Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học cao ethyl acetate lá cây me rừng phyllanthus emblica

......................... 17 Bảng 3.1. Dữ liệu phổ của hợp chất PEAT1 ........................................................................ 19 Bảng 3.2. Dữ liệu phổ của hợp chất PEAT2 ........................................................................ 21 Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1. Quy trình điều chế các loại cao ...................................................................... 15 Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Quả me rừng ................................................................................................... 2 Hình 3.1. Tương quan HMBC của PEAT1 ................................................................. 19 Hình 3.2. Tương quan HMBC của PEAT2 ................................................................. 20 Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Phụ lục 1. Phổ 1H-NMR của hợp chất PEAT1 Phụ lục 2. Phổ 13C-NMR của hợp chất PEAT1 Phụ lục 3. Phổ HSQC của hợp chất PEAT1 Phụ lục 4. Phổ HMBC của hợp chất PEAT1 Phụ lục 5. Phổ 1H-NMR của hợp chất PEAT2 Phụ lục 6. Phổ 13C-NMR của hợp chất PEAT2 Phụ lục 7. Phổ HSQC của hợp chất PEAT2 Phụ lục 8. Phổ HMBC của hợp chất PEAT2 NHẬN XÉT CỦA HỘI ĐỒNG .................................................................................................... .................................................................................................... .................................................................................................... .................................................................................................... .................................................................................................... .................................................................................................... .................................................................................................... .................................................................................................... .................................................................................................... .................................................................................................... .................................................................................................... .................................................................................................... .................................................................................................... .................................................................................................... .................................................................................................... .................................................................................................... .................................................................................................... Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo LỜI MỞ ĐẦU Ngày nay, bên cạnh sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kĩ thuật, chất lượng cuộc sống của con người cũng được nâng cao, vấn đề chăm sóc sức khỏe trở thành một mối quan tâm lớn trong các nghiên cứu khoa học. Các sản phẩm có nguồn gốc thảo mộc, vốn được dùng từ rất lâu trong những bài thuốc y học cổ truyền, được sử dụng ngày càng nhiều trong các loại thực phẩm chức năng. Vì vậy, việc nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của các chất có trong cây đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển y học. Kết quả thu được từ các nghiên cứu mở ra hướng phát triển mới trong việc tổng hợp các hợp chất có những hoạt tính quý, có tác dụng chữa bệnh. Hơn nữa, nghiên cứu về thành phần hóa học từ các loại thảo mộc còn góp phần củng cố bằng chứng khoa học cho nền y học cổ truyền. Cây Me rừng (Phyllanthus emblica L.) là một nguồn thảo dược quý, thuộc chi Phyllanthus, họ Euphorbiaceae. Me rừng có nhiều ứng dụng trong y học cổ truyền như chữa cảm mạo, phát sốt, đau cổ họng, viêm ruột, đau bụng đi ngoài, cao huyết áp [1]. Với mong muốn làm sáng tỏ kinh nghiệm sử dụng của dân gian và cũng vì các loài thuộc chi Phyllanthus có nhiều hoạt tính sinh học, nên chúng tôi chọn cây Phyllanthus emblica L. để nghiên cứu thành phần hóa học. 1 Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo Chương I TỔNG QUAN 1.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT Cây me rừng thuộc họ Thầu dầu Euphorbiaceae, có tên khoa học là Phyllanthus emblica Linn. Ngoài ra cây còn có một số tên khác như du cam tử, ngưu cam tử, dư cam tử [1]. Me rừng là cây nhỡ cao 3 m, phân nhiều cành nhỏ mềm, có lông, dài 20 cm. Hoa nhỏ, đơn tính cùng gốc. Cụm hoa thành xim co mọc ở nách lá phía dưới của cành, gồm rất nhiều hoa đực và vài hoa cái. Lá xếp thành hai dãy trên các cành nhỏ trông giống một lá kép lông chim, cuống lá rất ngắn. Lá kèm rất nhỏ hình ba cạnh. Quả hình cầu trước mọng, sau khô thành quả nang. Hạt hình ba cạnh, màu hồng nhạt. Cây ra hoa từ tháng 3 đến tháng 11 [1]. Hình 1.1. Quả me rừng Trên thế giới, cây me rừng phân bố chủ yếu ở những khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới của Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia và bán đảo Malaysia [1]. Ở nước ta, cây me rừng mọc phổ biến trên các đồi trọc, các bãi hoang, trong các rừng thưa. Cây ưa ánh sáng, chịu được khô hạn [1]. 2 Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo 1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH 1.2.1. Dược tính theo y học cổ truyền Ở Việt Nam: quả me rừng tính mát, có tác dụng nhuận phế, hóa đờm, sinh tân, thường dùng chữa cảm mạo, phát sốt, ho, đau cổ họng, miệng khô khát; rễ me rừng tính mát, có tác dụng thu liễm và giáng áp, dùng chữa viêm ruột, đau bụng đi ngoài, cao huyết áp; lá me rừng được dùng nấu nước rửa bên ngoài có tác dụng trị lở loét, mẩn ngứa [1]. Ở Ấn Độ: cây me rừng là một trong những loài thảo dược được sử dụng phổ biến ở Ấn Độ cổ xưa. Cây me rừng là nguồn giàu vitamin C, có tác dụng phục hồi chức năng gan, hạ men gan, tăng hấp thụ thức ăn, cân bằng lượng acid trong dạ dày, tăng cường phổi và hệ miễn dịch, kích thích nhuận tràng, hỗ trợ hệ tiết niệu, tốt cho da, mắt và tóc [3]. 1.2.2. Một số nghiên cứu về dược tính + Hoạt tính kháng khuẩn và kháng oxi hóa Theo các nghiên cứu vào năm 2007 của Xiaoli Liu cùng các cộng sự [13] và nghiên cứu vào năm 2010 của Wei Luo cùng các cộng sự [10], một số hợp chất phenol như 3-O-galloyl mucic acid 1,4-lactone (33), kaempferol 3-β-D-glucopyranoside (46), kaempferol (47), quercetin (48), isocorilagin (49), geraniin (50), isomallotusinin (59), chebulagic acid (60), chebulanin (61) được cô lập chủ yếu từ vỏ và quả me rừng có các tác dụng kháng khuẩn và kháng oxi hóa hiệu quả. + Hoạt tính kháng herpes simplex virus (HSV) loại 1 và loại 2 Năm 2011, Yangfei Xiang