Khóa luận Khảo sát hiệu quả một số thuốc bảo vệ thực vật dùng phòng trị bệnh rụng lá Corynespora (Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei.) trên cây cao su

a các loại thuốc đƣợc xử lý thống kê theo kiểu khối đầy đủ ngẫu nhiên 2 yếu tố là thuốc và nồng độ, kết quả đƣợc nêu trong phụ lục 1.1. Bảng Anova ở các phụ bảng 1.1.1, phụ bảng 1.1.2, phụ bảng 1.1.3 và phụ bảng 1.1.4 đều cho thấy có sự khác biệt rất nhiều giữa các loại thuốc cũng nhƣ giữa các nồng độ với nhau, đồng thời sự tƣơng tác giữa thuốc và nồng độ là rất có ý nghĩa (P = 0,0000 < 0.001). Khi so sánh phân hạng các loại thuốc, cho thấy thuốc Hexaconazole và Flusilazole luôn có hiệu quả ức chế cao nhất ở tất cả các ngày theo dõi. Thuốc Cyproconazole có hiệu quả tƣơng đƣơng Flusilazole, nhƣng kém hơn Hexaconazole và cao hơn các thuốc khác. Thuốc Difenoconazole có hiệu quả ức chế kém ở những ngày đầu (kém hơn thuốc Propiconazole, Triadimenol, Tebuconazole; phụ bảng 1.1.1), nhƣng hiệu quả tăng dần cho đến ngày thứ 5 và thứ 7 thì hiệu quả ức chế cao hơn thuốc Triadimenol và Tebuconazole. Thuốc Propiconazole hầu nhƣ không thể hiện sự khác biệt so với các thuốc Difenoconazole, Tebuconazole, Triadimenol. Chỉ đến ngày thứ 7 thuốc Propiconazole mới cho thấy hiệu quả cao hơn Triadimenol. Còn thuốc Triadimenol và Tebuconazole không cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa. 30 Thuốc Triacyclazole luôn cho hiệu quả ức chế kém nhất, thuốc Triadimefon cũng cho hiệu quả kém hơn các thuốc khác ở tất cả các ngày theo dõi (phụ lục 1.1). Bảng 4.1 còn cho thấy hầu hết các loại thuốc khi nồng độ tăng dần thì hiệu quả ức chế cũng tăng dần, chỉ trừ thuốc Difenoconazole và Triacyclazole. Trong thuốc Difenoconazole, khi nồng độ tăng từ 0,5 đến 25 ppm thì hiệu quả ức chế hầu nhƣ không có sự khác biệt (phụ bảng 1.1.5). Trong thuốc Triacyclazole khi nồng độ tăng từ 0,1 đến 0,5 thì hiệu quả ức chế tăng lên cao nhất, rồi lại giảm dần đến thấp nhất ở nồng độ 12,5; sau đó mới tăng lên khi nồng độ tăng lên 25 ppm. Khi xử lý thống kê thì cho thấy các nồng độ của thuốc Triacyclazole không có sự khác biệt về hiệu quả ức chế (phụ bảng 1.1.6). Điều này cũng đƣợc thể hiện rõ trong bảng 4.2, thuốc Difenoconazole từ nồng độ 0,5 đến 25 thì tốc độ phát triển đƣờng kính khuẩn lạc hầu nhƣ không thay đổi, còn Triacyclazole thì tốc độ cao nhất ở nồng độ 12,5. Điều này có lẽ do hiệu quả ức chế ngƣợc của thuốc Triacyclazole khi nồng độ tăng ở mức nhất định thì kích thích sự phát triển của nấm, còn nồng độ thấp hơn hoặc cao hơn thì lại ức chế mạnh hơn. Các loại thuốc khác là Cyproconazole, Flusilazole, Hexaconazole, Triadimenol, Tebuconazole, Propiconazole và Triadimefon đều có tốc độ phát triển đƣờng kính khuẩn lạc giảm khi nồng độ thuốc tăng (bảng 4.2). Nhìn chung, tất cả các nghiệm thức đều có tốc độ phát triển đƣờng kính tăng dần từ ngày thứ 1 đến ngày thứ 5, sau đó lại giảm dần đến ngày thứ 7 (bảng 4.2). Điều này hợp với quy luật phát triển của vi sinh vật nói chung và vi nấm nói riêng, vì trong thời gian 1 – 2 ngày đầu nấm mới