Khóa luận Nghiên cứu nhân giống vô tính cây tiêu (Piper nigrum) bằng phương pháp nuôi cấy mô

abu và ctv. 1993, Nazeem và ctv. 1993, Bhat và ctv. 1995). Cây mới đƣợc tái sinh trực tiếp từ mô lá thông qua giai đoạn mô sẹo (Nirmal Babu và ctv. 1993). 12 Những báo cáo về phƣơng pháp vi nhân giống cây tiêu đã đóng góp quan trọng cho nền kinh tế và mối liên hệ giữa các giống tiêu: Piper viz, P. longum, P. chaba, P. betle, P. colubrinum, P. attenuatum và P. barberi. Các Protocol của P. longum có tốc độ nhân dòng nhanh bắt đầu từ các đầu rễ (Sarasan và ctv. 1993, Nirmal Babu và ctv. 1993, Rema và ctv. 1995). Phƣơng pháp vi nhân giống cây tiêu P. chaba đã đƣợc (Nirmal Babu và ctv. 1993, Rema và ctv. 1995) tiêu chuẩn hóa. Sự chuyển hóa của mô phân sinh rễ và mô phân sinh ngọn đã giúp cây con phát triển, ở cây tiêu P. longum và P.colurinum đã đƣợc báo cáo về vấn đề này (Nirmal Babu và ctv. 1993). Các cây con in vitro của giống tiêu này đã đƣợc đánh giá, thử nghiệm ở phòng thí nghiệm nghiên cứu chủng loại Calicus ở Ấn Độ. Cây tiêu đã đƣợc tái sinh từ lá và thân là: P. longum, P. betle, P. chaba, P. attenuatum và P. colubrinum chúng tái tạo các cơ quan một cách trực tiếp hoặc gián tiếp (Bhat và ctv. 1992, Bhat, ctv. 1995, Rema và ctv. 1995, Madhusudhanan và ctv. 1996). 2.4 Nhóm các chất điều hòa tăng trƣởng ảnh hƣởng tới quá trình nuôi cấy mô Sự hiện diện của các hormone tăng trƣởng đã đƣợc khám phá ra cuối thế kỷ 20. Trong đó chất Auxin là chất đƣợc khám phá đầu tiên vào năm 1934, kế đến là các chất Gibbérellines và chất cytokinin trong những năm 1950. Các hormone này đều có tác dụng kích thích lên sự chuyển hóa của tế bào .Các chất này có nguồn gốc nội sinh, ngoài ra còn có các chất tổng hợp khác do con ngƣời điều chế mà nó có công thức hóa học gần giống hoặc khác với các chất trong thiên nhiên, nhƣng chúng biểu hiện một hoạt động về một sinh lý tƣơng tự. *Một số đặc tính cơ bản của các chất kích thích sinh trưởng Chúng hoạt động ở liều rất yếu; ở liều cao chúng trở nên độc, điều này cho phép một số chất kích thích tố đƣợc sử dụng nhƣ thuốc diệt cỏ. Chúng can thiệp vào nhiều hiện tƣợng sinh lý, điều này bao hàm ít nhiều dạng thức hoạt động của chúng, từ sự kiện này khái niệm về “hormone chuyên biệt” hiện tại đã đƣợc bỏ đi. 2.4.1 Auxin Auxin đƣợc khám phá ra do các thí nghiệm thực hiện trên các phản ứng về đƣờng cong của loài Coléoptiles họ Graminées. Do có tác dụng trong hoạt động kéo dài tế bào nên có tên nhƣ vậy. Đây là một chất có nhân indole, có công thức nguyên là C10H9O2N, có tên là acid indole β acetique hoặc acid β indolylacétique. 