Khóa luận Phân lập, tuyển chọn các giống vi sinh vật sinh Protease và gây hương mắm đặc trưng từ chượp mắm và ứng dụng vào sản xuất nước mắm chay từ nấm

đẩy quá trình tổng hợp protid trong gan, làm giảm cholesterol máu, chống phù và chống phóng xạ. Bởi vậy, ngân nhĩ là thực phẩm rất tốt cho những ngƣời bị suy nhƣợc cơ thể, suy nhƣợc thần kinh, bị các bệnh lý đƣờng hô hấp, cao huyết áp, thiểu năng tuần hoàn não... Mộc nhĩ đen: còn gọi là vân nhĩ, thụ kê, mộc nhu, mộc khuẩn... Mộc nhĩ đen chứa nhiều protid, chất khoáng và vitamine. Mộc nhĩ đen có khả năng ức chế quá trình ngƣng tập tiểu cầu, phòng chống tình trạng đông máu do nghẽn mạch, ngăn cản sự hình thành các mảng vữa xơ trong lòng huyết quản. Ngoài ra, còn có tác dụng chống lão hóa, chống ung thƣ và phóng xạ. Bởi vậy, mộc nhĩ đen là thực phẩm lý tƣởng cho những ngƣời bị cao huyết áp, vữa xơ động mạch, thiểu năng tuần hoàn não, thiểu năng động mạch vành và ung thƣ. Bào ngƣ: còn gọi là nấm sò. Nấm bào ngƣ là loài nấm dễ trồng, cho năng suất cao, phẩm chất ngon, có nhiều tính chất quí. Tính về thành phần dinh dƣỡng, nấm bào ngƣ có nhiều chất đƣờng cao hơn cả nấm rơm, nấm mỡ, nấm đông cô. Nấm bào ngƣ cũng không thua các loại nấm trên về hàm lƣợng đạm, chất khoáng. Xét về năng lƣợng, nấm bào ngƣ cung cấp năng lƣợng ở mức tối thiểu, thấp hơn nấm đông cô, tƣơng đƣơng với nấm rơm và nấm mỡ, rất thích hợp cho những ngƣời ăn kiêng. Nấm bào ngƣ còn chứa 2 polysaccharide có hoạt tính kháng ung bƣớu, đồng thời nấm còn chứa nhiều acid folic, rất cần cho những ngƣời bị thiếu máu. Theo nghiên cứu của kỹ sƣ Lê Duy Thắng, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên thì với nguyên liệu làm nƣớc mắm là nấm rơm sẽ cho sản phẩm có mùi hăng hắc, màu 18 đục, vị lợ. Thế là, ông chuyển sang làm thử bằng nấm bào ngƣ. Sản phẩm nƣớc mắm làm từ nấm bào ngƣ có màu đỏ rƣợu chát, trong suốt, hƣơng thơm đặc trƣng của nƣớc mắm, vị không khác lắm so với nƣớc mắm thông thƣờng. Đặc biệt, nƣớc mắm nấm còn có mùi thơm của nấm bào ngƣ. Với xu hƣớng trên, chúng ta có thể tận dụng những nấm bị đổ đi, hƣ hỏng qua các khâu xử lí trong quá trình lên men có bổ sung thêm các chủng vi sinh vật phân lập từ chƣợp mắm để tạo ra sản phẩm nƣớc mắm từ nấm giúp bữa ăn của những ngƣời ăn chay thêm đậm đà phong phú mà ngƣời ăn mặn cũng có thể thƣởng thức đƣợc. 2.5.Sự phân giải của enzyme Quá trình phân giải protein dƣới tác dụng của enzyme phân giải (protease, peptidase, proteinase, disaminase…). Enzyme protease là nhóm enzyme xúc tác quá trình phân hủy protein. Dƣới tác dụng của chúng protein bi phân hủy: Protein  Pepton  Peptid  Acid amin. Đây là một quá trình thủy phân tƣơng đối phức tạp có sự tham gia của nhiều protease khác nhau gồm 2 loại chính: endoprotease và exoprotease. Cả hai loại này có thể lấy từ nhựa đu đủ, dạ dày tụy tạng… nhƣng nhiều nhất vẫn là từ vi sinh vật Vi sinh vật tiết protease vào môi trƣờng và nhờ đó mà protein