Khóa luận Nuôi cấy Bacillus Subtilis thu nhận α-Amylase và ứng dụng trong sản xuất Dextrin

iệu riêng. Tuy nhiên, hàm lƣợng tryptophan, tyrosine thƣờng chiếm ƣu thế. Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng 1/4 tổng lƣợng amino acid cấu thành phân tử enzyme (Trần Đỗ Quyên, 2004). 2.2.5. Cơ chế xúc tác Phản ứng thủy phân tinh bột bởi α-amylase thƣờng xảy ra qua hai giai đoạn  Giai đoạn đầu là giai đoạn dịch hóa: chỉ một số liên kết trong phân tử bị đứt và độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh.  Giai đoạn tiếp theo là sự thủy phân các dextrin phân tử lớn vừa tạo thành. Nhờ đó tinh bột có thể chuyển thành maltose, glucose và các dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thƣờng α-amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp, không cho màu với Iod và một ít maltose (Trần Đỗ Quyên, 2004). Tinh bột α-Dextrin + Maltose + Glucose α- amylase H2O 11 Hình 2.4. Vị trí cắt của α-amylase trên phân tử tinh bột 2.2.6. Ứng dụng của α-amylase Là một trong những enzyme quan trọng hiện nay do ứng dụng của nó trong nhiều lĩnh vực nhƣ thực phẩm, dƣợc phẩm, công nghiệp dệt, chăn nuôi…  Trong công nghiệp thực phẩm: - Sản xuất rƣợu, bia, nƣớc trái cây. - Sản xuất bánh, bánh mì: trong tinh bột tự nhiên đã có amylase của ngũ cốc nhƣng hàm lƣợng của chúng không đủ nên việc bổ sung α-amylase có thể cải thiện tính chất của bánh nhƣ làm tăng độ nở xốp và mùi vị của bánh. - Chế biến tinh bột, sản xuất đƣờng maltose, syro glucose, syro fructose. Dịch giàu glucose đƣợc sử dụng trong công nghiệp sản xuất bột ngọt, công nghiệp lên men, sản xuất nƣớc trái cây, làm mứt. Glucose tinh thể đƣợc sử dụng trong y tế, trong khẩu phần dinh dƣỡng cho bệnh nhân, sản xuất dịch truyền. Syro fructose đƣợc dùng trong sản xuất đồ uống chứa ít năng lƣợng, bánh kẹo, nƣớc quả và sản phẩm sữa…  Làm mềm vải trong công nghiệp dệt: Trong sản xuất vải có giai đoạn hồ hóa làm vải chắc hơn, ngƣời ta hồ hóa bằng tinh bột. Sau khi dệt ngƣời ta phải loại bỏ chất tham gia hồ hóa bằng cách xử lý với α-amylase.  Sản xuất thức ăn gia súc giúp cải thiện tiêu hóa: Bổ sung hỗn hợp α-amylase, cellulase, β-glucanase… vào sinh khối cỏ ủ chua nhằm tăng năng suất tiêu hóa của vật nuôi. 12 Bổ sung α-amylase, protease vào khẩu phần thức ăn cho heo con dƣới 5 tuần tuổi nhằm gia tăng tốc độ phát triển của heo con, ngăn phát sinh bệnh tiêu chảy phổ biến ở heo con (Nguyễn Tiến Thắng, 2005).  Trong y học: chẩn đoán bệnh lâm sàng các bệnh thông thƣờng và các bệnh thiếu enzyme. 2.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI SINH VẬT SẢN XUẤT ENZYME Công nghiệp sản xuất enzyme hiện nay trên thế giới áp dụng hai phƣơng pháp: nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy chìm. Phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trƣờng rắn (bề mặt) có một số ƣu việt hơn so với phƣơng pháp chìm. Do lƣợng nƣớc trong cơ chất thấp nên enzyme và những sản phẩm khác ở trạng thái cô đặc vì vậy dễ tinh sạch. Nuôi cấy bề mặt dễ sấy khô và ít bị tổn hao hoạt tính enzyme. Không cần trang thiết bị phức tạp, chủ yếu nuôi trên khay và buồng nuôi giữ ở nhiệt độ, độ ẩm thích hợp (Lƣơng Đức Phẩm, 1998). 