13 2.4.1.1 Tính chất sinh lý của Auxin Auxin can thiệp vào nhiều hiện tƣợng sinh lý, hoạt động của nó phụ thuộc vào nồng độ và các sự hỗ tƣơng qua lại của chúng với các chất điều hòa khác. Các tác động của Auxin đƣợc thể hiện nhƣ sau: Kéo dài tế bào: làm ra tăng tính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâm nhập của nƣớc vào bên trong tế bào; lúc đó sự đề kháng của thành tế bào giảm đi và tế bào tự kéo dài ra. Sự thay đổi về tính thẩm thấu của màng tế bào, sự thay đổi này thể hiện bằng một sự phóng thích ion H+ , ion này gây ra một hoạt tính acid có tác dụng làm giảm tính đề kháng của thành tế bào và bởi sự hấp thu ion K+. Một hoạt động tổng quát trên sự chuyển hóa và đặc biệt là trên sự tổng hợp ARN robosomique. Sự kích thích về sự phân chia tế bào đối với các tế bào nguồn gốc cambium. Hiệu quả này là do chất “histogène” bởi vì nó dẫn đến có nhiều tế bào giống nhau hoàn toàn, các tế bào này tạo nên một “mô sẹo”. Hoạt động lên sự tổng hợp ethylene bắt đầu từ một vài nồng độ; chất etylen tham gia trong giai đoạn trở về để điều chỉnh tỉ lệ chất auxin, ít nhất ở mức độ chuyên chở. Hoạt động trong các phản ứng về tăng trƣởng và trong các sự hỗ tƣơng giữa các cơ quan với nhau, đặc biệt về tính ƣu thế của chồi non. Có tác dụng làm giảm sự rụng lá và trái. Có tác dụng kích thích tạo rễ. 2.4.1.2 Auxin trong cây trồng Tất cả cây trồng đều tổng hợp đƣợc chất auxin dạng tổng hợp tùy theo giai đoạn phát triển của chúng. Chất auxin sinh ra đƣợc hiện diện trong các lá rất non, trong các chồi đang hoạt động, ở mức độ phát hoa và ở trên các quả còn non. Auxin lƣu thông từ đỉnh xuống phần dƣới các cơ quan với một sự phân cực rõ ràng đƣợc thấy rõ trên các cơ quan thực vật còn non, nhƣng trong quá trình chuyển vận này chúng bị thoái hóa bởi sự auxin-oxydases, điều này cho thấy nồng độ auxin thì luôn cao hơn gần với những nơi tổng hợp chúng. Nhƣ vậy, auxin hiện diện với nồng độ vừa đủ ở mức các điểm tăng trƣởng hoặc ở phát hoa để đảm bảo sự nhân giống và kéo dài tế bào. 14 2.4.1.3 Các chất auxin tổng hợp Gồm các chất chính sau:  Acid indolylbutyrique (AIB)  Acid naphtylacetique (ANA) hoặc các chất dẫn xuất của chúng nhƣ:  Acid naphtyloxyacetique (ANOA)  Acid naphtylacétamide (NAD)  Acid 2,4 dichrolophen-oxyacetique (2,4-D) Trong lĩnh vực nuôi cấy in vitro, những chất giống đƣợc sử dụng và auxin đã chiếm một vị trí quan trọng hơn, hai tính chất của chúng đƣợc nghiên cứu thuộc lĩnh vực nhân tế bào và hiệu quả ra rễ. Ngoài ra, trong thực tiễn chúng còn đƣợc dùng để giâm cành, để làm sáng quả, sự đậu quả và làm chậm sự thu hoạch quả. (Dƣơng Công Kiên, 2002) 2.4.2 Gibbérelline Gibbérelline đã nổi bật rất lâu trƣớc khi đƣợc nhận dạng. Chất Gibbérelline đầu tiên đƣợc nhận dạng là acid gibbérellique hoặc là GA3, kế đến là GA4 + GA7 và GA7. Tất cả các Gibbérelline thể hiện một nhân giống nhau; chúng có sự khác nhau bởi chất lƣợng và vị trí của các chất gắn trên nhân. 2.4.2.1 Tính chất sinh lý của Gibbérelline Hoạt động kéo dài các đốt của cây, hoạt động này cũng có thể áp dụng lên các cuống hoa và điều này cho phép có một sự chín tốt hoặc những phát hoa phát triển hơn. Trong nuôi cấy in vitro, Gibbérelline có tác động đối với nhiều đỉnh sinh trƣởng, nếu thiếu Gibbérelline đỉnh sinh trƣởng thể hiện một dạng hình cầu, tạo nên các mắt cây. Hoạt động phức tạp trong sự ra hoa. Tác động lên sự đậu trái của các trái không hạt. Tác động gây thức giấc các chồi, mầm ngủ trên các hạt giống làm thuận lợi cho sự nảy mầm. Trong lĩnh vực sinh tạo cơ quan thực vật, Gibbérelline cho thấy các hoạt động đối kháng: chúng dƣờng nhƣ đối ngƣợc với hiện tƣợng phân hóa tế bào. Trong nuôi cấy in vitro Gibbérelline không đƣợc sử dụng vào mục đích này, nhƣng 15 chúng có công dụng với các mô đã có tổ chức (đỉnh sinh trƣởng, chồi ngọn, chồi thân…). 