có cấu trúc phức tạp đƣợc chuyển thành những hợp chất đơn giản mà tế bào có thể sử dụng đƣợc. Quá trình phân giải protein dƣới tác dụng của enzyme do vi sinh vật tiết ra có thể chia tóm tắt nhƣ sau: Protein Pepton Polypeptid Acid amin NH3 H2, CO2 Acid béo Phenol, Indol, Amin, H2S, CO2 CO2 + H2O Metan 2.5.1.Phân loại protease Protease đƣợc chia làm 2 loại Endoprotease còn gọi là proteinase phân hủy protein thành polypeptid và pepton. 19 Exoprotease còn gọi là peptidase có thể tác dụng trực tiếp lên protein tự nhiên .Sự thủy phân tiến hành dần dần tạo ra các sản phầm trung gian và sản phẩm cuối dùng là acid amin. 2.5.2.Một số nguồn enzyme đƣợc sử dụng 2.5.2.1.Protease từ vi sinh vật Vi sinh vật dùng trong sản xuất là vi khuẩn thuần chủng Bacillus sp và Clostridium sp phân lập từ chƣợp mắm. Bacillus là trực khuẩn, gram dƣơng, hiếu khí nên tƣơng đối dễ thích nghi với điều kiện nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng bằng cách tạo trên bề mặt môi trƣờng một lớp ván khuẩn lạc. Bacillus sp hoạt động trong khoảng nhiệt độ từ 370C – 550C. pH từ 4 – 11. Bacillus sp tham gia quá trình phân giải protein kèm theo sự tạo thành amoniac. Clostridium là vi khuẩn hình que, gram dƣơng, kị khí, sinh bào tử, phần lớn di động, có thể thủy giải saccharide và protein trong các hoạt động thu nhận năng lƣợng. Những loài thủy giải saccharide có thể lên men các loại đƣờng polysaccharide tạo thành acetic acid, butyric và rƣợu. Nhiều loài có thể thủy giải protein và chuyển hóa không hoàn toàn các acid amin tạo thành mùi rất khó chịu trong sản phẩm. Hầu hết giống Clostridium thuộc nhóm ƣa nhiệt vừa, tuy nhiên có một số thuộc nhóm ƣa nhiệt và một số loài khác thuộc nhóm ƣa lạnh. Enzyme của vi sinh vật có ƣu điểm hơn các loại enzyme khác nhƣ (enzyme trong nội tạng của động vật hoặc chiết từ thực vật) là bền và có hoạt tính sinh học cao hơn. Dƣới tác dụng của enzyme các phản ứng sinh hóa xảy ra nhanh hơn từ 10 8 đến 1020 lần so với bình thƣờng. Trong công nghiệp làm nƣớc mắm, làm nƣớc tƣơng, muối cá,… Ngƣời ta chủ động cấy vi sinh vật có khả năng phân giải protein để thu lấy sản phẩm 20 phân giải dễ dàng nhƣ acid amin, dipeptid, oligopeptid mà ngƣời và động vật dễ dàng đồng hoá. 2.5.2.2.Protease từ thực vật – enzyme bromelin Enzyme bromelin đƣợc thu nhận từ dứa Enzyme này hoạt động ở khoảng nhiệt độ từ 400C – 500C. pH từ 3 – 7. 21 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1.Thời gian và địa điểm Thời gian: từ tháng 03/2007 đến tháng 07/2007. Địa điểm: phòng thí nghiệm Vi Sinh khoa Công Nghệ Thực Phẩm trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. 