và các cộng sự [15] đã thử nghiệm khả năng kháng viêm nhiễm HSV-1 và HSV-2 của hợp chất 1,2,4,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucose (1246TGG) (62) được cô lập từ cây me rừng. Kết quả cho thấy 1246TGG ở nồng độ 31.70 µM có khả năng ức chế sự phát triển của virus Herpes và có thể được dùng trong điều trị HSV. + Tác dụng phục hồi chức năng gan và hạ men gan 3 Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo Dịch chiết ethanol của cây me rừng có tác dụng hạ men gan, phục hồi chức năng của tế bào gan với liều lượng 75 mg/kg/ngày khi thử nghiệm trên chuột [7]. + Tác dụng gây độc tế bào ung thư Năm 2011, Xiaoli Liu cùng với các cộng sự [14] đã tiến hành nghiên cứu khả năng gây độc tế bào ung thư của một số hợp chất phenol được cô lập từ quả me rừng. Kết quả cho thấy hai hợp chất isocorilagin (49) và geraniin (50) có khả năng gây độc tế bào ung thư vú (MCF-7) ở người với IC50 lần lượt là 13.2 và 80.9 µg/ml. Ngoài ra, isocorilagin (49) còn có tác dụng gây độc tế bào ung thư phổi (HELF) ở người với IC50 51,4 µg/ml. + Tác dụng phục hồi tổn thương tinh hoàn do tác dụng phụ của thuốc động kinh Valproic acid được sử dụng rộng rãi trong điều trị bệnh động kinh nhưng lại gây tác dụng phụ ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của nam giới. Theo nghiên cứu vào năm 2015 của Sitthichai Iamsaard và các cộng sự [8], dịch chiết từ cành me rừng có tác dụng cải thiện nồng độ tinh dịch của chuột đực đã được tiêm valproic acid. 1.3. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC Các nghiên cứu từ năm 1998 trở về trước cho thấy trong cây me rừng có các hợp chất: zeatin (1), zeatin nucleotide (2), zeatin riboside (3), chebulic acid (4), chebulinic acid (5), corilagin (6), 3,6-di-O-galloyl glucose (7), gallic acid (8), ethyl gallate (9), gluco-gallin (10), ellagic acid (11), gibberellin (A1, A3, A4, A7, A9) (12- 16), leucodelphinidin (17), rutin (18), β-sitosterol (19) [4]. Từ 1999-2001, Ying-Jun Zhang và các cộng sự đã nghiên cứu thành phần từ các bộ phận khác nhau của cây me rừng. Kết quả cho thấy nhóm tác giả đã cô lập và nhận danh các hợp chất sau: phyllaemblic acid (20), các phyllaemblicin A-C (21-23), sáu hợp chất phenolic mới là 2-O-galloyl L-malic acid(24), 2-O-galloyl mucic acid (25) và ba dẫn xuất methyl ester (26-28), 2-O-galloyl mucic acid 1,4-lactone (29) cùng dẫn xuất methyl ester (30), 5-O-galloyl mucic acid 1,4-lactone (31) cùng dẫn xuất methyl ester (32), 3-O-galloyl mucic acid 1,4-lactone (33), và 3,5-di-O-galloyl mucic acid 1,4-lactone (34), phyllaemblic acid B (35) và phyllaemblic C (36), phyllaemblicin D (37), cùng với hai hợp chất mới, 2-carboxylmethylphenol 1-O-β-D-glucopyranoside 4 Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo (38) và 2,6-dimethoxy-4-(2-hydroxyethyl)phenol 1-O-β-D-glucopyranoside (39), các phyllanemblinin A-F (40-45) [9,16,18-20]. Năm 2007, Xiaoli Lin cùng các cộng sự đã cô lập được 5 hợp chất từ cây me rừng, bao gồm: kaempferol 3-β-D-glucopyranoside (46), kaempferol (47), quercetin (48), isocorilagin (49) và geraniin (50). Cũng vào năm này, hợp chất mới phyllanthunin (51) cũng đã được cô lập cùng với các hợp chất đã biết: daucosterol (52), stearic acid (53), lauric acid (54), cinnamic acid (55) [2][13] Năm 2008, S. K. EL-DESOUKY và cộng sự đã cô lập được hợp chất mới là acylated apigenin glucoside (apigenin-7-O-(6”-butyryl-β-glucopyranoside)) (56) và các hợp chất khác như 1,2,3,4,6-penta-O-galloyglucose (57). Xiaoli Liu