cấy vào cần thời gian thích nghi với môi trƣờng mới, sau đó chúng mới phát triển nhanh và khi có mật độ lớn thì tốc độ phát triển giảm dần vì lý do dinh dƣỡng và diện tích giới hạn. 31 Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của thuốc trừ nấm đến tốc độ phát triển đƣờng kính khuẩn lạc Thuốc Nồng độ (ppm-ai) Tốc độ phát triển đƣờng kính khuẩn lạc (cm/ngày) 1 - 3 ngày 3 - 5 ngày 5 - 7 ngày Trung bình Cyproconazole 0,1 0,70 0,77 0,68 0,72 0,5 0,45 0,59 0,45 0,50 2,5 0,24 0,27 0,31 0,28 12,5 0,00 0,14 0,02 0,05 25 0,00 0,00 0,00 0,00 Difenoconazole 0,1 0,52 0,58 0,54 0,55 0,5 0,27 0,40 0,42 0,37 2,5 0,32 0,32 0,33 0,32 12,5 0,34 0,30 0,22 0,28 25 0,58 0,31 0,19 0,36 Flusilazole 0,1 0,48 0,63 0,53 0,55 0,5 0,28 0,49 0,38 0,38 2,5 0,21 0,30 0,29 0,27 12,5 0,00 0,42 0,10 0,18 25 0,00 0,00 0,00 0,00 Hexaconazole 0,1 0,48 0,59 0,52 0,53 0,5 0,23 0,44 0,39 0,35 2,5 0,43 0,21 0,23 0,29 12,5 0,00 0,00 0,00 0,00 25 0,00 0,00 0,00 0,00 Triadimenol 0,1 0,88 0,91 0,83 0,87 0,5 0,61 0,68 0,61 0,64 2,5 0,43 0,57 0,45 0,48 12,5 0,50 0,45 0,37 0,44 25 0,42 0,20 0,26 0,29 Tebuconazole 0,1 0,81 0,97 0,90 0,89 0,5 0,65 0,79 0,64 0,69 2,5 0,32 0,52 0,46 0,43 12,5 0,39 0,31 0,21 0,30 25 0,43 0,24 0,14 0,27 Triacyclazol 0,1 0,99 1,11 0,88 0,99 0,5 0,83 0,95 0,82 0,87 2,5 0,84 0,99 0,92 0,92 12,5 1,01 1,19 1,03 1,08 25 0,86 0,97 0,95 0,93 Propiconazole 0,1 0,74 0,86 0,80 0,80 0,5 0,55 0,67 0,59 0,60 2,5 0,22 0,46 0,43 0,37 12,5 0,44 0,26 0,20 0,30 25 0,44 0,17 0,15 0,25 Triadimefon 0,1 1,01 1,05 0,99 1,02 0,5 0,85 0,99 0,90 0,92 2,5 0,68 0,81 0,75 0,75 12,5 0,53 0,71 0,63 0,62 25 0,59 0,48 0,47 0,51 Đối chứng 0 1,22 1,33 0,99 1,18 32 Tóm lại, qua sự phát triển của nấm trong từng giai đoạn có thể rút ra kết luận rằng thuốc Hexaconazole và Flusilazole có hiệu quả ức chế cao nhất, thuốc Cyproconazole có hiệu quả ức chế cao thứ 3. Thuốc Difenoconazole cũng có hiệu quả ức chế cao ngay từ nồng độ thấp nhƣng khi tăng nồng độ lên cao 25 ppm thì hiệu quả ức chế tăng rất ít chỉ đạt 72%. Điều này chứng tỏ để đạt hiệu quả ức chế 100% thì thuốc Difenoconazole cần nồng độ rất cao (điều này sẽ đƣợc thấy rõ hơn trong khi xử lý tƣơng quan hồi quy - bảng 4.3). Bảng 4.3: Phƣơng trình tƣơng quan tuyến tính và chỉ số LD50 của các loại thuốc sau 7 ngày nuôi cấy. Thuốc Phƣơng trình tƣơng quan tuyến tính (Y = bX + a) Hệ số tƣơng quan (R) Giá trị xác xuất (P) LD50 LD99 Cyproconazole Y = 27,0053X + 10,3137 0,998052 0,0001 0,2948 19,232 Difenoconazole Y = 7,91923X + 46,3682 0,931434 0,02133 0,0287 44267 Flusilazole Y = 19,112X + 31,5271 0,991204 0,00099 0,0926 33,915 Hexaconazole Y = 20,9658X + 31,1211 0,992965 0,00071 0,0795 17,282 Triadimenol Y = 21,5622X + 5,37855 0,995469 0,00037 1,1734 219,75 Tebuconazole Y = 24,3444X - 0,219241 0,998072 0,0001 1,1558 119,03 Triacyclazol Y = -1,33733X + 20,4185 -0,195895 0,75218* Propiconazole Y = 21,7469X + 10,6099 0,997317 0,00017 0,6476 116,01 Triadimefon Y = 17,374X - 5,53363 0,985076 0,00218 15,717 10391 (Ghi chú: * giá trị xác xuất (P) > 0,05 suy ra bác bỏ phƣơng