2.4.2.2 Gibbérelline trong cây trồng Gibbérelline đƣợc tìm thấy trong tất cả các loại cây và trong các loại nấm, ở đây chúng đƣợc phân bố không đồng đều, một vài loại có trong vài loại cây, một vài loại nấm và một vài chất Gibbérelline có trong cả hai nhóm (nhƣ GA1, 3, 4, 7, 9). Trong cây trồng, một vài loại cây chỉ có một chất Gibbérelline, các loài cây khác có thể có nhiều loại chất Gibbérelline. 2.4.3 Cytokinine Cytokinine đƣợc khám phá do trung gian của sự nuôi cấy in vitro. Ngƣời ta đã biết sự thêm nƣớc dừa vào môi trƣờng nuôi cấy gây ra hiệu quả làm thuận lợi cho việc nhân chia tế bào và cho việc hình thành các chồi. Vào năm 1956, Skoog đã cô lập đƣợc một chất rất hoạt động mà ngƣời ta đặt tên là kinétine, do ADN biến chất. Cytokinine là các chất adenine đƣợc thay thế, chất này đƣợc ngƣời ta biết qua 2 nhóm nội sinh là:  Zeatine.  Isopentényladénine (IPA), Cytokinine tự nhiên và các chất tổng hợp. Có hai loại đƣợc sử dụng nhiều nhất là:  Kinetine ( 6 furfuryl-aminopurine).  Benzyladenine (BAP) (6-benzyl- aminopurine). 2.4.3.1 Tính chất sinh lý của Cytokinine Tác động hiệu quả rất rõ lên sự phân chia tế bào, trong quá trình này, chúng cần thiết nhƣng chúng không hiệu quả nếu vắng mặt auxin: Cytokinine là chất bổ sung; auxin làm thuận lợi cho sự nhân đôi của acid desoxyribonucleique (ADN) và Cytokinine cho phép làm tách rời các chromosome. Có vai trò rất rõ trong việc tạo cơ quan thực vật, ở đây chúng sẽ kích thích mạnh mẽ sự thành lập các chồi non. Trái lại, chúng là chất đối kháng với sự tạo rễ. Hoạt động kích thích trên sự chuyển hóa, làm thuận lợi một phần việc tổng hợp protein, mặt khác trong lúc bảo vệ các chất chuyển hóa chống lại tác động của enzyme li giải. Hiệu quả đối kháng của tính ƣu thế chồi non: các chồi nách đƣợc xử lí Cytokinine sẽ tăng trƣởng và cạnh tranh với chồi tận cùng. 16 Cytokinine có vai trò quan trọng trong nuôi cấy in vitro, nó thể hiện các tính chất cần thiết để duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào và định hƣớng tế bào trong con đƣờng phân hóa. 2.4.3.2 Cytokinine trong cây trồng Đƣợc tìm thấy đầu tiên vào năm 1963 trong các phôi còn non của cây ngô (là zeatine); chất thứ hai là IPA thấy ở trong cây bị nhiễm vi khuẩn corynebacterium fascines. Chúng định vị ở lá non trong chồi và ở các đầu của rễ cây. 17 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu - Thời gian thực hiện từ tháng 3 đến tháng 8 năm 2005 - Địa điểm thực hiện tại Bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Trƣờng Đại Học Nông Lâm – TP.HCM. 3.