3.2.Nguyên vật liệu thí nghiệm 3.2.1.Nguyên liệu Chƣợp mắm lấy từ cơ sở nƣớc mắm Cửa Bé, Thành Phố Nha Trang. Nấm rơm và nấm bào ngƣ loại 2, dứa, muối mua tại chợ Gò Vấp, quận Gò Vấp, thành phố Hồ Chí Minh. 3.2.2.Vật liệu Tủ sấy. Tủ ấm. Tủ cấy. Nồi hấp khử trùng Autoclave. Máy đo pH Metrohm 744. Bộ máy chƣng cất đạm. Kính hiển vi. Cân. Bếp gas. Microwave. Bình tam giác, đĩa petri, ống nghiệm, pipette, que cấy, đèn cồn, dao, rổ, keo thủy tinh. 22 3.2.3.Môi trƣờng sử dụng Môi trƣờng NA (Nutrient agar): đƣợc sử dụng để phân lập vi khuẩn trong chƣợp mắm. (Phụ lục 1). Môi trƣờng Czapek có bổ sung 10% sữa tiệt trùng: đƣợc sử dụng để phân lập vi khuẩn trong chƣợp mắm. (Phụ lục 3). Mội trƣờng NB ( Nutrient Broth): đƣợc sử dụng để phân lập vi khuẩn trong chƣợp mắm. (Phụ lục 2). Môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm: đƣơc sử dụng để tuyển chọn các chủng vi sinh vật và tăng sinh khối của các chủng đó. (Phụ lục 4). 3.2.4.Hóa chất sử dụng Nƣớc cất. Thuốc thử phenolphtalein 1% trong cồn 900. Dung dịch NaOH 0,2 N. Dung dịch Ba(OH)2 bão hoà trong cồn metylic. BaCl2 tinh thể. Formol trung tính. MgO bột hoặc tinh thể. Cồn. Dung dịch alizarin natri sunfonat 1% trong nƣớc. Dung dịch H2SO4 0,1 N. Dung dịch NaOH 0,1 N. 23 3.3.Nội dung và phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm Các bƣớc thí nghiệm đƣợc tiến hành theo sơ đồ Chƣợp mắm Nấm, dứa Phân lập các chủng vi sinh vật Rửa sạch, xay nhuyễn. Tuyển chọn các chủng vi sinh vật Phối trộn thành phần nấm, dứa. có khả năng phân giải cao, chịu mặn tốt và sinh hƣơng. Bổ sung vi sinh vật 15% muối Lên men Lọc Nƣớc mắm nguyên chất Sơ đồ 3.1. Các bƣớc tiến hành thí nghiệm. 3.4.Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng chịu mặn, thủy phân tốt và sinh hƣơng đặc trƣng nƣớc mắm. 3.4.1.Thí nghiệm 1: Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật hiện diện trong chƣợp mắm. Mục đích: nhằm phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sinh protease. Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc chia làm 3 giai đoạn. Phân lập, tuyển chọn hoàn toàn ngẫu nhiên dựa trên khả năng sinh protease. 24 Giai đoạn 1: phân lập Chƣợp mắm đƣợc pha loãng ở nồng độ 10-1,10-2, 10-3 với cất vô trùng. Chúng tôi tiến hành đỗ đĩa petri lần lƣợt các môi trƣờng NA và cơ bản có bổ sung 10% sữa tiệt trùng. Đối với vi khuẩn hiếu khí Phân lập vi khuẩn trên môi trƣờng NA ủ 24 giờ - 48 giờ ở 400C, quan sát hình dạng khuẩn lạc. Tiếp tục cấy chuyền các khuẩn lạc từ môi trƣờng NA sang môi trƣờng cơ bản có bổ sung 10% sữa, ủ 24 giờ - 48 giờ ở 400C. Đối với vi khuẩn kị khí Phân lập trên môi trƣờng NA bằng cách tiến hành đổ đĩa petri lồng vào nhau sau đó dán kín miệng đĩa bằng băng keo ủ 24 giờ - 48 giờ ở 400C, quan sát hình dạng khuẩn lạc. Cách đọc kết quả: Đối với vi khuẩn hiếu khí Quan sát khả năng sử dụng casein trong sữa của vi khuẩn trên môi trƣờng cơ bản có bổ sung 10% sữa tiệt trùng ủ 24 giờ - 48 giờ ở 400C. Tuyển chọn sơ bộ các chủng vi khuẩn dựa vào hiện tƣợng tạo lớp quầng trong xung quanh khuẩn lạc (có sinh protease). Nhuộm gram: Quan sát hình dạng vi khuẩn dƣới kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần (Phụ lục 5). Đối với vi khuẩn kị khí Quan sát hình dạng khuẩn