Khóa luận Nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bông vải SSR60F và Coker 312 bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

n chuyển nạp gen và tái sinh. Ngoài ra, pH môi trƣờng nuôi cấy cũng ảnh hƣởng đáng kể đến hiệu quả chuyển nạp gen. Sự chuyển nạp gen cũng phụ thuộc vào kiểu gen. Chỉ có một số giống nhất định mới có khả năng tái sinh và chuyển nạp gen nhƣ bông Luồi Coker 312 và Jin 7, còn hầu hết các giống khác thƣờng khó có thể tái sinh và chuyển nạp đƣợc. Sự thiếu một phƣơng pháp tái sinh cây hiệu quả đã đƣợc xem nhƣ là một rào cản chính cho việc áp dụng phƣơng pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens ở bông vải (Firoobady và ctv., 1987). Để cải tiến phƣơng pháp chuyển nạp, một quy trình chuyển gen hiệu quả cao dùng cuống lá và trụ hạ diệp cây mầm làm mẫu cấy phải đƣợc phát triển, cùng với môi trƣờng cải tiến thích hợp. Hiện nay, Trung Quốc thành công trong việc chuyển nạp gen vào cây bông vải bằng phƣơng pháp tiêm DNA qua ống phấn, nhƣng phƣơng pháp này gặp khó khăn trong việc xác định cây chuyển gen vì rất nhiều cây đƣợc tạo thành nhƣng chỉ một số ít cây đƣợc chuyển nạp gen (Chen và ctv., 2000). 2.3. Chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Chuyển nạp gen là kỹ thuật chuyển gen ngoại lai vào bộ gen sinh vật đang nghiên cứu. Những thành tựu của kỹ thuật nuôi cấy mô và kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã mở ra triển vọng đối với chuyển nạp gen ở thực vật bậc cao, tạo ra các cây trồng mang những tính trạng di truyền mong muốn. Chuyển nạp gen thành công trên cây trồng đã đƣợc ghi nhận bằng cách sử dụng vectơ plasmid Ti, thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để đƣa gen mong muốn vào trong bộ gen cây trồng. Phƣơng pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để chuyển nạp gen còn đƣợc gọi là phƣơng pháp chuyển nạp gen gián tiếp (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000). 23 2.3.1. Đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Chi Agrobacterium đƣợc chia làm một số loài dựa trên triệu chứng gây bệnh và kí chủ. Một số loài thuộc chi Agrobacterium nhƣ: A. radiobacter (loài này không gây bệnh cho cây), A. tumefaciens và A. rhizogens gây bệnh khối u và bệnh cổ rễ, A. rubi gây bệnh khối u trên cây mía. Gần đây nhất một loài mới vừa đƣợc đề nghị là A. vitis, loài này gây bệnh khối u trên cây nho và một số loài cây khác (Ophel và Kerr, 1990). Hình 2.1. Một số khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra. A: một khối u lớn trên thân cây hoa Hồng, B: các khối u trên cành Nho (Deacon và ctv., 2005). Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hình que, gram âm, có khả năng di động, không sinh bào tử và có quan hệ gần gũi với vi khuẩn cố định đạm Rhizobium. (Deacon và ctv., 2005). Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hiếu khí, có 5-11 lông roi. Vi khuẩn này phát triển tối ƣu ở nhiệt độ 290C trong môi trƣờng có bổ sung một chút mangan và succinate nhƣ là nguồn cacbon duy nhất. Agrobacterium tumefaciens là tác nhân gây bệnh cho cây bằng cách tạo khối u trên cây hai lá mầm do nó có khả năng chuyển DNA vào tế bào cây (Hansen và Chilton, 1999, Gelvin, 2000). Khi rễ cây xuất hiện vết thƣơng, tế bào vi khuẩn sẽ di chuyển về phía vết thƣơng và xâm nhập vào cây qua vết thƣơng đó. Vi khuẩn độc mang một hoặc nhiều plasmid, một trong số đó có mang gen tạo khối u và đƣợc biết đến với tên gọi là pTi. Plasmid Ti cũng mang các gen để xác định kí chủ và triệu chứng khi nhiễm vào cây. Những vi khuẩn không mang pTi đƣợc xem nhƣ là vi khuẩn không độc và không có khả năng gây bệnh khối u cho cây. Khối u đầu tiên xuất hiện nhỏ mầu trắng, ban đầu đƣợc tìm thấy ở gốc cây. Các khối u lớn dần và xuất hiện các vết lốm đốm nâu đen do các tế bào ngoại biên chết đi (hình 2.1 và 2.2). Các khối u có thể mềm và xốp, có thể bị vỡ vụn 24 khi chạm vào, nhƣng cũng có thể cứng và xuất hiện các u nhỏ hoặc nhiều mấu. Các khối u có đƣờng kính đến 30 cm nhƣng phổ biến là 5-10 cm. Cây bị nhiễm vi khuẩn sẽ trở nên còi cọc, lá úa vàng và rất nhạy cảm với các điều kiện môi trƣờng. Khi xâm nhiễm vào cây, một phần gen trên pTi sẽ gắn vào nhiễm sắc thể của cây làm cho các tế bào phát triển mạnh và sản xuất ra một chất đặc biệt gọi là Opine. Vi khuẩn sẽ sử dụng chất này nhƣ một nguồn cacbon cho các hoạt động biến dƣỡng(Zhu và ctv., 2000). Hình 2.2. Một khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra (nguồn Bộ nhiễm sắc thể vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dạng vòng có kích thƣớc là 2,6 Mb. Ngoài ra vi khuẩn còn mang plasmid lớn có kích thƣớc 200-800 kbp (Gelvin, 2003), chính plamid này là nguyên nhân gây ra khối u trên cây khi vi khuẩn này xâm nhập. Plasmid này có tên gọi là plasmid Ti , hầu hết các gen gây khối u đều nằm trên plasmid này (Deacon và ctv., 2005). 2.3.2. Plamid Ti Plasmid Ti là một DNA vòng tách rời với nhiễm sắc thể và có khả năng nhân lên một cách độc lập trong tế bào vi khuẩn. Việc xác định pTi nhƣ một nguyên lý tạo bƣớu TIP (tumor inducing principle) đã đánh dấu bƣớc khởi động của một giai đoạn mới trong nghiên cứu về Agrobacterium tumefaciens. Điều này đã mở ra khả năng nghiên cứu cấu trúc và chức năng của plasmid bằng kỹ thuật di truyền phân tử (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000). 25 Plasmid Ti có cấu trúc bao gồm: đoạn T-DNA-trình tự mã hoá đƣợc chuyển vào trong cây, vùng vir-vùng trực tiếp tham gia tạo T-DNA sợi đơn và chuyển T-DNA này vào tế bào cây, vùng rep-cần cho sự tái bản của pTi, vị trí tra và trb- tham gia vào quá trình chuyển tiếp hợp của pTi, các gen cần cho việc hấp thu và chuyển hoá các opine (Zhu và ctv., 2000). Trong cấu trúc của pTi, hai yếu tố quan trọng cần cho sự chuyển gen vào cây là đoạn T- DNA bao gồm cả trình tự 25 bp ở hai cánh của đoạn T- DNA và gen Vir (Gelvin, 2003). 