Khóa luận Nuôi cấy mô cây Dầu mè (Jatropha curcas L.)

về mặt hoá học đã đƣợc thí nghiệm. Một vài chất này đã thể hiện các đặc tính tƣơng tự nhƣ các đặc tính của chất auxin, nhƣng thƣờng với các liều lƣợng thấp hơn, hơn nửa chúng ít bị kiểm soát bởi các enzyme và có thể có một tác động kéo dài trong đó có NAA. Trong lĩnh vực nuôi cấy in vitro, những chất này đã chiếm một vị trí quan trọng, hai tính chất đƣợc nghiên cứu nhiều là kích thích sự phân chia tế bào và sự hình thành rễ (Trần Văn Minh, 2004). Auxin chẳng những kích thích sự tăng trƣởng của chồi non mà còn khởi phát cho sự tạo mới. Ở nồng độ thấp và thƣờng dùng kết hợp với cytokinin thì auxin khởi phát mô phân sinh ngọn, vƣợt quá nồng độ giới hạn thì auxin ngăn cản sự phát triển của lá mới hay của mô phân sinh bên (Bùi Trang Việt, 2000).  Cytokinin: Các cytokinin kích thích mạnh sự phân chia tế bào với điều kiện có sự hiện diện của auxin. Cytokinin cũng giúp sự gia tăng kích thƣớc tế bào và sinh tổng hợp protein. Cytokinin ngăn cản sự lão hoá mô, thúc đẩy sự hình thành chồi non nhƣng lại ức chế sự tạo rễ (Dƣơng Công Kiên, 2002). Sự sinh trƣởng tổng hợp Cytokinin ở trong cây xảy ra ở những vùng rất khác nhau, đặc biệt là ở những nơi có sự phân chia tế bào mạnh (ở ngọn thân hay rễ). Nó hiện diện hầu hết trong các mô, đặc biệt trong hạt, trái và trong rễ. Tuy nhiên, rễ là nơi tổng hợp nhiều nhất. Vì vậy khi rễ bị tổn thƣơng thì thấy nụ phát triển yếu do không tạo đủ cytokinin. Nó hoạt hoá sự phân bào, song tác động này chỉ thể hiện 14 trong sự phối hợp với auxin (Trần Văn Minh, 2004). Trong nuôi cấy mô, cytokinin thể hiện các tính chất cho phép chúng ta giải quyết những khó khăn trong việc duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào và định hƣớng tế bào trong con đƣờng phân hoá (Trần Văn Minh, 2004).  Gibberellin: Hiệu ứng chính của các gibberellin là kéo dài thân, kích thích sự kéo dài lóng. Gibberellin kích thích mạnh sự phân chia tế bào mô vỏ và biểu bì. Kích thích sự kéo dài lóng, vừa do sự kéo dài vừa do sự phân chia tế bào thân, là đặc tính nổi bật của gibberellin. Xử lý gibberellin làm tăng năng suất mía cây và đƣờng (do kích thích sự kéo dài lóng). Gibberellin liều cao (hay phối hợp với cytokinin) kích thích mạnh sự tăng trƣởng lá. Trên lá yến mạch hay diệp tiêu lúa, gibberellin chỉ có vai trò làm tăng hiệu ứng auxin (Bùi Trang Việt, 2000). Ảnh hƣởng của than hoạt tính Nồng độ sử dụng thƣờng là từ 0,2 – 3%. Than hoạt tính có những tác dụng sau: Hấp thụ độc tố nâu/đen (hợp chất phenol và melanin) và các độc tố không màu khác. Hấp thụ các hợp chất hữu cơ khác (auxin, cytokinin, ethylene, vitamin, chelate Fe và Zn…). Thúc đẩy sự tạo phôi soma. Ổn định độ pH. 2.1.5.6. Ảnh hƣởng của pH và Agar pH của môi trƣờng nuôi cấy thƣờng ở khoảng 5,8 – 6 thì tốt trong nuôi cấy mô. Nếu pH môi trƣờng thấp hơn 4,5 hoặc cao hơn 7 đều ức chế sự phát triển của mô (Nguyễn Văn Uyển, 1993 và Bùi Bá Bổng, 1995). Agar xuất phát từ rong biển, đƣợc sử dụng nhƣ là chất keo trong hầu hết môi trƣờng dinh dƣỡng. Agar là polysaccharide, trọng lƣợng phân tử cao có khả năng làm đông môi trƣờng. Agar hoà tan hình thành chất keo kết dính với nƣớc và hấp thụ hoá chất. Nồng độ agar thƣờng sử dụng trong nuôi cấy mô là 0,6 – 0,8 %. 