2.3.1. Nuôi cấy bề mặt Phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt là phƣơng pháp tạo môi trƣờng cho vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trƣờng. Môi trƣờng sử dụng là môi trƣờng lỏng hoặc sử dụng môi trƣờng đặc (môi trƣờng bán rắn). Ở môi trƣờng lỏng vi sinh vật sẽ phát triển trên bề mặt môi trƣờng tạo thành váng khuẩn ngăn cách pha lỏng và pha khí. Vi sinh vật sẽ sử dụng chất dinh dƣỡng từ dung dịch môi trƣờng, oxy không khí, tiến hành quá trình tổng hợp enzyme. (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004). 2.3.2. Nuôi cấy chìm Phƣơng pháp này ngƣời ta sử dụng môi trƣờng lỏng và đƣợc thực hiện trong những thùng lên men có trang bị hệ thống sục khí, khuấy trộn, điều chỉnh pH. Phƣơng pháp nuôi cấy chìm có ƣu điểm chiếm ít diện tích nhƣng có nhƣợc điểm là dễ bị nhiễm toàn bộ và chi phí cho trang thiết bị khá cao. 13 2.4. TÁCH VÀ LÀM SẠCH ENZYME Phần lớn các enzyme thủy phân dễ hòa tan trong nƣớc nên có thể tách chiết enzyme từ canh trƣờng nuôi cấy vi khuẩn bằng cách lọc hay ly tâm. Để tinh sạch enzyme ngƣời ta thƣờng dùng phƣơng pháp kết tủa phân đoạn bằng dung môi hữu cơ hay các dung dịch muối trung tính (K.Clarkson và cộng sự, 2000). Phƣơng pháp tinh sạch enzyme đƣợc sử dụng rộng rãi nhất hiện nay là phƣơng pháp tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ (ethanol, isopropanol và aceton). Tỷ lệ dung môi và dịch enzyme là một chỉ tiêu quan trọng, nếu thiếu dung môi sẽ không thu hồi hết enzyme trong dung dịch (Ngô Xuân Mạnh và cộng sự, 2005). Thông thƣờng ngƣời ta thêm 3 – 4 thể tích dung môi vào 1 thể tích nƣớc chiết enzyme. Để tránh mất hoạt tính của enzyme, dung môi và enzyme phải đƣợc làm lạnh xuống 3 – 5oC. Phƣơng pháp này cho hiệu suất cao, ít ảnh hƣởng đến hoạt tính enzyme, dễ tách dung môi khỏi enzyme bằng cách sấy nhẹ. Có thể thu hồi dung môi bằng chƣng cất. Phƣơng pháp phổ biến thứ hai để tách enzyme là dùng muối trung tính để kết tủa. Muối trung tính thƣờng dùng là (NH4)2SO4 với tỷ lệ 50 – 60 % so với dịch chiết enzyme (Lƣơng Đức Phẩm, 1998). 2.5. DEXTRIN (theo tài liệu tổng hợp của Nguyễn Xuân Thủy, 2001) Dextrin là sản phẩm đƣợc tạo thành do sự thủy phân tinh bột mà giá trị tƣơng đƣơng dextrose (DE) đạt đƣợc nhỏ hơn 20. Dextrin có công thức tổng quát giống với cacbonhydrate nhƣng chiều dài chuỗi ngắn hơn và mức độ phức tạp cũng thấp hơn. 14 Hình 2.5. Dextrin ( 2.5.1. Phân loại Dextrin có thể ở dạng polymer mạch thẳng, phân nhánh hay polymer mạch vòng (cyclodextrin). Dựa vào phƣơng pháp xử lý ngƣời ta chia dextrin thành 4 nhóm chính: Dextrin thu nhận dƣới tác động của enzyme. Các dextrin vòng Sardinger thu nhận dƣới tác động của vi khuẩn Bacillus macerans lên tinh bột. Các dextrin thu đƣợc bằng cách dùng acid để thủy phân tinh bột trong môi trƣờng nƣớc. Các pirodextrin gồm các sản phẩm thu nhận đƣợc bằng xử lý nhiệt (có hay không có acid) lên tinh bột. Dựa vào tính tan, ngƣời ta phân loại dextrin nhƣ sau (Lê Hồng Phú, 2000): Amylosedextrin: tan trong rƣợu 25%, không tan trong rƣợu 40% Erythrodextrin: tan trong rƣợu 70%, không tan trong cồn tuyệt đối. Achrodextrin: tan trong cồn tuyệt đối. 2.5.2. Tính chất Đặc tính của dextrin tùy thuộc vào chỉ số DE đạt đƣợc, thƣờng có độ nhớt cao vì chứa một lƣợng lớn các polysaccharide trọng lƣợng lớn. Dextrin có bản chất keo, nhƣng mức phức tạp về phân tử thì lại thấp hơn. 15 Dextrin đƣợc xử lý enzyme tạo maltose, thủy giải bằng acid tạo glucose. Cho nhiều màu sắc khác nhau với dung dịch Iod. Dextrin có mức độ phức tạp cao cho màu xanh hoặc đỏ tía. Các dextrin có mức độ phân tử trung bình cho màu đỏ và các dextrin có mức độ phân tử thấp hơn sẽ không tạo màu với Iod. Dextrin tan trong nƣớc tạo dung dịch trong nhƣ nƣớc trái cây, nhƣng khi có glycogen dung dịch dextrin sẽ có màu trắng đục. Bảng 2.2. Một số tính chất của dextrin DE pH Tính chất 4 - 7 4,0 - 5,0 Độ nhớt cao, rất ít hút ẩm, ít ngọt, hòa tan tới 15% chất khô, bột mịn. Glucose 0,3% chất khô, maltose 0,9% chất khô 9 -12 4,0 - 4,7 Rất ít hút ẩm, ít ngọt, ít hóa màu nâu, hòa tan tới 30% chất khô Glucose 0,8% chất khô Maltose 2,9% chất khô 13 - 19,5 4,0 - 5,1 Ít hút ẩm, ít biến màu nâu, ngọt nhẹ, hòa tan tới 60 - 70% chất khô Glucose 1,3 - 1,6% chất khô, maltose 4,8 - 5,8% chất khô. 2.5.2.1. Độ nhớt Độ nhớt là một trong những yếu tố quan trọng trong ứng dụng của dextrin, lợi dụng độ nhớt này mà ngƣời ta sản xuất huyết tƣơng trong y học. Độ nhớt dextrin đƣợc đo bằng Sangtipuaz bởi các pipet chuyên dụng hoặc các công cụ chuẩn khác. Độ nhớt phụ thuộc vào nguồn tinh bột, nhiệt độ, nồng độ acid, độ pH và tuổi của dung dịch. 16 2.6.2.2. Độ pH pH ảnh hƣởng đến dextrin thành phẩm, độ keo tụ và kết dính. Trong quá trình thủy giải, độ acid làm biến đổi tinh bột hay dextrin phân tử lƣợng lớn tạo dung dịch loãng. Dù đƣợc trung hòa trở lại bằng Na2CO3 hoặc NH3 trƣớc khi đóng gói, nhƣng acid với một lƣợng dƣ vẫn ảnh hƣởng tính keo trong quá trình tích lũy. 2.6.2.3. Tuổi của dung dịch dextrin Sự gia tăng độ nhớt gây ra do sự đông lại hoặc do sự thoái biến của dung dịch dextrin, đặc biệt là những dextrin ít hòa tan. Khi thêm vào dung dịch dextrin chất làm đông đặc (Tetraborate Natri 5 - 20%) thì độ nhớt của dextrin gia tăng, thêm các chất nhƣ urea, dicyandiamide, salisilic acid, formaldehyde, các muối guanadin sẽ làm giảm độ nhớt. Thêm urea có thể thích hợp để dung dịch dextrin ở trạng thái lỏng. 2.6.2.4. Độ hòa tan Giai đoạn đầu của sự dextrin hóa, không có biến đổi lớn về độ tan của dextrin trong nƣớc lạnh. Ở nhiệt độ 130 - 140oC, khi có acid thì độ hòa tan nhanh chóng đạt 100% nhƣng hồ nóng từ sản phẩm này không bền và lúc làm lạnh thì không tạo nên các gel đặc. 2.6.2.5. Màu sắc Màu của dextrin phụ thuộc độ acid và nhiệt độ dextrin hóa. Các sản phẩm thu đƣợc ở nhiệt độ thấp thƣờng cho màu trắng, còn những sản phẩm thu đƣợc ở nhiệt độ cao có thể màu nâu. Độ acid cao ở một nhiệt độ nhất định thƣờng làm sẫm màu sản phẩm do quá trình caramel hóa. Có thể tẩy trắng dextrin với các peroxide hydrogen và bisulfite natri trong hệ thống acid hay peborat natri trong dung dịch kiềm. 17 2.5.3. Qui trình sản xuất dextrin (Nguyễn Xuân Thủy, 