trình tƣơng quan tuyến tính) Trong đó: X = Lg(C*100) C: nồng độ thuốc (ppm a.i.) Y: % ức chế đƣờng kính khuẩn lạc Bảng 4.3 cho thấy mối tƣơng quan giữa sự ức chế đƣờng kính khuẩn lạc và nồng độ của các thuốc Cyproconazole, Flusilazole, Hexaconazole, Triadimenol, Tebuconazole, Propiconazole, Triadimefon là rất chặt chẽ và đáng tin cậy (hệ số tƣơng quan biến động từ 0,9851 đến 0,9981; giá trị P < 0,01). Còn đối với thuốc 33 Difenoconazole thì mối tƣơng quan cũng khá cao (R = 0,9314) nhƣng có độ tin cậy trung bình (0,01 < P < 0,05). Hơn nữa phƣơng trình tuyến tính của thuốc Difenoconazole lại có hệ số góc (Slope, b = 7,91923) nhỏ hơn các loại thuốc khác. Điều này có nghĩa là yếu tố nồng độ của thuốc Difenoconazole ít ảnh hƣởng đối với hiệu quả ức chế nấm. Chính vì vậy mà khi tính chỉ số LD99 (liều lƣợng làm chết 99% cá thể) của thuốc Difenoconazole thì cho giá trị rất cao (44267 ppm), tuy nhiên chỉ số LD50 của Difenoconazole lại thấp nhất (0,0287 ppm). Theo phƣơng pháp đánh giá của Finney (1968) thì các loại thuốc Cyproconazole, Difenoconazole, Flusilazole, Hexaconazole, Triadimenol, Tebuconazole, Propiconazole đều có hiệu lực trị nấm rất cao (LD50 < 10 ppm a.i.), thuốc Triadimefon có hiệu quả trung bình, còn thuốc Triacyclazole là không có hiệu lực (thuốc Triacyclazole có P > 0,05 nên không có mối tƣơng quan rõ ràng giữa nồng độ thuốc và hiệu quả ức chế nấm). Hình 4.3. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc Cyproconazole sau 7 ngày cấy nấm 34 Hình 4.4. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc Difenoconazole sau 7 ngày cấy nấm Hình 4.5. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc Flusilazole sau 7 ngày cấy nấm 35 Hình 4.6. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc Hexaconazole sau 7 ngày cấy nấm Hình 4.7. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc Triadimenol sau 7 ngày cấy nấm 36 Hình 4.8. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc Tebuconazole sau 7 ngày cấy nấm Hình 4.9. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc Triacyclazole sau 7 ngày cấy nấm 37 Hình 4.10. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc Propiconazole sau 7 ngày cấy nấm Hình 4.11. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng bị đầu độc thuốc Triadimefon sau 7 ngày cấy nấm 38 Trong quá trình thí nghiệm, theo dõi mật độ khuẩn ty thì thấy ở các đĩa đối chứng và các đĩa bổ sung thuốc Triacyclazole đều có khuẩn ty mọc thƣa hơn tất cả các thuốc khác. Điều này chứng tỏ rằng, khi không có sự ức chế trên môi trƣờng thì khuẩn ty dễ mọc lan rộng ra và do đó chúng mọc thƣa hơn. Còn ở những nghiệm thức có sự ức chế cao thì khuẩn ty không mọc lan rộng ra đƣợc và chúng phải mọc dày lại. Nhƣ vậy, có thể đi đến kết luận rằng thuốc Triacyclazole là cho hiệu quả ức chế nấm trên môi trƣờng in vitro không cao, thuốc Triadimefon cho hiệu quả ức chế trung bình, Difenoconazole cho hiệu quả ức chế cao ngay từ nồng độ thấp nhƣng khi tăng nồng độ lên cao thì hiệu quả lại tăng rất ít. Còn các thuốc Cyproconazole, Flusilazole, Hexaconazole, Triadimenol, Tebuconazole, Propiconazole đều cho hiệu quả ức chế cao, trong đó cao nhất là Hexaconazole, Flusilazole kế đến là Cyproconazole, Propiconazole, Tebuconazole và Triadimenol. 