15 Trong những năm gần đây sử dụng môi trƣờng hai pha (pha rắn và pha lỏng) trở nên khá phổ biến vì tốc độ nhân giống cao và giảm hiện tƣợng thuỷ tinh thể. Đầu tiên mẫu cấy đƣợc đặt trên môi trƣờng rắn, sau đó thêm vào một lớp môi trƣờng lỏng. Một phần mẫu cấy ở trong môi trƣờng lỏng, một phần ở trong môi trƣờng rắn, một phần ở trong không khí. Nếu nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng cần phải cung cấp oxy tạo sự thoáng khí bằng cách sử dụng máy lắc. Tế bào, mô nuôi cấy có thể bị tổn thƣơng nhƣng thƣờng sinh trƣởng và phát triển tốt vì mẫu cấy hấp thu dinh dƣỡng dễ dàng trên toàn bộ mẫu cấy. 16 2.2. Giới thiệu về cây dầu mè (Jatropha curcas L.) 2.2.1. Vị trí phân loại Giới: Plantae Nghành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Euphorbiale Họ: Euphorbiacea Chi: Jatropha Loài: curcas Jatropha là tên bắt nguồn từ tiếng Hi Lạp: iatros (bác sĩ) và trophe (thục phẩm) ngụ ý dƣợc tính của cây. Theo nhƣ Correll và Correll (1982) curcas là tên của cây dầu mè tại vùng Malabar, Ấn Độ. Hình 2.1: Cây dầu mè (Jatropha curcas L.) 17 Tên bản xứ của cây dầu mè ở một số nƣớc:( Heller, 1996). Physic nut, purging nut (Anh) Pignon d’Inde (Pháp) Purgeernoot (Hà Lan) Purgiernu, Brechnu (Đức) Purgueira (Bố Đào Nha) Fafiola d’India (Ý) Dand barri, habel meluk arand (Hindi) Kadam (Nepal) Yu-lu-tzu (Trung Quốc) Sabudam (Thái Lan) Túbang-bákod (Philippine) Jarak dudeg (Indonesia) Bagani (Cô te d’Ivoire) Kpoti (Togo) Tabanani (Senegal) Mupuluka (Angola) Butuke (Nigeria) Makaen (Tanzania) Pinoncillo (Mexico) Coquillo, tempate (Costa Rica) Tartago (Puerto Rico) Ở Việt Nam cây đƣợc gọi là cây dầu mè hay cây cọc rào (vì thƣờng đƣợc trồng làm rào dậu). 2.2.2. Đặc điểm sinh học 2.2.2.1. Mô tả Cây dầu mè là cây bụi gỗ mềm, thân thẳng cao trung bình 6m với tán rộng. Cành non mập và mọng nƣớc, nhựa cây có màu trắng sữa hay màu vàng nhạt, lá rụng sớm, mọc dày ở phần ngọn. Lá có hình ovan, hoặc hình trái tim, có lá chẻ thùy 18 3 đến 5 thùy. Lá dài 6 – 40cm, rộng 6 – 35cm, cuống dài 2,5 – 7,5cm. Hoa thƣờng nở vào tháng 4 – 5 tạo thành nhiều chùm có màu vàng nhạt, hình chuông. Hoa đực có 10 nhị trong đó 5 nhị dính vào phần chân đế, 5 nhị kết lại thành bó. Hoa cái rời rạc với bầu nhuỵ hình elip, chia làm 3 ô, với 3 núm nhuỵ phân nhánh. Quả có dạng nang, kích thƣớc 2,5 – 4cm về chiều ngang và đƣờng kính. Quả chia thành 3 ngăn, hạt nằm trong các ngăn này. Hạt cây thuôn màu đen kích thƣớc 2 x 1cm. Hình 2.2: Lá và hoa cây dầu mè Hình 2.3: Hoa, quả và hạt cây dầu mè 2.2.2.2. Sinh thái Cây dầu mè có thể phát triển trong các điều kiện khí hậu khô cằn. Điều kiện thích hợp nhất cho cây phát triển là mƣa ít (200mm) nhƣng cây vẫn có thể sống đƣợc ở nơi có lƣợng mƣa cao lên đến 1200mm. Khi gặp hạn hán, cây thích ứng bằng cách rụng hầu hết lá để làm giảm sự thoát hơi nƣớc. Nhiệt độ thích hợp cho cây là 18 – 28,5oC. Điều kiện để hạt nẩy mầm là khí hậu nóng