2001) Dung dịch tinh bột pH thích hợp Hồ hóa t o = 90 – 100oC t = 2 - 3 phút + enzyme Dịch hóa t o thích hợp t = 30 – 150 phút Bất hoạt enzyme Gia nhiệt Hạ pH Ly tâm Dung dịch dextrin có lẫn các loại đƣờng Tủa dextrin bằng cồn 96o Ly tâm loại nƣớc và đƣờng hòa tan Dextrin sấy khô Sơ đồ 2.1. Tóm tắt qui trình điều chế dextrin từ tinh bột 18 2.5.4. Ứng dụng Dextrin là sản phẩm trung gian giữa tinh bột và đƣờng đơn hay đƣờng đôi. Bản chất là đƣờng nên chúng tƣơng đối đƣợc cơ thể dễ hấp thu hơn tinh bột. Dextrin đƣợc sử dụng rộng rãi trong công nghiệp vì chúng không có độc tố và giá thành thấp. Đƣợc sử dụng nhƣ dịch keo có thể hòa tan trong nƣớc nhƣ hồ dán, dùng làm tác nhân hóa dày trong chế biến thực phẩm và tác nhân kết dính trong dƣợc phẩm. Đƣờng malto-dextrin chủ yếu dùng làm thức ăn cho trẻ em, thực phẩm ăn kiêng với lƣợng nhỏ calo pha loãng (Janusz vaf Anna, 2004), làm chất thơm hay màu thực phẩm, dùng trong công nghiệp dƣợc phẩm. Một số dextrin đƣợc sử dụng thay thế cho chất béo trong các sản phẩm nhƣ bơ và mỡ gầy. Trong công nghiệp rƣợu bia, dextrin đƣợc đƣa vào để ổn định lƣợng dextrin trong sản phẩm, vừa là cơ chất cho quá trình lên men vừa tăng chất lƣợng, tạo cảm quan tốt cho sản phẩm. Trong y học, dextrin đƣợc pha chế với glucose 5%, NaCl 9‰ hay sorbitol 5% tạo dung dịch huyết tƣơng, dung dịch này dùng để chữa trị cho bệnh nhân mất máu nhiều (Lê Hồng Phú, 2000). 19 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN Khóa luận đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh hóa trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh. Thời gian tiến hành: từ 19/03/2007 đến 19/07/2007. 3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU  Nguồn gốc vi khuẩn Giống vi khuẩn Bacillus subtilis do công ty TNHH Gia Tƣờng cung cấp.  Nguyên liệu - Cám bắp, bã đậu nành, bột năng Vĩnh Thuận, bột nếp Vĩnh Thuận, bột gạo Vĩnh Thuận, bột bắp Tài Ký.  Thiết bị và dụng cụ - Cân điện tử - Pipet - Tủ lạnh - Micropipet - Bể điều nhiệt - Bercher - Nồi hấp - Erlen - Tủ sấy - Bình định mức - Máy ly tâm - Ống đong - Máy đo mật độ quang - Khay nhựa…  Hóa chất - Cồn 96% - Iod - NaCl - HCl - NaOH - Na2HPO4 - (NH4)2SO4 - NaH2PO4 … 20  Các loại môi trƣờng Môi trƣờng giữ giống (môi trƣờng nƣớc chiết giá đậu đƣờng pepton agar). Môi trƣờng nhân giống (môi trƣờng nƣớc chiết giá đậu đƣờng pepton). Môi trƣờng nuôi cấy bán rắn. Thành phần và tỷ lệ các loại môi trƣờng đƣợc trình bày chi tiết ở mục 1 phần phụ lục. 3.3. PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.3.1. Xác định mật độ tế bào Bacillus subtilis trong dịch tăng sinh Cách tiến hành: Dùng que cấy vòng cấy chuyển 1 vòng vi khuẩn B. subtilis từ ống giống vào erlen chứa 20 ml môi trƣờng tăng sinh đã khử trùng, lắc đều và đặt trên máy lắc (120 - 180 vòng/phút). Sau 24 giờ kiểm tra số lƣợng tế bào vi khuẩn trong dịch tăng sinh bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc (đƣợc trình bày ở mục 2.1 và 2.2 của phần phụ lục). 