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 3.2.1 Phòng chuẩn bị Tủ sấy: để sấy khô các dụng cụ. Nồi hấp autolave: hấp vô trùng môi trƣờng và dụng cụ nuôi cấy. Tủ lạnh: để bảo quản hóa chất và môi trƣờng dự trữ. Bể rửa chai, ống nghiệm. Bếp điện: để nấu môi trƣờng và hấp cách thủy hóa chất. Cân phân tích: để cân đƣờng, Agar, các hóa chất. Máy đo pH. 3.2.2 Phòng cấy Tủ cấy vô trùng. Đèn cực tím. Giá, bàn để môi trƣờng và mẫu cấy. Các dụng cụ cấy gồm: dao cấy, kéo, pince, đèn cồn, bình phun và bông gòn tất cả đã đƣợc hấp vô trùng. 3.2.3 Phòng nuôi cây Kệ đặt chai hoặc ống nghiệm nuôi cấy, trên mỗi kệ đều lắp đèn huỳnh quang dài 1,2m. Máy điều hòa nhiệt độ để đảm bảo nhiệt độ phòng nuôi cây là 25 ± 20 C. Nhiệt kế để đo nhiệt độ phòng nuôi cây. Ẩm kế để đo độ ẩm của phòng nuôi cây. 18 3.2.4 Môi trƣờng cơ bản dùng trong thí nghiệm Môi trƣờng dùng trong thí nghiệm là MS (Murashige & Skoog), gồm các thành phần sau: Nguyên tố đa lượng: NH4NO3 1650 mg/L KNO3 1900 mg/L MgSO4.7H2O 370 mg/L KH2PO4 170 mg/L CaCl2.2H2O 440 mg/L Nguyên tố vi lượng: H3BO3 6,2 mg/L MnSO4.4H2O 22,5 mg/L ZnSO4.7H2O 8,6 mg/L KI 0,83 mg/L Na2MoO4.2H2O 0,25 mg/L CuSO4.5H2O 0,025 mg/L CoCl2.6H2O 0,025 mg/L Vitamins: Inositol 100 mg/L Nicotinic 0,5 mg/L Pyridoxin Hcl 0,5 mg/L Thiamin Hcl 0,1 mg/L Glyxin 2 mg/L Fe EDTA: FeSO4.7H2O 27,8 mg/L Na2 EDTA.2H2O 37,3 mg/L 3.3. Vật liệu nuôi cấy Đối tƣợng đƣợc dùng để thí nghiệm là cây tiêu LadaBelangtoeng. 3.4. Phƣơng pháp thí nghiệm Trong giới hạn của đề tài chúng tôi chỉ tập trung nghiên cứu các nội dung: 19 Hiệu quả khử trùng của hai loại kháng sinh Tetracylin, Streptomycin. Nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo từ các mẫu lá trên môi trƣờng nuôi cấy khác nhau về tỷ lệ chất kích thích sinh trƣởng. Nghiên cứu khả năng tạo chồi từ các mô sẹo trên môi trƣờng nuôi cấy khác nhau về tỷ lệ chất kích thích sinh trƣởng. Các nội dung trên đƣợc nghiên cứu lần lƣợt qua các thí nghiệm. 3.4.1. Thí nghiệm 1: Khử trùng mẫu cấy 3.4.1.1 Thí nghiệm 1a: Khảo sát việc khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch thuốc kháng sinh Tetracylin. 3.4.1.2 Thí nghiệm 1b:Khảo sát việc khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch thuốc kháng sinh Streptomycin.  Bố trí thí nghiệm 1a và 1b: Thực hiện thí nghiệm về thời gian xử lí kháng sinh. - Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 10 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm cấy một mẫu. - Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức - Tổng số ống nghiệm cho mỗi nghiệm thức: 30 - Tổng số mẫu cho mỗi nghiệm thức: 30 - Tổng số mẫu trong thí nghiệm: 90 Bảng 3.1 Mô tả thí nghiệm 1a Tên NT Kháng sinh Nồng độ kháng sinh (g/L) Mẫu cấy Số ống nghiệm Số chồi T2 T6 T10 Tetracylin Tetracylin Tetracylin 2,5 2,5 2,5 chồi tiêu chồi tiêu chồi tiêu 30 30 30 30 30 30 Bảng 3.2 Mô tả thí nghiệm 1b Tên NT Kháng sinh Nồng độ kháng sinh (g/L) Mẫu cấy Số ống nghiệm Số chồi S2 S6 S10 Streptomycin Streptomycin Streptomycin 2,5 2,5 2,5 chồi tiêu chồi tiêu chồi tiêu 30 30 30 30 30 30 20  Tiến hành