ẩm. Hoa nở trong mùa mƣa và tạo quả trong mùa đông. 19 Có nhiều bằng chứng cho thấy cây dầu mè có nguồn gốc từ Mexicô và Trung Mỹ, nhƣng hiện nay cây đƣợc tìm thấy ở hầu hết các nƣớc có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới nhƣ Brazil, Honduras, Fiji, Ấn Độ, Jamaica, Panama, Puerto Rico và Salvador. Cây dầu mè đã có mặt ở Việt Nam từ trƣớc thế kỷ XIV.Cho đến nay cây đã đƣợc trồng rải rác ở nhiều địa phƣơng: Đức Trọng, Bắc Bình, Lạng Sơn, Hàm Thuận Bắc, Hàm Thuận Nam, Ninh Sơn, Thanh Hoá, Lào Cai, Đồng Nai, thành phố Hồ Chí Minh … 2.2.3. Công dụng 2.2.3.1. Nhựa mủ Nhựa cây dầu mè có chứa các alkaloid nhƣ jatrophine, jatropham, jatrophone và curcain là những chất có tính kháng bệnh ung thƣ. Lá có chứa apigenin, vitexin và isovitexin. Ngoài ra trong lá và cành non còn chứa amyrin, stigmosterol và stigmastenes là những chất có tính kháng khuẩn, chống viêm, chống dị ứng và ôxi hóa. Chất béo có trong hạt cây giàu palmitic, oleic acid và linoleic acid. Hạt cây có tính độc là do thành phần alkaloid curcin của nó. Nhựa cây đƣợc dùng để trị các bệnh ngoài da nhƣ u nhọt, hắc lào, xuất huyết da. Cành non có tác dụng làm sạch răng miệng (NIIR Board of Consultants and Engineers, 2006). 2.2.3.2. Lá, vỏ và rễ cây Lá cây đƣợc chú ý với khả năng kích thích tạo sữa, gây xung huyết da và kháng kí sinh trùng. Lá đƣợc sử dụng để chống ghẻ, thấp khớp, tê liệt, u xơ. Rễ cây có tác dụng tẩy giun sán, chữa rắn cắn. Vỏ cây dùng để thuốc cá, và dùng điều trị các vết thƣơng ngoài da. Nƣớc sắc của vỏ và rễ cây dùng điều trị thấp khớp, bệnh hủi, chứng khó tiêu và tiêu chảy (NIIR Board of Consultants and Engineers, 2006). 2.2.3.3. Hạt và dầu Hạt cây là loại thuốc trị bệnh phù, bệnh gút (gout), chứng liệt và các bệnh về da. Dầu cây dầu mè có tính tẩy rửa. 20 2.2.3.4. Dầu mè và nguyên liệu sinh học Ngoài các tác dụng trị bệnh kể trên, cây dầu mè đƣợc sự chú ý đặc biệt bởi nó là nguồn nguyên liệu sinh học (biofuel). Hạt của cây có độ ẩm (6.62%), protein (18.2%), chất béo (38%), carbohydrate (17.3%), sợi (15.5%) và tro (4.5%). Dầu chiếm 35 – 40% hạt và 50 – 60% nhân hạt. Trong dầu chứa 21% các acid béo không bão hòa. Hạt đƣợc xay và ép lấy dầu hoặc dầu đƣợc tách bằng các dung môi. Tên thƣơng mại của loại dầu này là Jatropha. Dầu sau khi lọc đƣợc sử dụng ngay nhƣ là nguồn nguyên liệu sinh học ở dạng bổ sung, dầu Jatropha có thể trộn với dầu thƣờng với tỉ lệ lên đến 20%. Đây là nguồn năng lƣợng mới an toàn, chi phí thấp và là nguồn năng lƣợng tái sinh đƣợc, hứa hẹn sẽ là nguồn năng lƣợng thay thế cho thủy điện, dầu diessel, dầu lửa, khí hóa lỏng (LPG), than, củi …. Nguồn năng lƣợng này sẽ giúp các nƣớc cắt giảm một khoản tiền cho năng lƣợng và phần nào xóa đi sự mất cân bằng về sử dụng năng lƣợng giữa các vùng. Dầu Jatropha có thể hoàn toàn thay thế cho dầu lửa để sƣởi ấm và nấu ăn. Ƣu điểm là khói từ dầu Jatropha không có mùi và không cay nhƣ khói dầu hỏa và không để lại mùi cho thức ăn sau khi nấu (NIIR Board of Consultants and Engineers, 2006). Việt Nam phải chi khoảng 2 tỉ 410 triệu đô la một năm để nhập khẩu các sản phẩm