ứng miễn dịch học: Sự kết hợp kháng nguyên – kháng thể. Phản ứng hóa học: Nhờ hoạt tính của enzyme để giải phóng oxi nguyên tử và chính oxi nguyên tử này oxy hóa cơ chất tạo màu. Cơ chất tạo màu thay đổi màu chứng tỏ sự có mặt của enzyme và chứng minh sự kết hợp kháng nguyên với kháng thể. 2.8.2 Phân loại ELISA 2.8.2.1 ELISA trực tiếp (Direct ELISA) ELISA trực tiếp được xem là dạng cơ bản nhất của ELISA. Là phương pháp đánh dấu kháng thể với huỳnh quang để phát hiện kháng nguyên. Trong phương pháp này, kháng thể sơ cấp được đánh dấu phản ứng trực tiếp với kháng nguyên. Phương pháp ELISA trực tiếp thường được dùng để dò lượng kháng nguyên có trong mẫu bằng cách dùng kháng thể đơn dòng. 2.8.2.2 ELISA gián tiếp (Indirect ELISA) Hệ thống ELISA gián tiếp tương tự như ELISA trực tiếp ở chổ kháng nguyên được cố định trong pha rắn và sau đó, được gắn kết với kháng thể đặc hiệu được thêm vào. Tuy nhiên, các kháng thể này không gắn với các enzyme tạo màu như ở ELISA trực tiếp mà lại được gắn kết bằng kháng thể thứ cấp (có gắn enzyme tạo màu) được thêm vào sau đó. Các kháng thể thứ cấp này được sản xuất trong cơ thể động vật khác loài so với động vật sản xuất ra kháng thể sơ cấp. Do đó, nếu kháng thể sơ cấp được tạo ra từ cơ thể thỏ thì kháng thể thứ cấp sẽ là những Ig kháng thỏ sản xuất trong cơ 31 thể các động vật khác (thường là ngựa). Điều này tạo ra tính linh hoạt trong quá trình sử dụng. Phương pháp này sử dụng kháng thể thứ cấp được đánh dấu để phát hiện. Đầu tiên, kháng thể sơ cấp được gắn với kháng nguyên. Tiếp theo, cho kháng thể thứ cấp được đánh dấu vào để nhận biết kháng thể sơ cấp. Điều quan trọng là enzyme tạo màu phải có tính đặc hiệu. 2.8.2.3 Sandwich ELISA Sandwich ELISA là một xét nghiệm khá nhạy dùng để định lượng hormone, kháng nguyên gây bệnh truyền nhiễm và cytokine. Dạng ELISA này có thể cần thiết hơn ELISA trực tiếp và gián tiếp trong một vài trường hợp, đặc biệt là khi lượng mẫu cần phân tích quá loãng để gắn kết lên đĩa polystyrene (ví dụ như một protein trong nuôi cấy bề mặt) hoặc không gắn lên đĩa plastic (ví dụ như phân tử hữu cơ nhỏ). Đây là phương pháp xét nghiệm dựa trên việc đo lượng chất cần phân tích khi chất đó được gắn giữa hai kháng thể bắt (capture antibody) và kháng thể phát hiện (detecting antibody). 2.8.3 Các yếu tố ảnh hƣởng trong phản ứng ELISA Số lượng kháng thể thứ nhất được gắn vào đáy giếng. Ái lực của kháng thể thứ nhất đối với kháng nguyên. Ái lực của kháng thể thứ hai đối với kháng nguyên. Hoạt tính chuyên biệt của kháng thể thứ hai. 2.8.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả phản ứng ELISA Đối chứng âm cho kết quả dương tính do bị nhiễm từ chất tạo màu hoặc từ kháng thể được đánh dấu hoặc do bản thân đối chứng bị nhiễm. Đối chứng dương không xuất hiện màu mà mẫu kiểm tra có màu là do đối chứng quá hạn sử dụng hay điều kiện bảo quản không tốt. Đối chứng dương và mẫu kiểm tra có màu quá thấp thì cần phải kiểm tra lại kháng thể được gắn vào enzyme và nồng độ chất tạo màu. 2.9 PCR (Polymerase Chain Reaction) 2.9.1 Nguyên tắc DNA polymerase là enzyme có chức năng tổng hợp các sợi đơn DNA. Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần 32 sự hiện diện của những mồi chuyên biệt (primer). Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và DNA polymerase sẽ nối dài để hình thành mạch mới. Thông qua phương pháp PCR, hàng triệu đoạn DNA đồng nhất có thể được thu thập một cách dễ dàng từ một hỗn hợp các phân tử bao gồm RNA, protein, polysaccharide, DNA không có chức năng và DNA có chức năng di truyền. Người ta còn gọi nó là kỹ thuật tạo dòng DNA in vitro. Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm ba bước: Bước 1: Biến tính sợi đôi thành sợi đơn (Denaturation) Phân tử DNA mạch kép tách thành hai mạch đơn, ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy Tm của phân