và các cộng sự đã cô lập thêm quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside (58) [5,12]. Từ vỏ quả me rừng, năm 2011, Wei Lou và các cộng sự đã cô lập được isomallotusinin (59), chebulagic acid (60), chebulanin (61) [9] Hợp chất 1,2,4,6-tetra-O- galloyl-β-D-glucose (62) đã được cô lập từ lá và cành của cây me rừng bởi Yangfei Xiang và các cộng sự vào năm 2011 [15]. Năm 2012, Wei-Yan Qi và cộng sự đã cô lập được β-sitosterol (19), daucosterol (52), cùng 12 hợp chất sterol khác (63-74), trong đó có 2 hợp chất sterol mới là 5α,6β,7α-trihydroxysitosterol (64) và 7α-acetoxysitosterol (65) từ cành và lá của cây me rừng [11]. Các công thức cấu tạo một số hợp chất trong cây Phyllanthus emblica L. HO NH N NH NN (1) NH N NN N O OHOH (2) OP O HO OH OH OH N H NN N N O OH HO OH (3) 5 Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo O O HO HO OH COOH COOH HOOC (4) OR O O O OR O OO HO OHOOC OH OH R=Galloyl (5) RO R=Galloyl (6) O OH OR HO O O HO HO OH O OH OH HO O OHHORO OH RO R=Galloyl (7) O OR HO OH OH (8) R=H (9) R=C2H5 O OR OH OH HO HO R=Galloyl (10) O O O O OHHO HO OH (11) R2 H H R1 O OHO (12) R1=R2=OH (14) R1=H, R2=OH (16) R1=R2=H HO H H R O OHO (13) R=OH (15) R=H O O O OH HO OH OH OH OH OH (17) O OH HO O OR OH R=Rha-glu (18) OH HO H H H H H (19) OO O O O HO OH OH O (20) 6 Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo OO O O O HO OH O OO OH OH HO HO (21) OO O O O HO OH O OO OH O HO HO OHO HO OH (22) HO OO O O O HO OH O OO OH O HO HO OHO HO O HO O OH OH HO (23) COOH HOOC HRO R1OOC COOR2 H OR OH H OH H H OH R=Galloyl (24) R=Galloyl (25) R1=R2=H (26) R1=R2=CH3 (27) R1=H, R2=CH3 (28) R1=CH3, R2=H OO R1O OR2 H H OR3 OR4 O (29) R1=Galloyl, R2=R3=R4=H (30) R1=Galloyl, R2=R3=H, R4=CH3 (33) R1=R3=R4=H, R2=G (34) R1=R4=H, R2=R3=G O O OHHO H RO H R1O O R=Galloyl (31) R1=H (32) R1=CH3 7 Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo O O OH OR2 OH OH HH R1 HOOC (35) R1=OH, R2=H (36) R1=R2=H (37) R1=H, R2=Glu COOH OR R=Glu (38) OO OR HO R=Glu (39) OHO HO OH OH O O O O O OH OR HO R=Galloyl (40) OO O O HO HO O H HO OH OH O HO HO R=Galloyl (41) OG OHHO HO HO OH OH OO O O O O O OR OO O HOOC HO H COOH OH OH R=Galloyl (42) O R2O R3O OH OR4 OR1 (43) R1=G, R2=neoche, R3=R4=H (44) R1=G, R3=neoche, R2=R4=H (45) R1=G, R4= neoche, R2=R3=H 8 Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo O O O HO OH O OH HO OHHO (46) O OH O OH HO OH (47) R=H (48) R=OH ROH R=Galloyl (49) HO HO HO O O HO HO HO O ORO HO O OH R=Galloyl (50) OHHO HO HO OH OH OO O O O O O OR OO O H OH OH O HO OHOH O OR OH OH OO O OH OHO O O OH OO HO HO HO OH R=Galloyl (51) 9 Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo O H H H (52) O OH OH HO HO OH O (55) R COOH (53) R=n-C17H35 (54) R=n-C11H23 O OH OOH OO OH O O HO HO (56) O OR OR OR RO RO R=Galloyl (57) O O OH OH OH HO O O HO OH HO OH (58) OHHO HO HO OH OH OO O O O O O OR OO O OH OHHO HO R=Galloyl (59) OHHO HO HO OH OH OO O O O O O OR O OO HO OHOOC OH OH R=Galloyl (60) 10 Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo R=Galloyl (61) OH O O O OR O OO HO OHOOC OH OH HO O OR ORHO RO RO R=Galloyl (62) H R OH OH HO (63) R=H (64) R=OH H R2HO (65) R1=H, R2=CH3COO (66) R1=H, R2=OH (67) R1=CH3CH2O, R2=H (68) R1=R2=O R1 H (69) R1=R2=H (70) R1=R2=O (71) R1=H, R2=OH O R2R1 H HO OH (72) 11 Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo H O R1 O OH HO HO R2 (73) R1=H, R2=CH3-(CH2)14COO (74) R1=OH, R2=CH3-(CH2)14COO Chú thích: HO OH OH O G=Galloyl O HO OH OH O HOOC H H HOOC H O neoche O Ac=Acetyl O OH OH HO HO Glu=Glucopyranosyl O HO OH OH O HO OH HO O Rha-Glu=α-L-rhamnopyranosyl (1→6) -O-β-D-glucopyranosyl 12 Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo CHƯƠNG II THỰC NGHIỆM 2.1. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ, PHƯƠNG PHÁP 2.1.1. Hoá chất  Silica gel, 0.04-0.06 mm, Merck và silica gel, 0.04-0.06 mm, Himedia dùng cho cột sắc kí.  Silica gel pha đảo, RP-18, Merck dùng cho cột sắc kí.  Sắc ký lớp mỏng loại 25DC – Alufolein 20×20, Kiesel gel 60F 254 , Merck.  Sắc ký lớp mỏng loại 25DC, RP-18, Merck.  Dung môi dùng cho quá trình thí nghiệm gồm: hexane, dichloromethane, chloroform, ethyl acetate, acetone, methanol, acetic acid.  Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên lớp mỏng: sử dụng H2SO4 20%. 2.1.2. Thiết bị  Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu.  Các cột sắc ký.  Máy cô quay chân không.  Bếp cách thuỷ.  Đèn soi UV: bước sóng 254 nm.  Cân điện tử Sartorius Mass 620g. 2.1.3. Phương pháp tiến hành 2.1.3.1. Phương pháp phân lập các hợp chất Sắc kí cột silica gel pha thường, pha đảo RP-18 và sắc kí lớp mỏng. Hiện hình sắc ký lớp mỏng bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 20%. 2.1.3.2. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz), 2D- NMR được ghi trên máy Bruker Avance tại Phòng thí nghiệm phân tích trung tâm, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, 227 Nguyễn Văn Cừ, Q5, Tp.HCM. 13 Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo 2.2. NGUYÊN LIỆU 2.2.1. Thu hái nguyên liệu Mẫu cây dùng trong nghiên cứu khoá luận là lá của cây me rừng được thu hái tại Bình Thuận vào tháng 05/2014. Mẫu cây đã được TS. Phạm Văn Ngọt nhận danh tên khoa học là Phyllanthus emblica Linn, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae). 2.2.2. Xử lý mẫu nguyên liệu Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, phơi khô trong bóng râm, rồi xay thành bột mịn. Sau đó tiến hành ngâm chiết và phân lập các hợp chất. 2.3. ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO Lá me rừng được phơi khô và nghiền thành bột mịn, sấy khô đến khối lượng không đổi (7.2 kg). Nguyên liệu bột mịn được tận trích với ethanol 960 bằng phương pháp ngâm dầm, lọc và cô quay loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cao ethanol thô (285.5 g). Cao ethanol thô được chiết lỏng – lỏng lần lượt với hexane, ethyl acetate thu được cao hexane lá me (22.1 g), cao ethyl acetate lá me (143.1 g) và phần cao còn lại (77.1 g). Quá trình thực hiện được tóm tắt theo sơ đồ 2.1. 14 Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo Sơ đồ 2.1. Qui trình điều chế các loại cao Bột lá me rừng (7.2 kg) - Ngâm trong ethanol 96 o - Lọc Bã khô Dịch ethanol - Cô quay thu hồi dung môi Ethanol thu hồi Cao tổng ( 285.5 g) - Chiết lỏng – lỏng với hexane, ethyl acetate - Cô quay thu hồi dung môi Cao hexane lá me (22.1 g) Cao ethyl acetate lá me (143.1 g) Cao còn lại ( 77.1 g) 15 Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo 2.4. CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO ETHYL ACETATE Cao ethyl acetate (143.1 g) được sắc kí cột silica gel với hệ dung môi hexane: ethyl acetate (80-100% ethyl acetate), ethyl acetate : methanol (5-100% methanol). Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ. Theo dõi quá trình giải ly bằng sắc kí lớp mỏng. Những lọ cho kết quả sắc kí lớp mỏng giống nhau được gộp chung thành 1 phân đoạn. Kết quả thu được 5 phân đoạn (EA1-EA5), được trình bày trong bảng 2.1. Bảng 2.1. Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate lá me rừng Phân đoạn Dung môi giải ly Trọng lượng (g) Sắc kí lớp mỏng Ghi chú EA1 H:EA 2:8 16.50 Vệt dài Khảo sát EA2 EA 13.28 Nhiều vết Chưa khảo sát EA3 EA:Me 95:5 22.25 Nhiều vết kéo vệt Đã khảo sát EA4 EA:Me 8:2 33.40 Nhiều vết Đã khảo sát EA5 EA:Me 7:3 14.70 Nhiều vết Chưa khảo sát Chú thích: H: hexane; EA: ethyl acetate; Me: methanol Phân đoạn EA1 được sắc kí cột silica gel thu được 10 phân đoạn (EA1.1- EA1.10), trong đó phân đoạn EA1.9 cho kết quả sắc kí lớp mỏng có sự tách vết rõ ràng. Quá trình thực hiện được trình bày trong bảng 2.2. Bảng 2.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA1 (16.50 g) của bảng 2.1 Phân đoạn Dung môi giải ly Trọng lượng (g) Sắc kí lớp mỏng Ghi chú EA1.1 C 0,39 Nhiều vết Chưa khảo sát EA1.2 C 0,32 Nhiều vết Chưa hảo sát EA1.3 C 0,31 Nhiều vết Chưa khảo sát EA1.4 C : Me 9 : 1 0,38 Vệt dài Chưa khảo sát EA1.5 C : Me 9 : 1 0,32 Vệt dài Chưa khảo sát EA1.6 C : Me 9 : 1 0,22 Vệt dài Chưa khảo sát EA1.7 C : Me 85 : 15 0,24 Vệt dài Chưa khảo sát EA1.8 C : Me 85 : 15 0,31 Vệt dài Chưa khảo sát EA1.9 C : Me 8 : 2 9.73 Vết rõ ràng Khảo sát EA1.10 C : Me 8 : 2 0.83 Nhiều vết Chưa khảo sát Chú thích: C: Chloroform 16 Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo Tiếp tục sắc kí cột pha thường phân đoạn EA1.9, thu được 7 phân đoạn (EA1.9.1-EA1.9.7), trong đó phân đoạn EA1.9.2 và EA1.9.3 có sự tách vết rõ ràng. Sắc kí cột silica gel, 0,04-0,06 mm, Merck nhiều lần kết hợp với sắc kí cột silica gel pha đảo RP-18 trên phân đoạn EA1.9.2 và EA1.9.3 với hệ dung môi hexane : acetone 1 : 4. Dịch giải li qua cột hứng vào các hũ bi. Theo dõi quá trình giải li bằng sắc kí lớp mỏng.thu được 2 hợp chất, kí hiệu PEAT1 và PEAT2. Quá trình thực hiện được trình bày trong bảng 2.3. Bảng 2.3. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA1.9 (9.73 g) của bảng 2.2 Phân đoạn Dung môi giải ly Trọng lượng (g) Sắc kí lớp mỏng Ghi chú EA1.9.1 DCM:Me 95:5 0,41 Vết mờ Chưa khảo sát EA1.9.2 DCM:Me 95:5 0,65 Nhiều vết Khảo sát thu được PEAT1 EA1.9.3 DCM:Me 95:5 0,54 Nhiều vết Khảo sát thu được PEAT2 EA1.9.4 DCM:Me 9:1 1.57 Nhiều vết Chưa khảo sát EA1.9.5 DCM:Me 9:1 1.51 Vết rõ ràng Chưa khảo sát EA1.9.6 DCM:Me 9:1 0,40 Vết rõ ràng Đã khảo sát EA1.9.7 DCM:Me 9:1 1.62 Nhiều vết Chưa khảo sát Chú thích: DCM: dichloromethane Hợp chất PEAT1 (18 mg) cho sắc kí lớp mỏng (hexane : acetone 2:1), màu nâu nhạt khi hiện hình bằng thuốc thử H2SO4 20% (Rf = 0.38). Hợp chất PEAT2 (5 mg) cho sắc kí lớp mỏng (hexane : acetone 2:1), màu vàng khi hiện hình bằng thuốc thử H2SO4 20%, (Rf = 0.42). 17 Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT PEAT1 Hợp chất PEAT1 thu được sau quá trình sắc kí cột nhiều lần phân đoạn EA1.9.2 của bảng 3 có những đặc điểm sau: • Hợp chất ở dạng bột màu trắng. • Sắc kí lớp mỏng với hệ môi hexane : acetone 2 : 1, hiện hình bằng thuốc thử H2SO4 20%, nung nóng bảng mỏng thu được 1 vết tròn màu nâu nhạt, Rf = 0.38. • Phổ 1H-NMR (acetone – d6, phụ lục 1), δH ppm: 7.11 (2H, s, H-2 và H-6), 3.78 (3H, s, -OCH3). • Phổ 13C-NMR (acetone – d6, phụ lục 2), δC ppm: 166.8 (-COOH), 145.6 (C-3 và C-5), 138.3 (C-4), 121.3 (C-1), 109.3 (C-2 và C-6), 51.5 (-CH3). Biện luận cấu trúc: Phổ 1H-NMR của hợp chất PEAT1 cho tín hiệu cộng hưởng của hai proton vòng thơm ở δH 7.11 (2H, s) và tín hiệu cộng hưởng của proton nhóm methoxy – OCH3 ở δH 3.78 (3H, s). Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ HSQC cho thấy hợp chất có 8 carbon. Trong đó có 1 carbon >C=O cộng hưởng ở δC 166.8. Phổ đồ còn thể hiện tín hiệu cộng hưởng của 6 carbon vòng thơm ở δC 145.6 , 138.3, 121.3, 109.3. Ngoài ra, trên phổ còn xuất hiện tín hiệu của carbon nhóm methoxy cộng hưởng ở δC 51,5 (-OCH3). Phổ HMBC cho thấy tương quan giữa 2 proton ở δH 7.11 (H-2, H-6) với các carbon ở δC 166.8 (>C=O), 145.6, 138.3, 121.3. Bên cạnh đó, trên phổ còn ghi nhận tương quan của proton nhóm methoxy ở δH 3.78 (-CH3) với carbon ở δC 166,8 (>C=O), cho phép dự đoán nhóm –OCH3 gắn vào >C=O. Từ những dữ liệu phổ NMR kết hợp so sánh với số liệu NMR của methyl gallate [6] cho thấy có sự tương đồng nên cấu trúc của PEAT1 được đề nghị là methyl gallate 18 Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo COOCH3 OH OH HO 1 2 3 4 5 6 COOCH3 OH OH HO Methyl gallate Hình 3.1. Một số tương quan HMBC của PEAT1 (PEAT1) Bảng 3.1. Dữ liệu phổ của hợp chất PEAT1 3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT PEAT2 Hợp chất PEAT2 thu được từ phân đoạn EA1.9.3 của bảng 3 có những đặc điểm sau: • Hợp chất ở dạng bột màu vàng. • Kết quả sắc kí lớp mỏng với hệ môi hexane : acetone 2 : 1, hiện hình bằng thuốc thử H2SO4 20%, nung nóng bảng mỏng thu được 1 vết tròn màu vàng, Rf = 0.42. • Phổ 1H-NMR (acetone - d6, phụ lục 5), δH ppm: 8.16 (2H, d, J=9.0 Hz, H-2’ và H-6’), 7.02 (2H, d, J=8.5 Hz, H-3’ và H-5’), 6.54 (1H, d, J=2.0 Hz, H-8), 6.27 (1H, d, J=2.0 Hz, H-6). • Phổ 13C-NMR (acetone - d6, phụ lục 6), δC ppm: 176.8 (>C=O). Độ dịch chuyển của các carbon khác được trình bày trong bảng 3.2. Vị trí Cacbon Hợp chất PEAT1 (acetone - d6) Methyl gallate (CDCl3) [6] δH ppm δC ppm δC ppm 1 2,6 3,5 4 >C=O -OCH3 - 7.11 (s) - - - 3.78 (s) 121.3 109.3 145.6 138.3 166.8 51.5 118.8 107.9 144.1 137.0 165.6 50.4 19 Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo Biện luận cấu trúc Phổ 1H-NMR của hợp chất PEAT2 cho tín hiệu cộng hưởng của sáu proton vòng thơm trong vùng δH 8.16 – 6.27. Trong đó, hai proton ghép cặp ortho cộng hưởng ở δH 8,16 (2H, d, J=9.0 Hz), hai proton khác cũng ghép cặp ortho cộng hưởng ở δH 7.02 (2H, d, J=8.5 Hz). Ngoài ra trên phổ còn có tín hiệu cộng hưởng của hai proton ghép cặp meta ở δH 6.54 (1H, d, J=2.0 Hz) và 6.27 (1H, d, J=2.0 Hz). Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ HSQC cho thấy hợp chất có 15 carbon cộng hưởng trong vùng δC 176.8 – 94.7, trong đó có một carbon >C=O cộng hưởng ở δC 176.8 cho phép dự đoán PEAT2 là flavonol. Phổ HMBC cho thấy sự tương quan giữa 2 proton cộng hưởng ở δH 8.16 (H-2’ và H-6’) với các carbon ở δC 160.4, 147.2. Hai proton cộng hưởng ở δH 7.02 (H-3’ và H-5’) tương quan HMBC với các carbon ở δC 160.4, 123.5. Như vậy vòng B của cấu trúc của PEAT2 có 1 nhóm –OH ở vị trí 4’. Mũi cộng hưởng của –OH kiềm nối cộng hưởng ở δH 12,17 giúp xác định vị trí C-5 mang nhóm thế -OH. Phổ đồ còn ghi nhận tương quan giữa proton cộng hưởng ở δH 6.54 (1H, d, J=2.0 Hz, H-8) với các carbon ở δC 162.3, 158.0, 99.3; tương quan giữa proton cộng hưởng ở δH 6.27 (1H, d, J=2.0 Hz, H-6) với carbon ở δC 162.3. Từ những dữ liệu phổ NMR trên kết hợp so sánh với dữ liệu phổ của kaempferol [21] cho thấy có sự tương đồng nên cấu trúc của hợp chất PEAT2 được đề nghị là kaempferol OH OOH HO O OH 1 2 3 45 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' OH OOH HO O OH Kaempferol Hình 3.2. Một số tương quan HMBC của PEAT2 (PEAT2) 20 Khóa luận tốt nghiệp Huỳnh Nguyễn Thanh Thảo