dầu (năm 2003) và ngày càng tăng theo các năm. Đây là khoản chi rất lớn của ngân sách quốc gia, có ảnh hƣởng đến toàn bộ nền kinh tế. Trong tƣơng lai dầu Jatropha sẽ thay thế dầu diesel bởi nó có những đặc tính lý hóa tƣơng tự nhƣ dầu diesel, các động cơ chạy bằng dầu diesel thƣờng khi chuyển sang sử dụng dầu Jatropha cũng không phải thay đổi nhiều về cấu trúc động cơ. 21 2.2.3.4.1. Hiệu quả kinh tế của dầu Jatropha Bảng 2.1: Năng suất dầu của cây dầu mè Tuổi cây (năm) Năng suất dầu (kg/ha) 1 250 2 1000 3 2500 4 5000 5 8000 6 trở lên 10000 Nguồn: NIIR Board of Consultants and Engineers, 2006 Nhƣ vậy với 1 ha cây dầu mè 6 năm tuổi hằng năm có thể thu đƣợc 10 tấn dầu. Hiện nay giá dầu Jatropha đƣợc bán trên thị trƣờng thế giới với giá khoảng 320 USD/ tấn (Trích từ trang web www.bulkoil.com ngày 7/8/2007). 2.2.3.4.2. Dầu Jatropha so với các loại dầu thực vật khác Trên thế giới hàng năm sản xuất khoảng 110 tỉ tấn dầu thực vật, 70% trong số đó đƣợc sản xuất từ 4 loại cây sau: đỗ tƣơng (26%), dầu cọ (18%), hƣớng dƣơng (13%), cải dầu (12%). [Internet 1] Hình 2.4: Các cây sản xuất dầu thực vật Cây đỗ tƣơng Cây dầu cọ Cây hƣớng dƣơng Cây cải dầu 22 Cây dầu mè so với những cây trên là một cây còn khá mới mẻ, chƣa đƣợc biết nhiều đến. Nhƣng nếu tính về phƣơng diện sản xuất dầu sinh học thì cây dầu mè cho hiệu quả kinh tế lớn hơn rất nhiều bởi cây dầu mè là cây lâu năm có thể tạo quả trong nhiều thâp niên, cây có thể phát triển mà không cần phải chăm sóc nhiều trên những vùng đất khô cằn. 2.2.4. Nhân giống Những nghiên cứu về nhân giống cây dầu mè trên thế giới và ở Việt Nam còn rất hạn chế. Cho đến nay phƣơng pháp nhân giống cây dầu mè chủ yếu vẫn theo lối cổ truyền là giâm cành và gieo hạt. Các phƣơng pháp nhân giống hiện đại áp dụng trên cây dầu mè mới chỉ mới phát triển trong khoảng hơn 10 năm trở lại đây. 2.2.4.1. Phƣơng pháp nhân giống cổ truyền Ở Nam Phi, ngƣời dân trồng cây dầu mè làm rào dậu hoặc trồng cây để chống xói mòn và bảo vệ đất thƣờng sử dụng phƣơng pháp giâm cành vì ƣu điểm của phƣơng pháp này là nhanh chóng tạo đƣợc cây trƣởng thành. Cành đƣợc cắt từ các cây dầu mè đã trƣởng thành cắm xuống đất, nếu đƣợc chăm sóc cẩn thận thì sau khoảng 2 đến 3 tháng là có đƣợc cây đủ lớn để đem trồng. Cây tạo ra từ phƣơng pháp giâm cành sau khoảng 1 năm sẽ bắt đầu sinh sản (NIIR Board of Consultants and Engineers, 2006). Trồng cây để khai thác dầu lâu năm thì phƣơng pháp nhân giống bằng gieo hạt đƣợc sử dụng nhiều hơn. Bởi những nghiên cứu đã chỉ ra rằng, cây tạo thành từ nhân giống bằng giâm cành có đời sống ngắn hơn và khả năng chống hạn và bệnh tật kém hơn cây nhân giống bằng hạt. Rễ của cây giâm cành phát triển yếu dễ bị gẫy đổ (Heller, 1996). Hạt trƣớc khi đem gieo đƣợc lựa chọn là những hạt to, chắc, mẩy. Hạt đƣợc ngâm nƣớc qua đêm để làm tăng tỉ lệ nẩy mầm. Hôm sau, hạt đƣợc gieo vào trong các bầu đất. Hạt sẽ nẩy mầm sau khoảng 1 tuần và cây con có thể đem đi trồng sau 45 ngày. Rễ của cây con mọc từ hạt phát triển, thƣờng có 1 rễ cái và 4 rễ bên. Cây trồng ngoài thực địa sẽ sinh sản sau khoảng 3 – 4 