3.3.2. Khảo sát thời gian nuôi cấy tối ƣu Môi trƣờng nuôi cấy bán rắn (35 g/erlen) đƣợc khử trùng ở 1atm trong 45 phút và để nguội khoảng 40 - 50oC. Cấy 5% dịch vi khuẩn đã tăng sinh 24 giờ vào môi trƣờng nuôi cấy. Ủ ở nhiệt độ phòng (30 – 32oC), trong thời gian 24, 36, 48, 60 và 72 giờ. Canh trƣờng sau khi nuôi cấy đƣợc sấy khô ở 50oC. Cân 1 g canh trƣờng đã sấy khô hòa trong 100 ml nƣớc cất, đem ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút ta có dịch enzyme pha loãng 100 lần. Từ dịch pha loãng này tiếp tục pha loãng đến độ pha loãng thích hợp để xác định hoạt tính α- amylase theo phƣơng pháp Heinkel (xem mục 2.5 phần phụ lục). 3.3.3. Khảo sát tỷ lệ tủa enzyme bằng cồn 96% Trong thí nghiệm này dùng phƣơng pháp tủa enzyme bằng cồn 96% lạnh (xem mục 2.3 phần phụ lục). Cân 5 g canh trƣờng đã sấy khô và nghiền nhỏ hòa trong 80 ml nƣớc cất, lắc đều trong 15 phút. Ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch chiết enzyme. 21 Hoạt độ α-amylase sau tủa Lƣợng protein sau tủa Lấy 10 ml dịch chiết enzyme trên đem tủa với cồn 96% đã để lạnh khoảng 4 o C theo các tỷ lệ 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 và 1:5, lắc đều, để lạnh trong 15 phút rồi lấy ra đem ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút. Loại bỏ cồn, thu cặn lắng và hòa trong 5 ml đệm acetate pH = 5,0. Định mức với nƣớc cất thành 100 ml. Hút 1 ml dịch enzyme này đem định lƣợng protein theo phƣơng pháp Lowry (xem mục 2.6 phần phụ lục) và xác định hoạt tính theo phƣơng pháp Heinkel. Hiệu suất thu hồi hoạt độ amylase từ 10 ml DCE đƣợc tính theo công thức: H (%) = x 100 Hiệu suất thu hồi protein từ 10 ml DCE đƣợc tính theo công thức: H (%) = x 100 3.3.4. Khảo sát tỷ lệ tủa enzyme bằng (NH4)2SO4 Tƣơng tự, chuẩn bị dịch chiết enzyme từ canh trƣờng giống nhƣ phần tủa bằng cồn 96%. Cân chính xác lƣợng muối (NH4)2SO4 (xem mục 2.6 phần phụ lục). Cho từ từ vào các erlen chứa 10 ml dịch enzyme đã để lạnh, lắc đều trong 10 phút. Sau đó đem để lạnh. Sau 10 phút, đem ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 10 phút. Các bƣớc kế tiếp tiến hành giống nhƣ phần tủa bằng cồn 96%. 3.3.5. Khảo sát thời gian tủa cồn 96% Các bƣớc tiến hành giống nhƣ phần khảo sát tỷ lệ cồn, nhƣng thể tích cồn ở thí nghiệm này không thay đổi. Tỷ lệ cồn 96% và enzyme là tỷ lệ thích hợp đã xác định đƣợc ở mục 3.3.3. Kiểm tra hoạt tính α-amylase và định lƣợng protein với thời gian tủa là 15, 30, 45, 60 và 75 phút. Hoạt độ α-amylase trƣớc tủa Lƣợng protein sau tủa 22 3.3.6. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng năng thủy phân tinh bột của chế phẩm α-amylase 3.3.6.1. Nhiệt độ phản ứng Cân 0,03 g chế phẩm α-amylase tinh sạch sơ bộ bằng cồn 96% đã sấy khô hòa trong 50 ml nƣớc cất, pha loãng thêm 100 lần. Đo hoạt tính α-amylase theo phƣơng pháp Heinkel ở các giá trị nhiệt độ: 30, 40, 45, 50, 55, 60 và 65oC. 3.3.6.2. pH Tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của các giá trị pH: 5,8; 6,0; 6,2; 6,4 và 6,6 lên hoạt độ α-amylase ở nhiệt độ thích hợp. Kiểm tra hoạt tính α-amylase ở mỗi giá trị pH theo phƣơng pháp Heinkel. 