thí nghiệm: * Chuẩn bị mẫu: Cắt phần ngọn của cây tiêu dài khoảng 3-5 cm rồi cắt bỏ hết phần lá. Rửa sạch mẫu dƣới vòi nƣớc. Lắc mẫu trong dung dịch xà bông loãng khoảng 15 phút, rồi rửa sạch lại mẫu dƣới vòi nƣớc cho sạch xà bông. Cho mẫu vào dung dịch kháng sinh Tetracylin hoặc Streptomycin đã pha sẵn, rồi bỏ lên máy lắc và tính giờ để lấy mẫu ra. * Vào tủ cấy: Rửa lại mẫu bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần. Ngâm mẫu trong dung dịch nƣớc Javel với tỷ lệ giữa nƣớc và Javel là 1:1 trong khoảng 15 phút. Rửa sạch Javel trong nƣớc cất vô trùng 3 lần. Lắc mẫu trong dung dịch cồn 70o trong 30 giây. Rửa lại nƣớc cất vô trùng 3 lần. Lột bỏ hết lớp lá cho tới khi lộ ra phần ngọn nhỏ màu xanh (không còn phần màu đen) thì dùng dao cấy bén cắt lấy phần ngọn này (dài khoảng 0,5 – 1 cm). Đƣa các phần ngọn này vào trong các ống nghiệm đã chuẩn bị sẵn môi trƣờng của thí nghiệm này là: khoáng MS + 8,5g/L Agar + 10g/L Đƣờng saccharose.  Điều kiện thí nghiệm: Môi trƣờng: Các mẫu ngọn đƣợc nuôi trên môi trƣờng khoáng MS + 8,5g/L Agar + 10g/L Đƣờng saccharose. Môi trƣờng đã khử trùng ở 1.2 atm, 121oC trong thời gian 25 phút. pH môi trƣờng: 5.8 Thể tích môi trƣờng: 15ml / ống nghiệm Cƣờng độ ánh sáng: 100µmol/m2.s Thời gian chiếu sáng: 16 giờ / ngày Nhiệt độ: 25 ± 20 C Ẩm độ: 65 ± 5% Thời gian thí nghiệm là 15 ngày 21  Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: Tỉ lệ mẫu sống = (số mẫu sống/tổng số mẫu) * 100 Tỉ lệ mẫu sạch nấm khuẩn = (số mẫu sạch/tổng số mẫu) * 100 3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA kết hợp với IBA lên sự tạo mô sẹo từ lá:  Bố trí thí nghiệm: - Thực hiện thí nghiệm về môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng là BA và IBA. + Chất kích thích sinh trƣởng BA với 3 mức độ: 0mg/L, 1mg/L, 3mg/L + Chất kích thích sinh trƣởng IBA với 3 mức độ: 0mg/L, 1mg/L, 2mg/L - Thí nghiệm gồm 9 nghiệm thức đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại gồm 3 chai ứng với một nghiệm thức, mỗi bình đƣợc cấy 4 mẫu. - Tổng số chai: 81 - Tổng số mẫu cho mỗi nghiệm thức: 36 - Tổng số mẫu cho cả thí nghiệm: 324  Tiến hành: Do chồi tiêu vô mẫu lâu mọc lá mà thời gian làm thí nghiệm thì có giới hạn nên chúng tôi sử dụng nguồn mẫu lá tiêu in vitro sạch có sẵn trong phòng thí nghiệm để thực hiện thí nghiệm này. Chuẩn bị mẫu: Lấy lá của cây tiêu in vitro sạch cắt ra thành các mẫu nhỏ khoảng 0,5 × 0,5 cm, đặt mặt trên của lá trên môi trƣờng đã chuẩn bị sẵn. Các thao tác chuẩn bị này đƣợc tiến hành trong điều kiện hoàn toàn vô trùng. 22 Bảng 3.3 Mô tả thí nghiệm 2 Nghiệm thức BA (mg/L) IBA (mg/L) Mẫu cấy Số chai Số mẫu MS1 MS2 MS3 MS4 MS5 MS6 MS7 MS8 MS9 0 0 0 1 1 1 3 3 3 0 1 2 0 1 2 0 1 2 lá tiêu lá tiêu lá tiêu lá tiêu lá tiêu lá tiêu lá tiêu lá tiêu lá tiêu 9 9 9 9 9 9 9 9 9 36 36 36 36 36 36 36 36 36  Điều kiện thí nghiệm: Mẫu đƣợc nuôi trên môi trƣờng: khoáng MS + 8,5g/L Agar + 10g/L Đƣờng saccharose + BA + IBA với sự thay đổi hàm lƣợng của BA và IBA. Môi trƣờng đã đƣợc khử