năm (Heller, 1996). Nhƣợc điểm của phƣơng pháp nhân giống bằng hạt là chất lƣợng cây con không đồng nhất bởi cây dâu mè là cây thụ phấn chéo nên giữa các hạt có sự khác nhau về 23 mặt di truyền. Nhƣ xét tính trạng hàm lƣợng dầu trong hạt, các cây tạo ra bằng gieo hạt có hàm lƣợng dầu trong hạt không ổn định, giao động từ 4 đến 40 % (Timir baran Jha và ctv, 2007). Trong khi kiểm tra chất lƣợng hạt giống là một việc khó khăn thì tỉ lệ sống và nẩy mầm của hạt thấp do đó nhân giống bằng phƣơng pháp gieo hạt không thể đáp ứng đủ nhu cầy cây giống chất lƣợng tốt cho việc trồng cây trên qui mô công nghiệp. 2.2.4.2. Phƣơng pháp nhân giống hiện đại Các phƣơng pháp nhân giống hiện đại có ƣu điểm lớn là có khả năng tạo giống cây với số lƣợng lớn trong khoảng thời gian ngắn với chất lƣợng cao và đồng nhất. Tuy nhiên những nghiên cứu này còn ít hoặc ít đƣợc công bố. Năm 1995, M. Sujatha và N. Mukta đã phát triển kĩ thuật tái sinh cây dầu mè từ nhiều bộ phận khác nhau của cây nhƣ phần trụ dƣới lá mầm, cuống lá và lá. Sự tạo thành chồi non bất định đƣợc chứng minh là hiệu quả nhất ở môi trƣờng MS bổ sung 2,22 M BA và 4,9 M IBA. Sau đó mô sẹo đƣợc tái sinh gián tiếp trên môi trƣờng MS bổ sung 0,44 M BA và 0,49 M IBA. Chồi non hình thành đƣợc nuôi và tạo rễ trong môi trƣờng MS không bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng cho đến khi phát triển thành cây hoàn chỉnh để đƣa ra vƣờn ƣơm. Năm 2005, M. Sujatha và các cộng sự đã thành công trong nhân giống in vitro cây dầu mè bằng phƣơng pháp tạo cụm chồi. Nghiên cứu đã tạo chồi non bằng cách nuôi nách lá cây dầu mè trên môi trƣờng MS bổ sung TDZ nồng đô 2,3 – 4,5 % sau đó chuyển sang môi trƣờng MS bổ sung IBA và BA. Hiệu quả tạo chồi cao 10 – 12,3 chồi/mẫu cấy. Việc tạo chồi bất định từ lá thu đƣợc bằng cách nuôi mẫu lá trên môi trƣờng bổ sung 8,9 – 44,4 M BA + 4,9 M indole-3-butyric acid (IBA) để tạo thành mô sẹo có màu trắng xanh, các chồi bất định sẽ đƣợc tạo thành sau khoảng 3 tuần sau đó chuyển sang môi trƣờng bổ sung 8,9 M BA + 2,5 M IBA. Phƣơng pháp phát sinh phôi từ tế bào soma (somatic embryogenesis) - một công cụ mạnh của nghành công nghệ sinh học để tạo giống cây trồng – đã đƣợc áp dụng thành công lần đầu tiên trên cây dầu mè bởi Timir baran Jha và các cộng sự 24 (Timir baran Jha và ctv, 2007). Sụ phát sinh phôi soma đƣợc tạo ra bằng nuôi mẫu lá trên môi trƣờng MS có các chất kích thích sinh trƣởng thực vật Kinetin và IBA, phôi đƣợc khích thích phát triển bằng cách bổ sung thêm adenine sulphate trong môi trƣờng. Các phôi soma chín sẽ tạo các cây non trên môi trƣờng ½ MS. Toàn bộ quá trình nhân giống kéo dài 12 – 16 tuần. Đây là nghiên cứu tiền đề cho những nghiên cứu về chuyển gen trên cây dầu mè về sau. 25 Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc tiến hành từ tháng 2 đến tháng 7 năm 2007 tại Phòng thí nghiệm trọng điểm phía Nam về Công nghệ tế bào Thực Vật, Viện Sinh Học Nhiệt Đới thuộc Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam tại TP.HCM. 3.2. Vật liệu 3.2.1. Đối tƣợng thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên cây dầu mè (Jatropha curcas L.) đƣợc trồng tại vƣờn giống Viện Sinh Học Nhiệt Đới thuộc Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam tại Thành phố Hồ Chí Minh. 3.2.2. Trang thiết bị và dụng cụ Thiết bị: tủ vô trùng, nồi hấp, máy đo pH, cân điện tử, máy lạnh, nhiệt kế, ẩm kế, kệ đặt bình, đèn neon,… Dụng cụ: pince, kéo, dao cấy, bình thuỷ tinh 500ml, đĩa, đèn cồn. 3.2.3. Môi trƣờng nuôi cấy Các môi trƣờng đƣợc sử dụng gồm: Môi trƣờng MS, ½ MS, WPM, ½ WPM. Trong đó môi trƣờng ½ MS và ½ WPM là môi trƣờng MS và WPM mà thành phần đa lƣợng đƣợc giảm đi một nửa. - Môi trƣờng MS cải tiến (Murashige và Skoog, 1962) Thành phần Nồng độ (mg/l) Khoáng đa lƣợng NH4NO3 1650 KNO3 1900 CaCl2.2H2O 440 MgSO4.7H2O 370 KH2PO4 170 26 Khoáng vi lƣợng MnSO4.4H2O 23,3 ZnSO4.7H2O 8,6 H3BO3 6,2 KI 0,83 Na2MoO4.2H2O 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 Sắt EDTA Na2.EDTA 37,3 FeSO4.7H2O 27,8 Vitamin myo-Inositol 100 Thiamin (B1) 0,1 Nicotinic acid 0,5 Pyridoxine HCl 0,5 Glycine 2 - Môi trƣờng WPM ( Llooyd và McCown, 1981) Thành phần Nồng độ (mg/l) Khoáng đa lƣợng NH4NO3 400 CaNO3 556 K2SO4 990 CaCl2 96 KH2PO4 170 MgSO4 370 Sắt EDTA FeNa2EDTA 65,1 Khoáng vi lƣợng MnSO4.4H2O 23,3 27 ZnSO4.7H2O 8,6 H3BO3 6,2 KI 0,83 Na2MoO4.2H2O 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 Vitamin myo-Inositol 100 B1 1 B6 0,5 Nicotinic acid 0,5 Glycine 2 Các chất điều hoà sinh trƣởng thực vật đƣợc sử dụng là BA, IBA (mg/l). Các thành phần khác: Đƣờng sucrose 30 g/l Agar 7,5 /l Môi trƣờng đƣợc điều chỉnh về pH=5,8 ± 0,05 (bằng KOH 1N và HCl 1N) trƣớc khi hấp khử trùng bằng autoclave ở 1atm (1210C) trong 20 phút. 3.2.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro Thời gian chiếu sáng 8 giờ/ngày Nhiệt độ 25 2oC Độ ẩm 50 – 60 % Cƣờng độ ánh sáng 2000-3000 lux 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1. Phƣơng pháp khử trùng mẫu - Ngoài tủ cấy: Chồi đƣợc cắt dài khoảng 3 cm từ đỉnh chồi. Hạt đƣợc lấy từ những quả chín. Hạt phải có màu đen, chắc, mẩy. 28 Chồi đƣợc cắt bỏ lá non, rửa sạch nhiều lần dƣới vòi nƣớc máy, sau đó rửa trong dung dịch nƣớc xà phòng 0,1 % trong 15 phút và đƣợc rửa lại bằng nƣớc máy bình thƣờng. Hạt đƣợc rủa sạch bằng nƣớc, dùng dao cạo bỏ lớp vở lụa mềm màu đen bên ngoài hạt, sau đó đƣợc rửa bằng xà phòng 0,1% trong 30 phút và đƣợc rủa lại bằng nƣớc máy nhiều lần. - Trong tủ cấy vô trùng: Rửa chồi và hạt bằng nƣớc cất vô trùng Lắc cồn 700 trong 30 giây Rửa lại 3 lần bằng nƣớc cất vô trùng Ngâm trong Natri hypochlorit (NaOCl) - nồng độ và thời gian theo thí nghiệm. Rửa lại 3 lần bằng nƣớc cất vô trùng. 3.3.2. Bố trí thí nghiệm Các thí nghiệm đều đƣợc bố trí theo kiểu thí nghiệm đơn yếu tố và hoàn toàn ngẫu nhiên. Mỗi thí nghiệm lập lại 3 lần và ở mỗi lần lập lại cấy 3 bình, trong mỗi bình cấy 3 mẫu. Mỗi bình chứa 50 ml môi trƣờng. 3.3.2.