3.3.7. Khảo sát tỷ lệ cồn 96% thích hợp để thu dextrin Tinh bột sau khi hồ hóa đƣợc để nguội đến nhiệt độ thích hợp và cho chế phẩm enzyme (CPE) đã pha loãng vào (xem mục 2.7 phần phụ lục). Sau 30 phút đem ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ tinh bột thừa. Dịch ly tâm đƣợc cho vào các erlen có chứa cồn theo các tỷ lệ 1:2, 1:3 và 1:4, ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút, loại dịch cồn và cân lƣợng dextrin thu đƣợc. 3.3.8. Khảo sát khả năng thủy phân tinh bột của chế phẩm α-amylase 3.3.8.1. Khảo sát khả năng thủy phân với các nguồn tinh bột Thực hiện phản ứng thủy phân với các nguồn tinh bột khác nhau: bột gạo, bột năng, bột nếp, bột bắp ở nồng độ 10%. Tiến hành: 2 g tinh bột đƣợc hồ hóa trong 18 ml dung dịch đệm ở giá trị pH tối ƣu; làm nguội đến nhiệt độ thích hợp và cho vào 0,5 ml chế phẩm α-amylase đã pha loãng 200, 400, 600 lần, khuấy đều, liên tục. Sau 10 phút, cho 5 ml HCl 5% để dừng phản ứng. Ly tâm loại bỏ tinh bột thừa, dịch ly tâm đƣợc tủa cồn để thu dextrin. Cân lƣợng dextrin tạo thành và so sánh khối lƣợng dextrin có đƣợc giữa các nguồn tinh bột. 23 Dextrin thu đƣợc (g) Tinh bột ban đầu (g) Hiệu suất thu dextrin tính theo công thức: H (%) = x 100 3.3.8.2. Khảo sát nồng độ tinh bột thích hợp Sau khi chọn đƣợc nguồn tinh bột thích hợp, tiến hành khảo sát lƣợng dextrin tạo thành ở các nồng độ tinh bột là 10%, 15% và 20%. Cho thể tích và độ pha loãng CPE thích hợp vào 20 g hồ tinh bột với nồng độ tinh bột 10% và 15% và 20%. Thời gian khảo sát là 10, 20, 30 và 40 phút. 3.4. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU Số liệu đƣợc xử lý sai số và vẽ đồ thị, biểu đồ bằng phần mềm Microsoft Excel 2003. 24 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN NUÔI CẤY B. SUBTILIS Tiến hành thí nghiệm theo phần 3 mục 3.3.2, canh trƣờng nuôi cấy sau các thời điểm 24, 36, 48, 60, 72 giờ đƣợc kiểm tra hoạt tính bằng phƣơng pháp Heinkel. Thời gian nuôi cấy 48 giờ α-amylase có hoạt độ cao nhất là 468865 UI/g canh trƣờng (CT). Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày ở bảng 4.1 và đồ thị 4.1. Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt độ α-amylase Thời gian (giờ) Độ pha loãng ∆OD Tinh bột bị thủy phân (mg/ml) Hoạt độ (UI/g CT) 24 10000 0,296 ± 0,0006 5,227 ± 0,011 52272 ± 105 36 80000 0,261 ± 0,0018 4,585 ± 0,032 366817 ± 3802 48 100000 0,267 ± 0,0012 4,689 ± 0,021 468865 ± 2108 60 100000 0,252 ± 0,0017 4,427 ± 0,030 442700 ± 3042 72 100000 0,231 ± 0,0009 4,044 ± 0,016 404365 ± 1610 Trong khoảng thời gian nuôi cấy từ 24 - 36 giờ hoạt độ của amylase tăng nhanh là do Bacillus subtilis trong giai đoạn phát triển và phân chia tối đa. Tại thời điểm 48 giờ, mật độ B. subtilis ổn định và lƣợng α-amylase sinh ra đạt cực đại nên hoạt độ α-amylase lúc này cao nhất. Từ 48 giờ trở đi, vi khuẩn chết dần do cạn dinh dƣỡng và hầu nhƣ không sinh α-amylase nữa; trong khi đó, lƣợng nƣớc có trong canh trƣờng trong thời gian dài làm hoạt độ α-amylase giảm dần. 25 52272 468865 404365 442700 366817 0 100000 200000 300000 400000 500000 24 36 48 60 72 Thời gian (giờ) H oạ t đ ộ ( UI /g C T) Đồ thị 4.1. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt độ α-amylase 4.2. KẾT QUẢ TINH SẠCH SƠ BỘ α-AMYLASE BẰNG CỒN 96% VÀ (NH4)2SO4 4.2.1. Kết quả khảo sát tỷ lệ tủa enzyme bằng cồn 96% Hoạt độ α-amylase trƣớc tủa là 50205,64 (UI/10ml dịch chiết enzyme), hàm lƣợng protein có trong 10 ml dịch chiết enzyme trƣớc tủa là 97,032 mg/10ml. Sau khi tủa, ly tâm loại bỏ cồn và đo hoạt tính bằmg phƣơng pháp Heinkel kết hợp định lƣợng protein bằng phƣơng pháp Lowry theo phần 3 mục 3.3.3; chúng tôi ghi nhận ở tỷ lệ cồn 96% và enzyme là 3:1, α-amylase có hoạt độ cao nhất là 45607,75 Hình 4.2. Canh trƣờng nuôi cấy sau 48 giờ Hình 4.1. Môi trƣờng bán rắn trƣớc khi nuôi cấy 26 4367 43219 44284 45608 44056 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 1 2 3 4 5 Vcồn/Venzyme H oạ t đ ộ (U I/1 00 m l C P tƣ ơi ) UI/100ml chế phẩm α-amylase tƣơi). Kết quả khảo sát đƣợc trình bày ở bảng 4.2 và đồ thị 4.2. Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ cồn 96% lên khả năng tủa α-amylase Enzyme/cồn Protein (mg/100ml CP tƣơi) Hiệu suất thu hồi protein (%) Hoạt độ (UI/100ml CP tƣơi) Hiệu suất thu hồi hoạt độ (%) 1:1 10,462 ± 0,232 10,78 4366,90 ± 190,003 8,698 1:2 15,963 ± 0,568 16,45 44056,08 ± 80,497 87,751 1:3 21,756 ± 0,232 22,42 45607,75 ± 185,067 90,842 1:4 23,127 ± 0,154 23,83 44284,27 ± 109,698 88,206 1:5 23,696 ± 0,154 24,42 43219,40 ± 270,422 86,085 Đồ thị 4.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ cồn 96% lên khả năng tủa α-amylase Ở tỷ lệ 1:1, nồng độ cồn còn thấp chỉ kết tủa đƣợc một lƣợng nhỏ protein (α-amylase) nên hoạt độ α-amylase thấp. Nhƣng ở tỷ lệ 4:1 và 5:1, tuy lƣợng protein thu đƣợc cao hơn, song hoạt độ α-amylase lại thấp hơn tỷ lệ 3:1 là do ở hai tỷ lệ trên nồng độ cồn quá cao đã làm protein bị biến tính nên hoạt độ α-amylase giảm. 27 31835 36916 37575 37281 3693 10000 20000 30000 40000 50000 50 55 60 65 70 (NH4)2SO4 (% độ bão hòa) H oạ t đ ộ (U I/1 00 m l C P tƣ ơi ) 4.2.2. Kết quả khảo sát tỷ lệ tủa α-amylase bằng (NH4)2SO4 Thí nghiệm đƣợc tiến hành theo phần 3 mục 3.3.4. Kết quả ghi nhận ở bảng 4.3 và đồ thị 4.3. Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của (NH4)2SO4 lên khả năng tủa α-amylase Độ bão hòa (%) Hàm lƣợng protein (mg/100 ml CPtƣơi ) Hiệu suất thu hồi protein (%) Hoạt độ (UI/100 ml CP tƣơi ) Hiệu suất thu hồi hoạt độ (%) 50 14,805 ± 0,118 15,02 31835,132 ± 205,852 61,73 55 15,846 ± 0,101 16,08 36916,077 ± 73,132 71,58 60 16,293 ± 0,195 16,53 37575,282 ± 20,283 72,86 65 16,683 ± 0,108 16,92 37281,175 ± 123,378 72,29 70 19,037 ± 0,166 19,31 36926,219 ± 126,669 71,60 Đồ thị 4.3. Ảnh hƣởng của (NH4)2SO4 lên khả năng tủa α-amylase Tủa bằng (NH4)2SO4 ở 60% độ bão hòa, α-amylase có hoạt độ cao nhất. Ở 70%, hoạt độ α-amylase giảm, do nồng độ muối quá cao làm biến tính protein. Theo bảng 4.2 và 4.3, tủa bằng cồn 96% hoạt độ của α-amylase và lƣợng protein thu hồi đƣợc cao hơn khi tủa bằng (NH4)2SO4. Vì vậy, chúng tôi chọn cồn 96% là tác nhân thích hợp dùng để tủa α-amylase. 28 50369 48742 45942 45729 44497 30000 40000 50000 60000 15 30 45 60 75 Thời gian (phút) H oạ t đ ộ (U I/1 00 m l C P tƣ ơi ) 4.