2.3.2.1. Chức năng của T-DNA T-DNA đã đƣợc nghiên cứu rất kỹ. Đó là một đoạn DNA có kích thƣớc 10-30 kbp (Gelvin, 2003), trong đó có chứa gen mã hoá cho việc tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u. Trong pTi, vị trí của T-DNA đƣợc giới hạn bởi bờ phải và bờ trái. Trình tự nucleotid của bờ phải và bờ trái tƣơng tự nhau và đều có kích thƣớc 25 bp (Gelvin, 2003). Tuy nhiên, bờ trái của T-DNA có thể đƣợc bỏ qua trong chuyển nạp T-DNA, trong khi đó bờ phải lại cần thiết và đƣợc đề nghị rằng tiến trình chuyển nạp diễn ra với bờ phải trƣớc rồi tiến dần về phía trái. Việc đảo ngƣợc bờ phải sẽ làm yếu đi khả năng tạo khối u (Miranda và ctv., 1992, Gelvin, 2003). Các trình tự bờ không chỉ là mục tiêu của của VirD1/VirD2 endonuclease mà còn là vị trí gắn của protein VirD2. T-DNA mã hóa một vài protein, protein này biểu hiện trong tế bào cây đƣợc chuyển gen làm kiểu hình cây thay đổi lớn. Các gen trên T-DNA có thể biểu hiện trong tế bào cây bằng cách mô phỏng các gen của cơ thể đa bào. Theo Binns và Costantino (1998), T-DNA mã hóa cho 13 protein và những vùng không sao mã của các gen đƣợc chuyển mang nhiều đặc điểm của các gen trong cây bao gồm kiểu hộp TATA (TATA box) và hộp CAAT (CAAT box), yếu tố tăng cƣờng sao mã, các vị trí gắn đuôi poly A của cơ thể đa bào. Một nhóm các gen của T-DNA điều khiển tổng hợp các hormon sinh trƣởng của cây, những hormon này làm các tế bào tăng sinh và làm thay đổi hình dạng bên ngoài. Sản phẩm của gen iaaM và gen iaaH điều khiển sự chuyển hoá tryptophan thông qua indolacetamin thành indolacetic axit (auxin). Sản phẩm của gen ipt giúp gắn kết isopentenyl pyrophosphat với AMP (Binns và Costantino, 1998) và các enzyme trong cây đƣợc cho là chuyển hoá isopentenyl-AMP thành cytokinin zeatin bằng cách loại bỏ nhóm phosphoribosyl và loại bỏ phân tử 26 hydro của một nhóm methyl của isopentenyl. Hai gen trên T-DNA khác đƣợc cho là có chức năng trong tạo khối u là 5 và tml (cũng còn gọi là 6b). Sản phẩm của gen 5 điều khiển sinh tổng hợp indole-3-lactate, đó là một chất đồng đẳng với auxin (Korber và ctv., 1991). Trong khi đó gen tml (cũng còn gọi là 6b) làm tăng mức độ nhạy cảm của các tế bào cây với phytohormon bằng một cơ chế chƣa đƣợc giải thích (Tinland và ctv., 1992). Gen tml có thể kích thích tạo các khối u ngay cả khi vắng mặt các gen gây khối u khác. Một nhóm gen đƣợc chuyển thứ hai điều khiển sản xuất nguồn dinh dƣỡng cho vi khuẩn, đó là các opine. Đây là một dạng kết hợp giữa một amino axit với một ceto (keto) axit hoặc một đƣờng (Dessaux và ctv., 1998). Các tế bào chuyển gen tổng hợp và tiết ra một số lƣợng lớn các opine. Các opine này hấp dẫn vi khuẩn mang kiểu gen tiêu biểu (bên ngoài vùng T-DNA và thƣờng trên plasmid độc) cần cho việc phân giải các opine đƣợc tổng hợp từ khối u (Ziemienowicz, 2001, trích từ Petit và Tempé, 1985). Dựa trên các kiểu opine đƣợc tạo ra từ các khối u mà phân chia nhóm vi khuẩn Agrobacterium thành các chủng nhƣ là: octopine, nopaline, succinamopine và leucinopine. Hiện có ít nhất là 20 loại opine khác nhau, mỗi chủng tạo ra và phân giải một nhóm opine chuyên biệt. Cho ví dụ, các plasmid Ti kiểu octopine điều khiển tổng hợp ít nhất 8 opine. Gen ocs mã hóa cho octopine synthase, enzym này gắn pyruvate với arginine, lysine, histidine hoặc ornithine để tạo ra octopine, lysopine, histopine hoặc octopinic axit và tất cả những opine này đều đƣợc tìm thấy trong các khối u (Dessaux và ctv., 1998). Sản phẩm của gen mas2’ đƣợc cho là làm kết nối glutamine hoặc glutamic axit với glucose (mặc dù điều này chƣa đƣợc chứng minh bằng thực nghiệm), trong khi đó sản phẩm của mas1’ lại làm giảm bớt các dạng trung gian mannopine và mannopinic axit. Sản phẩm của gen ags sẽ làm lacto hóa mannopine thành agropine. Mannopine và agropine cũng có thể lactate hóa thành agropinic axit (Dessaux và ctv., 1998). Bởi vậy, các khối u đƣợc tạo ra bởi plasmid Ti kiểu octopine có thể tạo 4 loại octopine và 4 kiểu thuộc nhóm mannityl opine. 