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của nồng độ chất khử trùng và thời gian khử mẫu đến tỉ lệ sống của mẫu cây dầu mè Mẫu cấy sau khi đƣợc khử trùng trong tủ cấy sẽ đƣợc cắt theo từng đốt đều nhau dài khoảng 0,5 – 1 cm, loại bỏ những phần bị ngấm chất khử trùng rồi cấy vào các bình tam giác chứa 50 ml môi trƣờng. Hạt đƣợc tách bỏ lớp vỏ cứng bằng kềm, pince và dao sau đó đƣợc cấy vào bình tam giác chứa 50 ml môi trƣờng. Thời gian thực hiện: 7 – 10 ngày Môi trƣờng thí nghiệm: MS Hóa chất đƣợc sử dụng là Natri hypochlorit (10 – 30 %) Vật liệu thí nghiêm: thí nghiệm đƣợc thực hiện với 2 đối tƣợng là chồi và hạt cây dầu mè. 29 Bảng 3.1: Ảnh hƣởng của nồng độ NaOCl và thời gian xử lý vô trùng mẫu Nghiệm thức Nồng độ Natri hypochlorit (%) Thời gian (phút) 1 10 15 2 10 30 3 10 45 4 10 60 5 15 15 6 15 30 7 15 45 8 15 60 9 20 15 10 20 30 11 20 45 12 20 60 Chỉ tiêu theo dõi : 3.3.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát môi trƣờng khoáng cơ bản thích hợp để nuôi cấy mô cây dầu mè in vitro Do cây dầu mè là một cây còn khá mới mẻ ở Việt Nam, các đề tài nghiên cứu về nuôi cấy in vitro cây dầu mè chƣa nhiều. Việc tìm kiếm các tài liệu về nuôi cấy mô cây này là khá khó khăn và có rất ít. Do đó, chúng tôi muốn thực hiện một thí nghiệm cơ bản: khảo sát môi trƣờng khoáng thích hợp để có thể duy trì sự phát triển của mẫu cấy trong điều kiện in vitro. Thí nghiệm đƣợc tiến hành với 4 loại môi trƣờng: MS, ½ MS, WPM và ½ WPM. Tỷ lệ mẫu sống vô trùng (%) = Số mẫu sống không bị nhiễm khuẩn, nấm X 100 Tổng số mẫu cấy 30 Đối tƣợng nghiên cứu: chồi non in vitro mọc lên từ hạt đã đƣợc khử trùng và nuôi cấy trong môi trƣờng MS trong thí nghiệm 1 sau sau khoảng thời gian 7 – 10 ngày. Sau khi hạt nẩy chồi, cắt mẫu dài khoảng 1 cm từ ngọn và cấy vào các môi trƣờng thí nghiệm. Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức mỗi nghiệm thức cấy 10 mẫu. Bảng 3.2: Thí nghiệm xác định môi trƣờng khoáng cơ bản Nghiệm thức Môi trƣờng 1 MS 2 ½ MS 3 WPM 4 ½ WPM Chỉ tiêu theo dõi: o Tỉ lệ sống (%) o Tỉ lệ nảy chồi (%) o Phù gốc (+/-) 3.3.2.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của BA đến khả năng tạo chồi của cây dầu mè. Sau khi xác định môi trƣờng khoáng cơ bản trong thí nghiệm 2, chúng tôi bổ sung BA nồng độ thay đổi từ 0 – 0,5 mg/l. Thí nghiệm gồm có 4 nghiệm thức đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố, mỗi nghiệm thức có 3 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức cấy 3 bình tam giác có chứa 50 ml môi trƣờng nuôi cấy. Mỗi bình cấy 3 mẫu. Thời gian lấy số liệu 1 tháng. Mục tiêu của thí nghiệm này là xác định nồng độ BA nào thích hợp cho nuôi cấy tạo chồi cây dầu mè in vitro. Dựa vào tài liệu tham khảo và quá trình thí nghiệm thăm dò nồng độ BA đƣợc chia theo các mức sau: 31 Bảng 3.3: Ảnh hƣởng của nồng độ BA đến khả năng tạo cụm chồi in vitro cây dầu mè Nghiệm thức Môi trƣờng BA (mg/l) 1 Khoáng cơ bản TN2 0 2 Khoáng cơ bản TN2 0,1 3 Khoáng cơ bản TN2 0,3 4 Khoáng cơ bản TN2 0,5 Đối tƣợng nghiên cứu: chồi non in vitro mọc lên từ mẫu cấy chồi hoặc hạt đã đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MS trong thí nghiệm 1 sau 7 – 10 ngày. Chỉ tiêu theo dõi: o Số chồi phát sinh/1 mẫu cấy o Chiều cao chồi (mm) o Số lá/1 mẫu cấy 3.3.2.