4.2.2. Ảnh hƣởng của thuốc đến mật độ, kích thƣớc và tỉ lệ nảy mầm của bào tử Ngoài việc ức chế về sự phát triển và hình thái của khuẩn lạc, thuốc trừ nấm còn có tác động đến bào tử do nấm tạo ra về số lƣợng và kích thƣớc. Những bào tử này cũng bị ảnh hƣởng đến sức sống qua sự nảy mầm và phát triển của ống mầm (germtube). Điều này là rất có ý nghĩa, bởi vì mật độ bào tử và sự nảy mầm của bào tử nấm thƣờng liên quan tới khả năng gây bệnh của chúng, nếu mật độ và tỉ lệ nảy mầm cao thì cũng đồng nghĩa là khả năng lây lan và xâm nhiễm cao hơn. Nhƣ vậy, không những hạn chế sự bùng phát trở lại của mầm bệnh mà còn giảm thiểu nguy cơ xuất hiện những chủng nấm kháng thuốc, gây khó khăn cho việc quản lý bệnh sau này. Các thuốc đƣợc sử dụng trong thí nghiệm này đều thuộc nhóm Triazole, thế hệ thuốc trừ nấm lƣu dẫn mới. Ngoài khả năng lƣu dẫn trong cây, chúng cũng có tính năng hấp thu và dịch chuyển trong tế bào của nấm. Chúng có tác dụng kìm hãm quá trình sinh tổng hợp và chuyển hoá lanosterol thành ergosterol (một tiền chất vitamin D của tế bào nấm), dẫn tới sự ảnh hƣởng đến quá trình hình thành vách tế bào, làm 39 nấm không hấp thu đƣợc nƣớc và chết, đồng thời sự giảm hàm lƣợng ergosterol còn tác động tới chu trình vận chuyển năng lƣợng của tế bào, ngăn cản sự hình thành giác hút và sự hình thành bào tử. (Nguyễn Trần Oánh, 1997) Trong các thí nghiệm này, tiến hành khảo sát những ảnh hƣởng của 9 loại thuốc đến khả năng hình thành bào tử nấm trên môi trƣờng bị đầu độc, kích thƣớc bào tử đƣợc hình thành và tỉ lệ nảy mầm của chúng. 4.2.2.1. Sự ảnh hƣởng của thuốc đến mật độ bào tử hình thành trên môi trƣờng bị đầu độc Tất cả các đĩa thí nghiệm, sau khi kết thúc khảo sát đƣờng kính khuẩn lạc, đƣợc đem ra tách bào tử và đếm số lƣợng bào tử trên kính hiển vi (ngoại trừ những nghiệm thức không có đƣờng kính khuẩn lạc phát triển nhƣ Cyproconazole, Flusilazole nồng độ 25 ppm; Hexaconazole nồng độ 12,5 và 25 ppm; hoặc có khuẩn lạc mà khuẩn ty mới chỉ bắt đầu lan xuống môi trƣờng nhƣ Cyproconazole, Flusilazole nồng độ 12,5 ppm). Từ đó tính ra mật độ bào tử trên 1 cm2 diện tích khuẩn lạc. Kết quả đƣợc ghi nhận ở cả 3 đợt và số liệu trung bình đƣợc nêu trong bảng 4.4. Tuy nhiên, do mật độ bào tử biến thiên rất nhiều giữa các đợt, cũng nhƣ giữa các nghiệm thức (không có sự tƣơng đồng về biến lƣợng các nghiệm thức), nên cần thực hiện chuyển đổi số liệu sang dạng Lg (mật độ + 1), sau đó kiểm tra lại biến lƣợng thì thấy có sự tƣơng đồng rồi mới tiến hành xử lý trắc nghiệm phân hạng. Kết quả xử lý nêu trong phụ bảng 1.2.1. 