27 2.3.2.2. Chức năng của gen Vir Vùng Vir trên plasmid Ti có khoảng 25 gen đƣợc nhận biết trong 7 đơn vị phiên mã là: virA, virB, virC, virD, virE, virG, virF và vùng này có kích thƣớc khoảng 30- 40 kbp (de la Riva và ctv., 1998). Theo Stachel và ctv. (1987) vùng này có 20 gen nằm trên 6 operon, các gen đó là: virA, virB, virC, virD, virE và virG. Những gen vir này mã hoá cho các vai trò nhƣ: nhận ra tế bào thực vật, tấn công vào tế bào thực vật, tạo đoạn T-DNA sợi đơn, chuyển nạp đoạn T-DNA và có lẽ có cả vai trò trong sự xâm nhập của T-DNA vào tế bào kí chủ (Gelvin, 2003). Các gen vir có vai trò trong việc nhận diện ra vết thƣơng của cây thông qua dấu hiệu hoá học tiết từ vết thƣơng. Các tín hiệu hoá học từ vết thƣơng ở tế bào cây chủ tạo ra đƣợc nhận biết trƣớc tiên bởi protein VirA, rồi đến protein VirG để làm kích hoạt các gen độc khác ở vùng vir, tạo ra các protein cần thiết. Gen vir đƣợc kích hoạt tối đa ở pH axit với sự hiện diện của các hợp chất phenon nhƣ là acetosyringone (AS), chất mà đƣợc giải phóng khi tế bào cây bị tổn thƣơng (Stachel và ctv., 1987). Hệ thống điều hoà gen vir hoạt động thông qua hai gen độc: virA và virG. Biểu hiện cơ bản của gen virA tổng hợp nên protein nằm trong màng tế bào. Protein VirA đáp ứng với sự trao đổi chất của vết thƣơng của cây và có thể đáp ứng nhạy cảm với sự thay đổi của môi trƣờng. Với một nồng độ AS thích hợp VirA có thể đƣợc kích thích bởi đƣờng, các opine khối u hoặc amino axit (Ziemienowicz, 2001). Protein VirA sẽ tự phosphoryl hoá. Sự tự phosphoryl hoá này sẽ làm protein nội bào VirG đƣợc phosphoryl hoá bởi aspartic axit còn lại sau khi VirA tự phosphoryl hoá (Jin và ctv., 1990) và kích hoạt sao mã cho tất cả các gen vir. Các promoter của gen vir có kích thƣớc khoảng 12 bp trong trình tự “vir box” (Winans và ctv., 1987). Sự phosphoryl hoá làm cho protein VirG gắn kết vào “vir boxes” và kích hoạt sự sao mã của các gen virBCDEFGH (Ziemienowicz, 2001). Các gen vir có vai trò trong việc tạo sợi đơn T-DNA trong vi khuẩn (hình 2.3) và đƣa sợi đơn T-DNA vào trong tế bào cây. Các protein đƣợc mã hoá bởi gen virD và virE thực hiện chức năng tạo ra phức hợp T-DNA. Protein VirD2 là một endonuclease, protein này sẽ cắt T-DNA tại vị trí nucleotide thứ 3 và thứ 4 trên trình tự bờ vai 25 bp để tạo ra phân tử sợi đơn T-DNA và liên kết đồng hoá trị với đầu 5’ của sợi đơn T- DNA. Protein VirD2 đƣợc tinh sạch từ oligonucleotide sợi đơn mang các trình tự bờ ở vị trí tƣơng đồng (Deng và ctv., 1998). Protein VirE2 là một protein gắn trên sợi đơn 28 DNA, nó sẽ bảo vệ T-DNA khỏi sự phân giải của các enzyme nuclease trong tế bào cây (Deng và ctv., 1998). Protein VirE2 là