trùng ở 1.2 atm, 121oC trong thời gian 25 phút. pH môi trƣờng: 5.8 Thể tích môi trƣờng: 30ml / bình 250ml Cƣờng độ ánh sáng: Tối hoàn toàn Nhiệt độ: 25 ± 20 C Ẩm độ: 65 ± 5% Thời gian theo dõi thí nghiệm: 45 ngày  Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: Ngày xuất hiện mô sẹo: Ngày đầu tiên nhìn thấy mô sẹo Trọng lƣợng tƣơi mô sẹo: Cân lần lƣợt các mô sẹo của từng nghiệm thức bằng cân phân tích trong điều kiện hoàn toàn vô trùng Hệ số tăng trƣởng của mô sẹo: HSTTMS = Ln(mc) – Ln(mđ) / số ngày theo dõi mđ: trọng lƣợng của mẫu lá khi cấy mc: trọng lƣợng của mô sẹo khi kết thúc thí nghiệm 23 3.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo  Bố trí thí nghiệm: Thực hiện thí nghiệm về môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng là BA và TDZ hoặc Ki. - Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 5 chai tƣơng ứng với một nghiệm thức, mỗi chai cấy 3 mô sẹo. - Tổng số chai trong thí nghiệm: 75 - Tổng số mẫu cấy: 225 Bảng 3.4 Mô tả thí nghiệm 3 Nghiệm thức BA(mg/L) TDZ(mg/L) Ki(mg/L) Mẫu cấy Số chai Số mẫu C1 C2 C3 C4 C5 3 3 3 3 3 0,1 0,3 0,5 0 0 0 0 0 1 0 mô sẹo mô sẹo mô sẹo mô sẹo mô sẹo 15 15 15 15 15 45 45 45 45 45  Tiến hành: Chuyển các mô sẹo có khả năng phát triển thành chồi sang các chai đã chuẩn bị sẵn môi trƣờng nhân chồi. Các thao tác đƣợc tiến hành trong điều kiện hoàn toàn vô trùng.  Điều kiện thí nghiệm: Môi trƣờng: Các mẫu mô sẹo đƣợc nuôi trên môi trƣờng khoáng MS + 8,5g/L Agar + 30g/L Đƣờng saccharose + 3mg/L BA + TDZ hoặc Ki với sự thay đổi về nồng độ của TDZ và Ki, môi trƣờng đƣợc khử trùng ở 1,2 atm, 1210C trong 25 phút. pH môi trƣờng: 5,8 Thể tích môi trƣờng: 30ml / bình 250ml Cƣờng độ ánh sáng: 100µmol/m2.s Thời gian chiếu sáng: 16 giờ / ngày Nhiệt độ nuôi: 25 ± 20 C Ẩm độ: 65 ± 5% Thời gian thí nghiệm là 60 ngày 24  Chỉ tiêu theo dõi: Số chồi mới: Đếm số chồi mới xuất hiện ở mỗi cụm chồi Trọng lƣợng tƣơi cụm chồi: Cân các cụm chồi bằng cân phân tích trong điều kiện vô trùng. Hệ số nhân chồi/tháng: HSNC/tháng = Số chồi mới xuất hiện/tháng 3.5 Phân tích thống kê: Xử lý số liệu thống kê bằng ANOVA trong phần mềm STATGRAPHICS7.0 25 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thí nghiệm 1: Khử trùng mẫu cấy Kết quả xử lý chồi mẫu tiêu bằng hai loại kháng sinh Tetracylin và Streptomycin. Bảng 4.1 Kết quả xử lí mẫu với kháng sinh Tetracylin Nghiệm thức Tỉ lệ mẫu sống (%) Tỉ lệ mẫu sạch (%) T2 T6 T10 30.95 23.19 29.77 17.86 a 21.74 c 21.43 b ANOVA ns ** Ghi chú ns: không khác biệt **: khác biệt rất có ý nghĩa Trong cùng một cột các số tận cùng không cùng một mẫu tự khác biệt rất có ý nghĩa ở mức P ≤ 0.01. Kết quả bảng 4.1 cho thấy: Nhìn chung, khi tăng thời gian xử lí thì tỉ lệ mẫu sống giảm. Sau khi xử lí mẫu bằng Tetracylin với các khoảng thời gian 2 giờ, 6 giờ và 10 giờ thì tỷ lệ mẫu sống không cho sự khác biệt giữa các nghiệm thức mà đây chỉ là sự thăng giáng ngẫu nhiên không có ý nghĩa về mặt thống kê. Thí nghiệm khử trùng bằng Tetracylin cho chỉ tiêu tỉ lệ mẫu sạch sai khác rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức P ≤ 0.01. Trong đó nghiệm thức T6 cho tỉ lệ mẫu sạch cao nhất (21.74%), nghiệm thức T10 cũng cho tỉ lệ mẫu sạch khá cao (21.43%) và nghiệm thức T2 cho tỉ lệ mẫu sạch thấp nhất (17.86%). 