40 Bảng 4.4. Sự ảnh hƣởng của các loại thuốc lên mật độ, kích thƣớc và tỉ lệ nảy mầm của bào tử Thuốc Nồng độ (ppm-ai) Mật độ bào tử (bt/cm2) Kích thƣớc bào tử (µm) Tỉ lệ nảy mầm (%) Chiều dài ống mầm Chiều dài Chiều rộng Số vách Cyproconazole 0,1 109,75 62,51 10,26 4,61 25,0 22,75 0,5 107,43 54,90 10,15 4,14 0,0 2,5 393,13 63,52 10,27 5,53 5,0 23,83 12,5 25 Difenoconazole 0,1 190,90 56,29 9,90 4,60 3,3 38,00 0,5 97,56 53,17 10,03 4,41 30,0 61,44 2,5 108,42 59,84 9,85 4,91 0,0 12,5 48,35 63,01 10,31 5,38 0,0 25 80,92 59,71 10,28 4,98 8,3 12,00 Flusilazole 0,1 343,22 63,79 10,46 4,68 20,0 39,04 0,5 169,80 55,99 10,56 4,70 32,5 60,69 2,5 1874,23 52,91 10,88 4,48 41,7 44,54 12,5 25 Hexaconazole 0,1 258,67 63,47 10,19 4,58 0,0 0,5 384,11 61,28 10,14 4,85 0,0 2,5 955,67 48,21 10,53 4,03 10,0 11,56 12,5 25 Triadimenol 0,1 80,86 61,84 10,18 4,49 0,0 0,5 242,04 60,66 10,03 4,91 3,3 3,50 2,5 79,90 63,24 10,53 5,60 0,0 12,5 440,75 62,94 10,38 5,43 35,0 43,60 25 1420,64 50,40 10,52 4,16 8,3 26,75 Tebuconazole 0,1 106,32 59,16 10,34 4,38 0,0 0,5 62,36 61,31 10,26 4,71 7,5 47,50 2,5 112,19 63,83 10,33 5,10 26,7 34,23 12,5 365,78 66,52 10,65 5,53 0,0 25 660,81 58,13 10,69 5,24 6,7 6,17 Triacyclazol 0,1 290,91 65,18 10,45 5,00 0,0 0,5 72,19 62,15 10,27 4,92 26,7 59,94 2,5 186,90 63,26 10,21 4,74 0,0 12,5 51,98 61,25 10,41 4,92 0,0 25 42,11 56,16 10,05 4,01 18,3 11,63 Propiconazole 0,1 222,99 61,02 10,31 4,61 12,5 4,80 0,5 374,72 64,21 10,38 4,64 10,0 11,33 2,5 171,66 59,66 10,27 4,93 3,3 6,25 12,5 472,05 62,37 10,03 5,62 1,7 97,50 25 2112,57 62,83 10,43 5,56 0,0 Triadimefon 0,1 156,87 68,35 10,55 4,93 5,0 12,50 0,5 48,65 63,88 10,36 4,98 2,5 65,00 2,5 89,37 59,20 10,01 4,58 1,7 6,00 12,5 167,37 57,53 10,46 5,11 1,7 3,00 25 510,47 54,44 10,28 4,59 0,0 Đối chứng 0 48,54 68,35 10,40 5,32 3,3 3,75 41 Kết quả ở phụ bảng 1.2.1 cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức thí nghiệm (P = 0,0182 < 0,05). Trong bảng phân hạng, nhận thấy hầu hết các nghiệm thức có mật độ bào tử cao đều là những nghiệm thức có hiệu quả ức chế khuẩn ty cao nhƣ Hexaconazole (nồng độ 0,1; 0,5 và 2,5 ppm); Cyproconazole, Flusilazole (nồng độ 2,5 ppm); Propiconazole, Triadimenol, Tebuconazole (nồng độ 12,5 và 25 ppm) và Triadimefon nồng độ 25 ppm. Có lẽ đây là cơ chế tự vệ của nấm khi môi trƣờng sống không thuận lợi thì chúng sẽ tạo ra nhiều bào tử để duy trì sự tồn tại dạng tiềm sinh. Trên bảng 4.4 cho thấy hầu nhƣ các loại thuốc đều có mật độ bào tử tăng khi nồng độ thuốc tăng, chỉ trừ thuốc Difenoconazole và Triacyclazole thì ngƣợc lại, có mật độ bào tử giảm khi nồng độ tăng. Có lẽ do khi tăng nồng độ của 2 loại thuốc này không ảnh hƣởng đến sự phát triển khuẩn ty nên cũng ít ảnh hƣởng tới mật độ bào tử. Bên cạnh đó, khi so sánh phân hạng với nghiệm thức đối chứng (phụ bảng 1.2.1), thì thấy hầu hết các nghiệm thức đều không có sự khác biệt so với đối chứng. Điều này chứng tỏ các loại thuốc thí nghiệm không có tác dụng kìm hãm sự hình thành bào tử của nấm C. cassiicola trên môi trƣờng in vitro. Ngƣợc lại, một số thuốc Hexaconazole, Flusilazole, Cyproconazole, Propiconazole, Triadimenol, Tebuconazole, Triadimefon còn kích thích tạo bào tử ở các nồng độ ức chế cao. 4.2.2.2. Sự ảnh hƣởng của thuốc đến hình thái bào tử hình thành trên môi trƣờng bị đầu độc Sau khi đếm số lƣợng bào tử xong, các lame đƣợc chuyển sang đo kích thƣớc bào tử cả về chiều dài lẫn chiều rộng, đồng thời đếm số vách ngăn của mỗi bào tử. Mỗi nghiệm thức đƣợc đo ngẫu nhiên 40 bào tử/lần lặp lại. Kết quả số liệu trung bình đƣợc nêu trong bảng 4.4, và đƣợc xử lý thống kê trong phụ lục 1.2. 