protein chiếm số lƣợng nhiều nhất. Protein VirE2 và VirD2 mang trình tự định vị nhân, trình tự này giúp thúc đẩy đƣa phức hợp T-DNA vào nhân. Hai sản phẩm của gen vir cũng đƣợc cho là có chức năng trong việc tạo T-DNA sợi đơn là: VirC1 và VirC2. VirC1 đã đƣợc thấy gắn kết vào vùng “overdrive”, vùng này nằm gần bờ phải, và bởi vậy giúp tăng cƣờng sự cắt T-DNA ở vị trí bờ vai của VirD1/VirD2 endonuclease (Gelvin, 2003). Một số tác giả khác cho rằng VirC1 và VirC2 không cần cho tạo T-DNA sợi đơn. Nhƣng khi vắng mặt hai protein này thì hiệu quả chuyển nạp T-DNA vào cây khá thấp. Do đó đề nghị rằng chúng có chức năng trong việc xuất T-DNA (Zhu và ctv., 2000). Ngoài ra, protein VirD2 đƣợc cho là có chức năng trong sự kết nạp T-DNA, bởi nó gắn vào đầu 5’ của T-DNA, đƣa T-DNA vào nhân tế bào và lƣu lại cùng với T-DNA trong các bƣớc kết nạp. Hai giả thuyết về chức năng của protein VirD2 trong sự kết nạp T-DNA đã đƣợc đề nghị: VirD2 hoạt động nhƣ một enzyme integrase và VirD2 hoạt động nhƣ một ligase (Ziemienowicz, 2001). Cùng với protein VirD4, mƣời một protein VirB, VirE2 và VirF tham gia đƣa T-DNA vào nhân. Hệ thống chuyển nạp T-DNA đƣợc mã hóa bởi operon virB, operon này mang 11 gen. Sự chuyển phức hợp T-DNA dựa trên chiên mao (pili) do operon virB mã hoá và đột biến ở bất kì gen nào trong số 11 gen của operon này đều làm mất khả năng tạo pili và tạo khối u (Lai và Kado, 1998). Các protein VirB điều khiển tạo chiên mao này (chiên mao này tƣơng tự nhƣ chiên mao tiếp hợp) và VirB2 là tiểu phần chính của chiên mao này. Hai protein VirB là VirB4 và VirB11 có hoạt tính ATPase và đƣợc cho là cung cấp năng lƣợng cho việc xuất các tiểu phần protein khác, cho vận chuyển T-DNA, hoặc cả hai. Hệ thống VirB đƣa T-DNA tới tế bào chất của tế bào cây, nơi đây các bƣớc cần cho chuyển T-DNA vào nhân và kết nạp với DNA của cây đƣợc thực hiện (Zhu và ctv., 2000). Cầu nối VirB có thể gắn kết với phức hợp T-DNA bởi protein VirD4, protein này nằm trong màng và rất cần cho việc chuyển nạp. Hệ thống VirB/VirD4 đƣa phức hợp T-DNA–VirD2 và protein VirE2 vào tế bào chất của tế bào cây, phức hợp T-DNA cuối cùng đƣợc tạo ra bằng cách phủ T-DNA với protein VirE2 (Ziemienowicz, 2001). 29 2.3.3.3. Cơ chế lây nhiễm Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens sống phổ biến ở xung quanh và trên bề mặt rễ cây. Vùng mà vi khuẩn sống gọi là vùng rễ, nơi mà vi khuẩn tồn tại nhờ việc sử dụng chất dinh dƣỡng do mô rễ tạo ra. Nhƣng vi khuẩn chỉ xâm nhiễm vào cây khi cây bị tổn thƣơng do nhiều nguyên nhân. Yêu cầu về vết thƣơng cho việc xâm nhiễm có thể dễ dàng đƣợc chứng minh bằng các thí nghiệm. Trong điều kiện tự nhiên, các tế bào vi khuẩn di chuyển đến vị trí vết thƣơng nhờ các dấu hiệu hoá học. Điều này có đƣợc là do đáp ứng giải phóng đƣờng và các thành phần phổ biến khác trong rễ. Tuy nhiên, chủng vi khuẩn có mang pTi sẽ đáp ứng mạnh hơn bởi vì chúng xác định các hợp chất vết thƣơng (hợp chất phenolic) nhƣ acetosyringone. Chất này có tác dụng rất mạnh mặc dù ở nồng độ thấp (10-7 M). Bởi vậy, một trong những chức năng của pTi là mã hoá cho các thụ thể (receptor) nhận biết