lạc của các vi khuẩn đƣợc phân lập trên môi trƣờng NA trong đĩa petri sau 24 giờ - 48 giờ ở 400C. Nhuộm gram. Quan sát hình dạng vi khuẩn dƣới kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần. (Phụ lục 5). Giai đoạn 2: thuần khiết chủng vi sinh vật. Từ các chủng vi sinh vật tuyển chọn sơ bộ, chúng tôi cấy vào môi trƣờng thạch nghiêng NA. đối với vi khuẩn hiếu khí, và môi trƣờng NB trong ống nghiệm 25 đối vi khuẩn kị khí. Giai đoạn 3: nhân sinh khối khuẩn lạc. Đối với vi khuẩn hiếu khí Cấy một que cấy vi khuẩn vào môi trƣờng NB ủ ở 400C sau 24 giờ. Cấy canh khuẩn vào bình tam giác có chứa 200 ml nƣớc chiết nấm rơm vô trùng với tỉ lệ canh khuẩn là 1%. Để bình tam giác vào tủ ấm sau 24 giờ quan sát sự biến đổi của môi trƣờng. Khảo sát tính chất sinh hóa: Phản ứng Catalase (Phụ lục 10). Đối với vi khuẩn kị khí Cấy canh khuẩn từ môi trƣờng NB sang môi trƣờng nƣớc chiết nấm ủ ở 400C sau 24 giờ. Cấy canh khuẩn vào chai cao và kín có chứa nƣớc chiết nấm rơm vô trùng với tỉ lệ canh khuẩn là 1%. Nuôi trong chai chứa ngập môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm, đậy kín miệng bình. Sau 24 giờ - 72 giờ quan sát sự hiện diện sinh khối của vi khuẩn dƣới đáy chai. Khảo sát tính chất sinh hóa: Phản ứng Catalase (Phụ lục 10). 3.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm. Mục đích: Tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng chịu đƣợc độ mặn cao. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 7 nghiệm thức, 1 yếu tố, số lần lặp lại là 2. Nghiệm thức I: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn hiếu khí 1. Nghiệm thức II: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn hiếu khí 2. Nghiệm thức III: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn hiếu khí 3. Nghiệm thức IV: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn hiếu khí 4. Nghiệm thức V: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn hiếu khí 5. Nghiệm thức VI: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn kị khí 1. Nghiệm thức VII: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn kị khí 2. 26 Yếu tố thí nghiệm: các chủng vi sinh vật phân lập từ chƣợp mắm. Các lô thí nghiệm đƣợc khảo sát cùng điều kiện nhiệt độ, thời gian, lƣợng môi trƣờng nuớc chiết nấm rơm, các chủng vi sinh vật trong nghiệm thức đƣợc dùng dƣới dạng canh khuẩn nuôi cấy sau 24 giờ. Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lƣợng đạm formol đƣợc tạo thành sau mỗi lần bổ sung muối ở nhiệt độ 40 0 C - 50 0 C. Đạm formol đƣợc xác định bằng phƣơng pháp chuẩn độ formol (Phụ lục 7). Xử lí số liệu Các số liệu đƣợc xử lí trên chƣơng trình STAGRAPHIC 7.0. Phƣơng pháp tiến hành: Lƣợng nƣớc chiết nấm rơm vô trùng cho mỗi nghiệm thức là 200 ml với 1% lƣợng canh khuẩn của các chủng vi sinh vật. Tăng dần dần lƣợng muối cho đến khi đạt đƣợc 20% so với lƣợng nƣớc chiết nấm rơm bằng cách cấy 1% lƣợng canh khuẩn các chủng vi sinh vật từ môi trƣờng ở nồng độ muối trƣớc sang môi trƣờng ở nồng độ muối tiếp theo. Thời gian và lƣợng muối tƣơng ứng đƣợc cho vào nhƣ sau: 0 giờ đến 12 giờ 0% muối. 12 giờ đến 18 giờ 3% muối. 30 giờ đến 48 giờ 7% muối. 72 giờ đến 84 giờ 10% muối. Thí nghiệm đƣợc tiến hành trong tủ ấm ở nhiệt độ 400C - 500C, thời gian khảo sát sau 84 giờ. 3.