42 a) Sự ảnh hƣởng của thuốc đến chiều dài bào tử Qua phụ bảng 1.2.2 cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức về chiều dài bào tử (P = 0.0245). Cụ thể là các thuốc Hexaconazole, Flusilazole nồng độ 2,5 ppm, Triadimenol nồng độ 25 ppm, Difenoconazole nồng độ 0,5 ppm có chiều dài bào tử ngắn nhất và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng. Tuy nhiên, ở những nồng độ khác thì các thuốc trên lại không cho thấy khác biệt so với đối chứng. Theo dõi trên bảng 4.4 cũng nhận thấy hầu hết các thuốc có sự biến thiên chiều dài bào tử không theo quy luật khi nồng độ tăng lên. Chiều dài bào tử biến thiên từ 48,21 µm đến 68,35 µm. Điều đó cho thấy chiều dài bào tử ít biến động so với mô tả của các tác giả (theo Ellis và Holiday (1971) chiều dài biến thiên từ 22 – 300 m). Nhƣ vậy chứng tỏ các loại thuốc không có ảnh hƣởng rõ ràng tới chiều dài bào tử. b) Sự ảnh hƣởng của thuốc đến chiều rộng của bào tử Qua phụ bảng 1.1.3 cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức về chiều rộng bào tử (P = 0,096 > 0.05). Trong bảng 4.4 cũng cho thấy chiều rộng bào tử biến thiên rất ít từ 9,85 đến 10,88 µm. c) Sự ảnh hƣởng của thuốc đến số vách ngăn của bào tử Theo dõi trên bảng 4.4 và phụ bảng 1.2.4 thì thấy hầu nhƣ không có sự khác biệt lớn giữa các nghiệm thức về số vách ngăn trên 1 bào tử (P = 0,0523 > 0,05), số vách ngăn biến thiên từ 4,01 đến 5,62. Nhƣ vậy có thể kết luận các loại thuốc cũng không ảnh hƣởng tới số vách ngăn trên 1 bào tử. 4.2.2.3. Sự ảnh hƣởng của thuốc đến khả năng nảy mầm của bào tử hình thành trên môi trƣờng bị đầu độc Tỉ lệ nảy mầm của bào tử cả 3 đợt đƣợc ghi nhận và xử lý thống kê nêu trong phụ bảng 1.2.5, số liệu trung bình đƣợc nêu trên bảng 4.4. Từ kết quả cho thấy không có sự khác biệt ý nghĩa giữa các nghiệm thức về hiệu quả ức chế sự nảy mầm 43 của bào tử (P = 0,1638). Tỉ lệ bào tử nảy mầm trung bình của tất cả các nghiệm thức là 9%. Đây là tỉ lệ rất thấp, ngay cả nghiệm thức đối chứng không xử lý thuốc cũng có tỉ lệ bào tử nảy mầm rất thấp (3%). Điều này có thể do chủng nấm phân lập đƣợc, qua nhiều lần cấy chuyền trên môi trƣờng nhân tạo, chúng đã bị thoái hóa về khả năng nảy mầm bào tử. Nhƣ vậy, tỉ lệ bào tử nảy mầm trong thí nghiệm là rất thấp và các loại thuốc không ảnh hƣởng tới khả năng nảy mầm của chúng. Những bào tử có nảy mầm thì đƣợc đo chiều dài của ống mầm (hình 4.12), số liệu trung bình đƣợc nêu trên bảng 4.4. Do tỉ lệ nảy mầm thấp nên số liệu về chiều dài ống mầm bị khuyết nhiều, do vậy ở đây chƣa thể đƣa ra kết quả đánh giá. Hình 4.12. Bào tử và ống mầm nấm C. cassiicola Chú thích: A – hình ảnh chụp ở vật kính X10 (1 vạch trên thƣớc tƣơng ứng 10 µm). B – hình ảnh chụp ở vật kính X40 (1 vạch trên thƣớc tƣơng ứng 2,43µm). a – vách ngăn của bào tử. b – ống mầm của bào tử. b a a b A B 44 4.3. Kết quả thí nghiệm trên lá cắt rời Dựa vào phƣơng pháp tuyển non dòng vô tính bằng cách gây bệnh nhân tạo trên lá cao su cắt rời (Chee, 1988), chúng tôi bƣớc đầu phát triển thành phƣơng pháp thử nghiệm hiệu quả của các thuốc trị nấm trên lá cao su cắt rời. Phƣơng pháp này cơ bản vẫn giống phƣơng pháp tuyển non, nhƣng thay vì sử dụng lá cao su của nhiều dòng vô tính thì ở đây chỉ dùng lá cao su của 1 dòng vô tính mẫm cảm với bệnh để khảo sát. Đồng thời, trƣớc khi lây bệnh bằng bào tử thì các lá cao su đã đƣợc phun thuốc trừ nấm trƣớc 60 phút. Dựa vào cấp độ nhiễm bệnh của từng lá, tính chỉ số bệnh (CSB) và tỉ lệ bệnh (TLB) của từng nghiệm thức để so sánh hiệu quả phòng trừ của các loại thuốc, đồng thời giới hạn bớt nồng độ để thử nghiệm ngoài đồng. Do điều kiện phòng thí nghiệm và thời gian thực tập đề tài có hạn nên ở đây chỉ chọn ra 6 loại thuốc có hiệu quả trị nấm tốt nhất trong thí nghiệm in vitro, dựa vào chỉ số LD50*100 và LD99 (bảng 4.3) để đƣa ra 3 nồng độ khác nhau cho mỗi loại thuốc và áp dụng cho thí nghiệm trên lá cao su cắt rời. Các loại thuốc và nồng độ tƣơng ứng là: Cyproconazole nồng độ 10; 30; 50 ppm. Difenoconazole nồng độ 5; 62,5; 125 ppm. Flusilazole nồng độ 10; 20; 40 ppm. Hexaconazole nồng độ 4; 8; 20 ppm. Tebuconazole nồng độ 50; 100; 150 ppm. Propiconazole nồng độ 40; 62,5; 125 ppm. Lá cao su sử dụng trong thí nghiệm này đƣợc lấy trên dòng vô tính mẫm cảm RRIV 4 từ vƣờn Dự Án Giống Cao Su Quốc Gia/VNCCSVN. Các lá đƣợc chọn là những lá không bị bệnh, 3 đến 4 ngày tuổi (lá mới có màu xanh non) và đƣợc hái từ sớm để hạn chế bào tử nấm bệnh bám trên lá. Trƣớc khi đƣa vào thí nghiệm các lá đƣợc rửa nhẹ nhàng bằng nƣớc cất để loại bụi bẩn và các vi sinh vật khác. Sau đó 45 phun thuốc thí nghiệm lên lá, chờ khô (60 phút), rồi mới tiến hành lây bệnh nhân tạo. Dung dịch bào tử đã đƣợc chuẩn bị sẵn và đem đi kiểm tra nồng độ bào tử trên kính hiển vi cho thấy có 1000 bào tử/ml dung dịch. Theo dõi cấp độ nhiễm bệnh ở các ngày 1, 3, 5, 7 sau khi lây bệnh. Kết quả tổng hợp đƣợc nêu trong bảng 4.5, bảng 4.6 và phụ lục 2. Kết quả cho thấy các nghiệm thức đều có TLB và CSB khá cao, mức độ ngày càng tăng theo thời gian. Có lẽ ở đây do lá cao su bị cắt rời khỏi cây nên tác dụng lƣu dẫn của thuốc không phát huy hết hiệu quả. Tuy nhiên, khi so sánh với nghiệm thức đối chứng thì vẫn thấy có hiệu quả khác biệt. Bảng 4.5. Chỉ số bệnh trung bình sau 1, 3, 5, 7 ngày lây bệnh trên lá cắt rời Thuốc Nồng Độ hoạt chất (ppm.ai) CSB (%) 1 ngày 3 ngày 5 ngày 7 ngày Cyproconazole 10 26,7 33,3 53,3 73,3 30 21,7 26,7 38,3 58,3 50 23,3 25,0 36,7 55,0 Difenoconazole 5 20,0 26,7 38,3 83,3 62,5 15,0 25,0 28,3 66,7 125 11,7 15,0 21,7 58,3 Flusilazole 10 21,7 36,7 53,3 76,7 20 25,0 33,3 45,0 73,3 40 23,3 26,7 33,3 53,3 Hexaconazole 4 28,3 30,0 55,0 91,7 8 21,7 25,0 33,3 73,3 20 18,3 21,7 23,3 55,0 Tebuconazole 50 28,3 36,7 58,3 83,3 100 11,7 16,7 30,0 70,0 150 16,7 16,7 26,7 43,3 Propiconazole 40 21,7 33,3 50,0 70,0 62,5 23,3 26,7 41,7 61,7 125 