các chất hoá học. Những thụ thể này nằm trên màng tế bào vi khuẩn và có thể giúp cho vi khuẩn nhận biết ra các vùng bị tổn thƣơng. Acetosyringone đóng vai trò quan trọng trong tiến trình xâm nhiễm. Ở nồng độ cao (10-5 – 10-4 M) hơn nó sẽ kích hoạt các gen vir trên pTi (Deacon và ctv., 2005). Các gen vir đƣợc kích hoạt tốt nhất ở nhiệt độ 25-270C. Tuy nhiên, hầu hết các chủng Agrobacterium hoạt động ổn định ở nhiệt độ 18-200C (Gelvin, 2003) Hình 2.3. Quá trình tạo phức hợp sợi đơn T-DNA (nguồn Valentine, 2003). Sau khi đƣợc kích hoạt, các gen vir sẽ điều khiển quá trình tạo T-DNA sợi đơn trong tế bào vi khuẩn (hình 2.3). Quá trình tạo T-DNA sợi đơn đƣợc thực hiện trong tế bào vi khuẩn và do các protein VirD1 và VirD2 thực hiện. Sau đó protein VirD2 gắn vào sợi đơn T-DNA để tạo thành phức hợp T-DNA. Ngoài VirD1, VirD2 ngƣời ta còn cho rằng VirC1 và VirC2 cũng tham gia vào quá trình tạo T-DNA sợi đơn. Phức hợp 30 T-DNA-VirD2 cùng với protein VirE2 đƣợc chuyển vào trong tế bào cây thông qua hệ thống chuyển nạp đƣợc mã hoá bởi các gen virB. Cùng với một số thành phần trong tế chất của tế bào cây, các protein của vi khuẩn sẽ tiếp tục đƣa phức hợp T-DNA vào trong nhân tế bào (Ziemienowicz, 2001). Hình 2.4. Quá trình kết nạp T-DNA vào bộ gen của tế bào cây (nguồn Valentine, 2003) Trong nhân tế bào cây, T-DNA đƣợc kết nạp vào bộ gen của cây (hình 2.4) không theo một quy luật tái tổ hợp nào cả. Mô hình cơ sở cho sự kết nạp T-DNA vào bộ gen của cây đã đƣợc đề nghị. Theo mô hình này, đầu tiên đầu 3’ của T-DNA nhận diện các đoạn tƣơng đồng với DNA của cây và gắn vào. Cả việc tách sợi DNA của cây và overhang đầu 3’ của T-DNA đều đƣợc enzyme nuclease thực hiện. Cuối cùng nucleotide gắn với VirD2 tìm các đoạn vi tƣơng đồng (microhomology) trên DNA cây và gắn vào. Sự gắn kết này mang cầu nối phosphotyrosine có ái lực điện tử của đầu 5’ đến gần đầu 3’ nucleophilic của DNA cây mà bị tách ra. Cuối cùng sự gắn kết trên sợi DNA của cây đƣợc hoàn thành và cây chuẩn bị một cơ chế sinh tổng hợp đoạn T-DNA dẫn đến sự kết nạp của T-DNA hoàn thành. Cuối cùng, sau khi sự kết nạp hoàn thành các gen trên T-DNA hoạt động tổng hợp nên các sản phẩm cần thiết cho vi khuẩn (Ziemienowicz, 2001). Các opine đƣợc tạo ra từ các khối u do vi khuẩn Agrobacterium nhiễm vào đƣợc vi khuẩn biến dƣỡng nhờ vào các gen ở vùng phân giải opin trên pTi. Tùy theo kiểu opine mà đƣợc chuyển hóa bởi các gen khác nhau (Ziemienowicz, 2001, trích từ Petit và Tempé, 1985). 31 Khả năng chuyển nạp đoạn DNA của Agrobacterium vào trong tế bào cây cung cấp một công cụ mạnh cho công nghệ sinh học thực vật và do đó chuyển nạp gene qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium là một trong những kỹ thuật đƣợc sử dụng phổ biến trong chuyển nạp gene cây trồng. Trong thời gian ban đầu, phƣơng pháp này bị hạn chế chỉ thực hiện trên cây hai lá mầm do tin rằng Agrobacterium chỉ có thể nhiễm vào cây hái lá mầm. Sau này, ngƣời ta tìm ra rằng mặc dù Agrobacterium chỉ tạo khối u trên cây hai lá mầm nhƣng nó có thể nhiễm vào cây một lá mầm và không tạo khối u. (Ziemienowicz, 2001). Hình 2.5. Mô hình chuyển nạp T-DNA từ tế bào vi khuẩn vào tế bào cây (nguồn Zhu và ctv., 2000). 