26 Bảng 4.2 Kết quả xử lí mẫu với kháng sinh Streptomycin Nghiệm thức Tỉ lệ mẫu sống (%) Tỉ lệ mẫu sạch (%) S2 S6 S10 28.3 b 20.03 a 16.3 a 12.12 a 16.7 b 16.7 b ANOVA * * Ghi chú *: khác biệt có ý nghĩa. Trong cùng một cột các số tận cùng không cùng một chữ khác biệt có ý nghĩa ở mức 0.01< P ≤ 0.05. Kết quả bảng 4.2 cho thấy: Cả 3 nghiệm thức trong thí nghiệm khử trùng mẫu bằng Streptomycin đều cho chỉ tiêu tỉ lệ mẫu sống và mẫu sạch khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức 0.01 < P ≤ 0.05. Nghiệm thức S6 và S10 cho chỉ tiêu tỉ lệ mẫu sống không khác biệt về mặt thống kê theo thứ tự lần lƣợt là 20.03% và 16.3%, nhƣng khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với chỉ tiêu mẫu sống của nghiệm thức S2 (28.3%). Tỉ lệ mẫu sạch của nghiệm thức S6 và S10 cho kết quả không khác biệt về mặt thống kê, nhƣng khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức S2. Nghiệm thức S6 và S10 đều cho tỉ lệ mẫu sạch đạt 16.7%, còn nghiệm thức S2 cho tỉ lệ mẫu sạch thấp nhất chỉ đạt 12.12%. Kết luận: Cả 2 nghiệm thức T6 và S6 cho tỉ lệ mẫu sạch tốt hơn các nghiệm thức còn lại. Bảng 4.3 Tỉ lệ mẫu sống và mẫu sạch xử lí kháng sinh Tetracylin và Streptomycin trong thời gian 6 giờ Thời gian xử lí 6 giờ Kháng sinh Tỉ lệ mẫu sống (%) Tỉ lệ mẫu sạch (%) Tetracylin Streptomycin 23.19 20.03 21.74 b 16.7 a ANOVA ns ** 27 Ghi chú ns: không khác biệt **: khác biệt rất có ý nghĩa Trong cùng một cột các số tận cùng không cùng một chữ khác biệt có ý nghĩa ở mức P ≤ 0.01. Kết quả bảng 4.3 cho thấy: Kháng sinh Tetracylin cho tỉ lệ mẫu sống không khác biệt về mặt thống kê so với tỉ lệ mẫu sống của kháng sinh Streptomycin. Kháng sinh Tetracylin cho tỉ lệ mẫu sạch khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê so với tỉ lệ mẫu sạch của kháng sinh Streptomycin. Kháng sinh Tetracylin cho hiệu quả khử trùng đạt 21.74% trong khi hiệu quả khử trùng của Streptomycin chỉ đạt 16.7%. Kết luận sơ bộ: Thời gian khử trùng của cả Tetracylin và Streptomycin đều cho hiệu quả tốt nhất ở mức 6 giờ. Nhƣng kháng sinh Tetracylin cho tỉ lệ mẫu sạch (21.74%) cao hơn tỉ lệ mẫu sạch của kháng sinh Streptomycin (16.7%). 4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA kết hợp với IBA lên sự tạo mô sẹo từ lá: Bảng 4.4 Thời gian xuất hiện mô sẹo của cây tiêu nuôi cấy từ mô lá Nghiệm thức MS1 MS2 MS3 MS4 MS5 MS6 MS7 MS8 MS9 Ngày xuất hiện MS (NSC) 13 11 13 17 17 10 16 7 16 Kết quả thí nghiệm cho thấy nhìn chung khi tăng hàm lƣợng IBA trong môi trƣờng nuôi cấy thì mô sẹo xuất hiện sớm hơn do sự kích thích phân chia tế bào của chất kích thích sinh trƣởng. Môi trƣờng bổ sung 3mg/L BA + 1mg/L IBA (nghiệm thức MS8) xuất hiện mô sẹo sớm nhất vào ngày thứ 7 sau khi cấy, đồng thời mô sẹo phát triển rất tốt và có khả năng phát triển thành chồi. Ngoài ra, ở các nghiệm thức MS5 và MS9 mô sẹo xuất hiện muộn hơn vào ngày thứ 17 và 16 sau cấy ở những nghiệm thức này mô sẹo cũng phát triển tốt và có khả năng phát triển thành chồi. Nghiệm thức MS1 do môi trƣờng không có BA và IBA nên mô sẹo hình thành ít và nhanh thoái hoá, nghiệm thức này có mô sẹo vào ngày thứ 13. 