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của BA và IBA đến khả năng tạo chồi của cây dầu mè trong điều kiện in vitro Mục đích của thí nghiệm là khảo sát sự tác động đồng thời của BA và IBA đến khả năng phát sinh chồi của cây dầu mè. Trong thí nghiệm IBA đƣợc bổ sung ở 1 mức thấp 0,01 mg/l, BA đƣợc bổ sung ở các mức khác nhau 0 mg/l; 0,1 mg/l; 0,3 mg/l; 0,5 mg/l. Thí nghiệm này có 6 nghiệm thức bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố. Mỗi nghiệm thức lặp lại ba lần và mỗi nghiệm thức cấy vào ba bình tam giác. Trong mỗi bình tam giác cấy ba mẫu. Thời gian lấy số liệu 6 tuần. 32 Bảng 3.4: Ảnh hƣởng của BA và IBA đến sự tạo chồi của cây dầu mè Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ IBA (mg/l) 1 0 0 2 0,1 0,01 3 0,3 0,01 4 0,5 0,01 Chỉ tiêu theo dõi: 1. Số chồi/1 mẫu 2. Chiều cao chồi (mm) 3. Số lá/1 mẫu 4. Sự tạo mô sẹo (+/-) 3.3.2.5. Thí nghiệm 5: Nuôi cấy tạo rễ cây dầu mè in vitro Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ IBA thích hợp cho quá trình tạo rễ của cây dầu mè in vitro nhằm chuẩn bị cây con khoẻ mạnh để đƣa ra vƣờn ƣơm. Đối tƣợng nghiên cứu: Các chồi phát sinh sau khi thực hiện các thí nghiệm 3 và 4 có kích thƣớc 2 – 3 cm. Thí nghiệm này có 4 nghiệm thức đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, cấy trong các bình tam giác chứa 50 ml môi trƣờng khoáng cơ bản bổ sung IBA ở những nồng độ khác nhau. Thời gian lấy số liệu 6 tuần. Bảng 3.5: Ảnh hƣởng của IBA đến tạo rễ cây dầu mè Nghiệm thức Nồng độ IBA (mg/l) 1 0 2 0,1 3 0.3 4 0,5 Các chỉ tiêu theo dõi: o Số rễ/1 mẫu o Chiều dài rễ (mm) 33 3.3.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu Số liệu thu thập đƣợc xử lý trên máy vi tính bằng chƣơng trình thống kê Statgraphic 7.0. Đọc kết quả dựa vào bảng ANOVA, bảng trung bình và bảng so sánh khác biệt giữa các nghiệm thức (Bằng phƣơng pháp LSD). 34 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thí nghiệm 1: Vô trùng mô cấy ban đầu từ cây thực sinh Môi trƣờng nuôi cấy mô thực vật có chứa đƣờng, muối khoáng và vitamin, thích hợp cho các loài nấm, vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân chia tế bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật. Nếu môi trƣờng nuôi cấy bị nhiễm vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến một tuần toàn bộ bề mặt môi trƣờng nuôi cấy và mẫu cấy sẽ phủ đầy nấm, khuẩn. Thí nghiệm phải loại bỏ vì trong điều kiện này mô cấy không thể phát triển và chết dần. Khác với thí nghiệm vi sinh có thể kết thúc trong vài ngày, mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật đòi hỏi rất cao mới có hi vọng thành công. Đây là bƣớc quan trọng trong nuôi cấy mô cây dầu mè. Mục tiêu đạt đƣợc của thí nghiệm này là xác định nồng độ của hóa chất diệt khuẩn (Natri hypochlorit) và thời gian vô trùng mẫu mô ban đầu để tạo ra nguồn nguyên liệu cho các thí nghiệm sau. 35 4.1.1. Vô trùng mẫu hạt Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của nồng độ NaOCl và thời gian khử mẫu đến tỉ lệ mẫu hạt vô trùng Nghiệm thức Nồng độ NaOCl (%) Thời gian (phút) Tỉ lệ mẫu vô trùng (%) 1 10 15 5,00 a 2 10 30 18,33 b 3 10 45 16,6