32 CHƢƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu Giống bông vải: hạt của giống bông vải Coker 312 (đối chứng), SSR60F đƣợc thu từ nhà lƣới của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long. Hạt của các giống bông vải này phải đảm bảo là các hạt tự thụ. Mẫu cấy: Trụ hạ diệp của cây mầm 5-7 ngày tuổi. Dụng cụ, hóa chất, nguồn vi khuẩn và hóa chất: Các dụng cụ và hóa chất chuẩn bị cho nuôi cấy mô, chuyển nạp gen và xét nghiệm sinh học của phòng thí nghiệm Công Nghệ Gen, Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long (phụ lục). 3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành Địa điểm: Nghiên cứu đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Gen, Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Cờ Đỏ, Tp. Cần Thơ. Thời gian thực hiện: Nghiên cứu đƣợc tiến hành từ ngày 21 tháng 3 năm 2005 đến ngày 31 tháng 7 năm 2005. 3.3. Phƣơng pháp 3.3.1. Quy trình chuển nạp gen 3.3.1.1. Chuẩn bị vật liệu nuôi cấy Hạt của các giống bông vải đƣợc đốt lớp bông xơ bao quanh bằng axit sulfuric (H2SO4) đậm đặc (98%), rồi rửa với nƣớc máy cho đến khi sạch hết axit và bột than, sau đó sấy trong tủ sấy ở 400C cho đến khi đạt độ ẩm 14% (khoảng 48h). Hạt đƣợc khử trùng bề mặt với cồn 700 (2 phút) và rửa hai lần bằng nƣớc cất vô trùng. Sau đó, hạt đƣợc khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% (w/v) bổ sung thêm 2 hoặc 3 giọt Tween 20 và lắc ở tốc độ 80 rpm. Thao tác khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% (w/v) đƣợc lặp lại hai lần, mỗi lần 10 phút và giữa hai lần khử trùng hạt đƣợc rửa bằng nƣớc cất tiệt trùng. Sau khi khử trùng bằng HgCl2 0,1% (w/v), hạt đƣợc 33 rửa nhiều lần với nƣớc cất vô trùng (5lần) và ngâm qua đêm trong nƣớc cất vô trùng. Ngày hôm sau, hạt đƣợc lấy ra rửa hai lần với nƣớc cất tiệt trùng, sau đó khử trùng tiếp bằng HgCl2 0,1% (w/v) trong 2 lần, mỗi lần khử trùng 5 phút. Giữa hai lần khử trùng bằng thủy ngân, hạt đƣợc rửa 3 lần bằng nứơc cất vô trùng. Sau khi khử trùng, hạt đƣợc bóc bỏ vỏ và cấy vào môi trƣờng nảy mầm MSG (phụ lục 4). Mẫu đƣợc nuôi cấy trong tủ cấy (Sanyo MLR35OH, Nhật) ở nhiệt độ 290C dƣới ánh sáng huỳnh quang, độ ẩm tƣơng đối bằng 50%. Từ cây mầm 5-7 ngày tuổi (hình 3.1) đã đƣợc chuẩn bị ở bƣớc trên, trụ hạ diệp đƣợc cắt cẩn thận (khoảng 5 mm) và đƣợc dùng làm vật liệu cho các thí nghiệm chuyển nạp gen. Hình 3.1. Cây mầm trên môi trƣờng nảy mầm. A: hạt mầm sau xử khử trùng đƣợc cấy lên môi trƣờng nảy mầm, B: Cây Coker 312 5 ngày tuổi 3.3.1.2. Nguồn Plasmid Plasmid pManCa (Hoa và Bong, 2003) mang gen pmi (phosphomannose isomerase) giúp tế bào thực vật biến dƣỡng đƣờng mannose và gen chỉ thị gus trong chủng vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404 (Hoekema và ctv..,1984) đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này ( hình 3.2). 