28 MS2 và MS3 do không có BA nên nó kích thích tạo rễ nhiều hơn tạo mô sẹo nên các mẫu lá trong các nghiệm thức này lần lƣợt sau 11 và 13 ngày mô sẹo hình thành ít đồng thời có rễ phát triển. Sau 17 ngày nuôi cấy nghiệm thức MS4 (1mg/L BA + 0mg/L IBA) mới xuất hiện mô sẹo, trễ hơn nghiệm thức MS7 (3mg/L BA + 0mg/L IBA) một ngày do trong môi trƣờng của nghiệm thức MS7 có hàm lƣợng BA cao hơn nghiệm thức MS4. Bảng 4.5 Bảng trọng lƣợng tƣơi của mô sẹo và hệ số tăng trƣởng của mô sẹo vào ngày thứ 45 sau cấy Nghiệm thức TLMS (gam) HSTTMS MS1 MS2 MS3 MS4 MS5 MS6 MS7 MS8 MS9 0.084 a 0.077 a 0.09 a 0.096 a 0.367 c 0.17 b 0.072 a 0.42 d 0.393 d 0.005 bc 0.003 ab 0.007 cd 0.009 d 0.047 f 0.025 e 0.0009 a 0.051 g 0.049 fg ANOVA ** ** Ghichú ** là khác biệt rất có ý nghĩa Trong cùng một cột các số tận cùng không cùng một chữ khác biệt có ý nghĩa ở mức P ≤ 0.01. NT: nghiệm thức TLMS: trọng lƣợng tƣơi của mô sẹo HSTTMS: hệ số tăng trƣởng của mô sẹo Kết quả thí nghiệm cho thấy trọng lƣợng mô sẹo và hệ số tăng trƣởng mô sẹo giữa các nghiệm thức khác biệt rất có nghĩa về mặt thống kê ở mức P ≤ 0.01. Bảng 4.5 cho thấy môi trƣờng cho kết quả trọng lƣợng mô sẹo và hệ số tăng trƣởng mô sẹo cao nhất là môi trƣờng có 3mg/L BA + 1mg/L IBA (nghiệm thức MS8), tiếp đó là môi trƣờng 3mg/L BA + 2mg/L IBA (nghiệm thức MS9) và môi trƣờng 1mg/L BA + 1mg/L IBA (nghiệm thức MS5) cũng cho kết quả rất tốt. 29 Kết quả về chỉ tiêu TLMS: Nghiệm thức MS8 và MS9 cho TLMS không khác biệt nhau (lần lƣợt là 0.42g và 0.393g), nhƣng khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Nghiệm thức MS5 cho chỉ tiêu TLMS cũng khá cao (0.367g), nghiệm thức MS6 cho chỉ tiêu TLMS là 0.17g. Các nghiệm thức MS1, MS2, MS3, MS4, và MS7 cho chỉ tiêu TLMS rất thấp (theo thứ tự lần lƣợt là 0.084g, 0.077g, 0.09g, 0.096g và 0.072g) và các nghiệm thức này cho kết quả không khác biệt về mặt thống kê. Kết quả về chỉ tiêu HSTTMS: Nghiệm thức MS8 cho kết quả cao nhất (0.051), kết quả này không sai khác với nghiệm thức MS9 (0.049) về mặt thống kê, nhƣng nghiệm thức MS8 lại khác biệt rất có ý với các nhiệm thức còn lại. Nghiệm thức MS5 (0.047) cho kết quả không sai khác so với nghiệm thức MS9, nhƣng nghiệm thức này lại khác biệt rất có ý nghĩa với nghiệm thức MS8. Các nghiệm thức MS1, MS2, MS3, MS4, MS6 và MS7 cho kết quả thấp mặc dù các nghiệm thức này sai khác với nhau theo thứ tự các nghiệm thức này cho các kết quả nhƣ sau: 0.005, 0.003, 0.007, 0.009, 0.025 và 0.0009. Các nghiệm thức MS1, MS2, MS3 tạo mô sẹo rất kém và các mẫu có sự xuất hiện rễ do tác dụng kích thích tạo rễ của IBA. Ở nghiệm thức MS7 chúng tôi nhận thấy m