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng thủy phân của các chủng vi sinh vật phân lập được trên môi trường nước chiết nấm rơm. Mục đích: tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng thủy phân cao. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 7 nghiệm thức, 1 yếu tố, số lần lặp lại là 2. Nghiệm thức I: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn hiếu khí 1. Nghiệm thức II: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn hiếu khí 2. 27 Nghiệm thức III: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn hiếu khí 3. Nghiệm thức IV: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn hiếu khí 4. Nghiệm thức V: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn hiếu khí 5. Nghiệm thức VI: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn kị khí 6. Nghiệm thức VII: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn kị khí 7. Yếu tố thí nghiệm: các chủng vi khuẩn phân lập từ chƣợp mắm . Các lô thí nghiệm đƣợc khảo sát cùng điều kiện nhiệt độ, thời gian, lƣợng môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm, các chủng vi sinh vật trong nghiệm thức đƣợc dùng dƣới dạng canh khuẩn nuôi cấy sau 24 giờ ở nồng độ muối 20%. Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lƣợng đạm formol tạo thành trong 24 giờ ở 400C - 500C. Đạm fomol đƣợc xác định bằng phƣơng pháp chuẩn độ formol (Phụ lục7). Xử lí số liệu Các số liệu đƣợc xử lí trên chƣơng trình STAGRAPHIC 7.0. Phƣơng pháp tiến hành: Lƣợng nƣớc chiết nấm rơm vô trùng 20% muối cho mỗi nghiệm thức là 200 ml với 1% canh khuẩn của các chủng vi sinh vật đƣợc nuôi sau 24 giờ ở nồng độ muối 20%. Thí nghiệm đƣợc tiến hành trong tủ ấm ở nhiệt độ 400C - 500C, thời gian khảo sát sau 24 giờ. 3.4.4. Thí nghiệm 4: khảo sát khả năng sinh hƣơng trên của các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm. Mục đích: tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng gây hƣơng mắm đặc trƣng. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 7 nghiệm thức, 1 yếu tố. Nghiệm thức I: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn hiếu khí 1. Nghiệm thức II: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn hiếu khí 2. Nghiệm thức III: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn hiếu khí 3. Nghiệm thức IV: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn hiếu khí 4. Nghiệm thức V: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn hiếu khí 5. 