8,3 11,7 23,3 45,0 Đối chứng 0 35,0 45,0 73,3 100,0 46 Theo bảng 4.5 nhận thấy nghiệm thức đối chứng luôn có CSB cao nhất ở tất cả các ngày theo dõi. Các loại thuốc đều có CSB giảm dần khi nồng độ tăng lên. Điều này chứng tỏ các loại thuốc đã ảnh hƣởng tới mức độ nhiễm bệnh của nấm C. cassiicola trên lá cao su cắt rời. Bảng Anova ở các phụ bảng 2.1.1, phụ bảng 2.1.3, phụ bảng 2.1.4 đều cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức về CSB. Các nghiệm thức có nồng độ cao nhƣ Propiconazole nồng độ 125 ppm, Tebuconazole nồng độ 100 và 150 ppm, Hexaconazole nồng độ 20 ppm đều cho CSB thấp ở tất cả các ngày theo dõi và thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng (bảng phân hạng ở các phụ lục 2.1). Các thuốc Flusilazole nồng độ 40 ppm, Cyproconazole nồng độ 50 ppm ở những ngày đầu thì không khác biệt so với đối chứng, nhƣng đến ngày thứ 5 thì có hiệu quả khác biệt và đến ngày thứ 7 thì hiệu quả là rất cao (tƣơng đƣơng Tebuconazole nồng độ 150 ppm và Propiconazole nồng độ 125 ppm). Thuốc Difenoconazole nồng độ 125 ppm ở những ngày đầu có CSB thấp, nhƣng đến ngày thứ 7 thì CSB lại tăng nhanh (bảng 4.5) và cao hơn các thuốc khác. Điều này chứng tỏ thuốc Difenoconazole có thời gian bảo hộ ngắn. Theo dõi trên biểu đồ 4.2 thấy khi nồng độ thuốc tăng lên thì Hexaconazole có CSB giảm nhanh nhất, kế đến là Flusilazole và Cyproconazole, thuốc Difenoconazole có CSB giảm ít nhất. Điều này cũng phù hợp với kết quả của thí nghiệm in vitro ở trên cho thấy thuốc Difenoconazole có hiệu quả ức chế nấm không cao khi nồng độ tăng lên cao. 47 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 100,0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Nồng độ Ch ỉ s ố bệ nh Cyproconazole Difenoconazole Flusilazole Hexaconazole Tebuconazole Propiconazole Biểu đồ 4.1. Chỉ số bệnh trung bình sau 7 ngày lây bệnh trên lá cắt rời Khi đánh giá tỉ lệ nhiễm bệnh thì thấy TLB của các nghiệm thức là rất cao, đặc biệt nghiệm thức đối chứng cho TLB 100% ngay từ ngày đầu tiên sau khi lây bệnh (bảng 4.6). Điều này chứng tỏ phƣơng pháp lây bệnh bằng bào tử đƣợc thực hiện là có hiệu quả cao. TLB của ngày đầu tiên sau khi lây bệnh là có sự khác biệt ý nghĩa giữa các nghiệm thức (P = 0,0351), còn ở các ngày tiếp theo thì không có sự khác biệt (phụ lục 2.2). Ở ngày đầu tiên các thuốc Propiconazole nồng độ 125 ppm, Tebuconazole nồng độ 100 ppm, Difenoconazole nồng độ 125 ppm có TLB thấp nhất và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng. Đến ngày thứ 5 và thứ 7 thì hầu hết các nghiệm thức đều cho TLB 100% (bảng 4.6). 48 Bảng 4.6. Tỉ lệ bệnh trung bình sau 1, 3, 5, 7 ngày lây bệnh trên lá cắt rời Thuốc Nồng Độ hoạt chất (ppm.ai) TLB (%) 1 ngày 3 ngày 5 ngày 7 ngày Cyproconazole 10 100,0 100,0 100,0 100,0 30 91,7 100,0 100,0 100,0 50 91,7 91,7 100,0 100,0 Difenoconazole 5 75,0 83,3 100,0 100,0 62,5 75,0 100,0 100,0 100,0 125 58,3 66,7 83,3 100,0 Flusilazole 10 91,7 100,0 100,0 100,0 20 83,3 91,7 100,0 100,0 40 91,7 100,0 100,0 100,0 Hexaconazole 4 100,0 100,0 100,0 100,0 8 100,0 100,