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN TỦA CỒN 96% Tiến hành thí nghiệm khảo sát thời gian tủa theo phần 3 mục 3.3.5. Theo kết quả ghi nhận ở bảng 4.4, thời gian tủa tốt nhất đối với α-amylase là 15 phút. Thời gian tủa càng dài lƣợng protein thu đƣợc càng nhiều nhƣng hoạt độ của α-amylase không tăng do lƣợng α-amylase bị biến tính tăng theo thời gian tiếp xúc với cồn 96%. Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của thời gian tủa cồn 96% lên khả năng tủa α-amylase Thời gian tủa (phút) Hàm lƣợng protein (mg/100ml CP tƣơi) Hiệu suất thu hồi potein (%) Hoạt độ (UI/100ml CP tƣơi) Hiệu suất thu hồi hoạt độ (%) 15 21,493 ± 0,134 22,15 50369,23 ± 139,424 93,24 30 22,164 ± 0,127 22,84 48741,50 ± 30,425 90,23 45 23,069 ± 0,101 23,77 45942,42 ± 91,274 85,05 60 23,842 ± 0,228 24,57 45729,45 ± 121,699 84,65 75 24,324 ± 0,077 25,07 44497,24 ± 290,234 82,37 Đồ thị 4.4. Ảnh hƣởng của thời gian tủa cồn 96% lên khả năng tủa α-amylase 29 1229194 910748 1327061 1256069 963484943708 838742 500000 700000 900000 1100000 1300000 1500000 30 35 40 45 50 55 60 65 Nhiệt độ ( o C) H oạ t đ ộ (U I/g C PE ) 4.4. KẾT QUẢ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG THỦY PHÂN TINH BỘT CỦA CHẾ PHẨM α-AMYLASE Thực hiện thí nghiệm theo phần 3 mục 3.3.6. Sau khi đo hoạt tính bằng phƣơng pháp Heinkel, chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau: 4.4.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt độ của α-amylase Nhiệt độ (oC) ∆OD Tinh bột bị thủy phân (mg) Hoạt độ (UI/g CPE) 30 0,285 ± 0,0041 5,032 ± 0,075 838742 ± 12462 40 0,320 ± 0,0018 5,662 ± 0,032 943708 ± 5366 45 0,326 ± 0,0015 5,781 ± 0,027 963484 ± 4421 50 0,423 ± 0,0010 7,536 ± 0, 18 1256 69 ± 3042 55 0,446 ± 0,0009 7,962 ± 0,016 1327060 ± 2683 60 0,414 ± 0,0018 7,375 ± 0,032 1229194 ± 5366 65 0,309 ± 0,0038 5,464 ± 0,069 910748 ± 11519 Đồ thị 4.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt độ của α-amylase 30 Theo số liệu bảng 4.5 cho thấy nhiệt độ tối ƣu của α-amylase là 55oC với hoạt độ cao nhất là 1327061 (UI/g chế phẩm enzyme). Ở 60oC, hoạt độ α-amylase bắt đầu giảm xuống. 4.4.2. Ảnh hƣởng của pH Cố định ở nhiệt độ tối thích là 55oC, thực hiện phản ứng thủy phân với giá trị pH thay đổi theo phần 3 mục 3.3.6.2. Kết quả đƣợc ghi nhận ở bảng 4.6 và đồ thị 4.6. pH 5,8 6,0 6,2 6,4 6,6 Hình 4.3. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của α-amylase Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của α-amylase pH ∆OD Tinh bột bị thủy phân (mg/ml) Hoạt độ (UI/g CPE) 5,8 0,433 ± 0,0033 7,734 ± 0,060 1255562 ± 9988 6,0 0,438 ± 0,0035 7,810 ± 0,064 1301707 ± 10685 6,2 0,419 ± 0,0013 7,469 ± 0,024 1244914 ± 4057 6,4 0,421 ± 0,0009 7,515 ± 0,016 1238829 ± 2683 6,6 0,402 ± 0,0003 7,156 ± 0,006 1192684 ± 1014 Từ bảng 4.6, chúng tôi thấy ở 55oC, pH tối ƣu của α-amylase là 6,0 với hoạt độ là 1301707 (UI/g chế phẩm enzyme). 31 1192684 1238829 1244914 1301707 1255562 1000000 1100000 1200000 1300000 1400000 5,8 6 6,2 6,4 6,6 pH H oạ t đ ộ (U I/g C PE ) 0,31 1,29 1,18 1,17 0,0 0,5 1,0 1,5 1 2 3 4 Vcồn/Vdextrin D ex tr in (g ) Đồ thị 4.6. Ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của α-amylase 4.5.