34 Hình 3.2. Sơ đồ vectơ pManCa mang gen pmi 3.3.1.3. Chuẩn bị vi khuẩn Chủng vi khuẩn LBA4404 mang vectơ pManCa, từ ống tồn trữ trong glycerol (50% v/v) trong tủ lạnh âm 800C đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng đặc ABG (Chilton và ctv., 1974) có 50 mg/l kanamycine. Từ vi khuẩn trên môi trƣờng ABG (phụ lục 3) chọn ra một khuẩn lạc tốt (single colony) cấy vào 3ml môi trƣờng YEP có bổ xung kanamycin 50 mg/l (phụ lục 2) và nuôi khoảng 24 – 28 giờ ở 280C, trên máy lắc với tốc độ 200 rpm. Sau khi nuôi cấy đƣợc khoảng 24-28 giờ, dịch huyền phù vi khuẩn đƣợc cấy chuyển sang 50 ml môi trƣờng YEP có bổ sung kanamycin 50 mg/l và nuôi cấy tiếp khoảng 16–18 giờ ở 280C, lắc 200 rpm. Sau khi nuôi cấy khoảng 16-18 giờ, lấy 1ml dịch vi khuẩn để đo OD600 nhằm xác định mật số vi khuẩn (OD600~ 0,5-1,0), dịch huyền phù vi khuẩn đƣợc ly tâm 5000 rpm trong 10 phút. Phần lắng sau khi ly tâm sẽ đƣợc pha loãng (để OD600= 0,6) với môi trƣờng lây nhiễm không có phytagel và lắc với tốc độ 220 rpm ở 280C trong 1giờ (có bổ sung 0,2 mM AS). 3.3.1.4. Đồng nuôi cấy Cơ bản dựa theo qui trình của Chen và ctv., 2000 (WO 00/77230 A1, Syngenta) nhƣng có vài thay đổi. Mẫu trụ hạ diệp đƣợc cắt thành nhiều đoạn dài khoảng 5 mm. Các khúc cắt này đƣợc ngâm trong dung dịch vi khuẩn pha loãng (OD600= 0,6) trong 20 phút (thay vì 5 phút), sau đó đem lắc chung dịch vi khuẩn và mẫu trụ hạ diệp trên máy lắc với tốc độ 35 50 rpm trong 10 phút. Sau đó, dịch vi khuẩn đƣợc loại bỏ, mẫu trụ hạ diệp đƣợc làm khô trên giấy thấm tiệt trùng. Khi các mẫu trụ hạ diệp khô sẽ đƣợc cấy chuyển sang các đĩa Petri chứa môi trƣờng lây nhiễm (thay vì đặt mẫu lên giấy lọc trong đĩa petri chƣa 50 ml môi trƣờng) MSCo (phụ lục 5). Các đĩa mẫu này đƣợc giữ trong tủ nuôi cấy mô thực vật ở 210C, với điều kiện chiếu sáng liên tục trong 3 ngày. 3.3.1.5. Thanh lọc và tái sinh mẫu lây nhiễm Sau 3 ngày đồng nuôi cấy với vi khuẩn các mẫu trụ hạ diệp đƣợc rửa bằng nƣớc cất tiệt trùng và kháng sinh carbenicillin để ức chế vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Sau khi rửa các mẫu trụ hạ diệp đƣợc làm khô bằng giấy thấm tiệt trùng và chuyển sang môi trƣờng phục hồi MSRec (phụ lục 6) có bổ sung thêm 500 mg/l carbenicillin. Các mẫu này sẽ đƣợc nuôi cấy một tuần ở 280C với quang kỳ 16 giờ sáng/ 8 giờ tối. Sau đó, các mẫu đƣợc cấy chuyền sang môi trƣờng thanh lọc MSS (phụ lục 7) chứa glucose và mannose ở nồng độ thăm dò theo sự tăng dần nồng độ mannose (25-35 g/l) và giảm dần nồng độ glucose (10-0 g/l). Qua 3 lần thanh lọc, mỗi lần cách nhau 2 tuần hoặc đến khi nghiệm thức đối chứng cho thấy tất cả các mẫu nuôi cấy đều chết. Bảng 3.1. Nồng độ mannose và glucose qua ba lần thanh lọc Lần thanh lọc Mannose Glucose I II III 25g/l 30g/l 35g/l 10g/l 5g/l 0g/l Chọn các mô kháng phát triển tốt trên môi trƣờng thanh lọc để cấy chuyển sang môi trƣờng phát sinh phôi. Các mô kháng đƣợc tách nhỏ khoảng 3 mm theo từng khối mô sẹo riêng biệt để tạo thành các dòng chuyển nạp gen giả định và cấy chuyển lên môi trƣờng phát sinh phôi DM (phụ lục 8). 36 3.3.2. Các chỉ tiêu theo dõi 3.3.2.1. Sự hình thành mô sẹo Tỷ lệ hình thành mô sẹo đƣợc theo dõi ở thời điểm là sau 7 ngày trên môi trƣờng phục hồi. Từ các số liệu này cho phép so sánh tỷ lệ hình thành mô sẹo giữa mẫu đối chứng và giữa các giống. Phần mềm sử dụng trong quá