28 Nghiệm thức VI: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn kị khí 6. Nghiệm thức VII: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn kị khí 7. Yếu tố thí nghiệm: các chủng vi khuẩn phân lập từ chƣợp mắm. Các lô thí nghiệm đƣợc khảo sát cùng điều kiện nhiệt độ, thời gian, lƣợng môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm, các chủng vi sinh vật trong nghiệm thức đƣợc dùng dƣới dạng canh khuẩn nuôi cấy sau 24 giờ ở nồng độ 20% muối . Chỉ tiêu theo dõi: Mùi nƣớc mắm tạo thành sau 3 ngày trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm. Phƣơng pháp đánh giá: mùi hƣơng mắm đƣợc đánh giá bằng phép thử cảm quan cho điểm. (Phụ lục 9). Bảng 3.1. Bảng tiêu chuẩn cho điểm về khả năng gây hƣơng của các chủng vi sinh vật trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm. Chỉ tiêu Điểm Yêu cầu Mùi 5 Sản phẩm có mùi hƣơng đặc trƣng rất giống hƣơng đặc trƣng của nƣớc mắm từ cá, hƣơng mắm dễ chịu. 4 Sản phẩm có mùi hƣơng giống hƣơng nƣớc mắm từ cá, hƣơng mắm dễ chịu 3 Sản phẩm có mùi hƣơng giống nƣớc mắm từ cá, hƣơng mắm tƣơng đối dễ chịu. 2 Sản phẩm có mùi hƣơng nƣớc mắm từ cá, mùi hơi nồng. 1 Sản phẩm không có hƣơng mắm, còn mùi nấm rơm. 0 Sản phẩm không có hƣơng mắm, còn mùi nấm rơm, có mùi thối. Xử lí số liệu Các số liệu đƣợc xử lí trên chƣơng trình STAGRAPHIC 7.0. Phƣơng pháp tiến hành: Lƣợng nƣớc chiết nấm rơm vô trùng 20% muối cho mỗi nghiệm thức là 200 ml 29 với 1% canh khuẩn của các chủng vi sinh vật đƣợc nuôi sau 24 giờ. Thí nghiệm đƣợc tiến hành trong tủ ấm ở nhiệt độ 400C - 500C, thời gian khảo sát sau 3 ngày. 3.5. Sản xuất nƣớc mắm chay từ nấm có bổ sung các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc. Mục đích: Chọn công thức phối trộn giữa các thành phần nguyên liệu và chủng vi sinh vật tối ƣu đƣợc tuyển chọn từ thí nghiệm 1, thí nghiệm 2, thí nghiệm 3 và thí nghiệm 4. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức, đƣợc chia làm 2 giai đoạn. Giai đoạn 1: giai đoạn thủy phân có khuấy đảo, lên men ở nhiệt độ 400C – 50 0C trong 15 ngày. Nghiệm thức 1: 42,5% nấm rơm + 42,5% nấm bào ngƣ + 15% muối. Nghiệm thức 2: 42,5% nấm rơm + 42,5% nấm bào ngƣ + 15% muối + 10% canh khuẩn (gồm vi khuẩn Bacillus sp.1 và vi khuẩn Bacillus sp.4 theo tỉ lệ 1:1). Nghiệm thức 3: 15% dứa + 35% nấm rơm + 35% nấm bào ngƣ + 15% muối + 10% canh khuẩn (gồm vi khuẩn Bacillus sp.1 và vi khuẩn Bacillus sp.4 theo tỉ lệ 1:1). Nghiệm thức 4: 30% dứa + 27,5% nấm rơm + 27,5% nấm bào ngƣ + 15% muối + 10% canh khuẩn (gồm vi khuẩn Bacillus sp.1 và vi khuẩn Bacillus sp.4 theo tỉ lệ 1:1). Nghiệm thức 5: 45% dứa + 20% nấm rơm + 20% nấm bào ngƣ + 15% muối + 10% canh khuẩn (gồm vi khuẩn Bacillus sp.1 và vi khuẩn Bacillus sp.4 theo tỉ lệ 1:1). Giai đoạn 2: sau 15 ngày thủy phân tiến hành bổ sung 10% canh khuẩn (gồm vi khuẩn Clostridium sp.1 và Clostridium sp.2 theo tỉ lệ 1:1) vào mỗi nghiệm thức, không khuấy đảo ở 400C – 500C trong 15 ngày. Yếu tố cố định thí nghiệm: các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc. 30 Chỉ tiêu theo dõi: Chỉ tiêu cảm quan: màu sắc, độ trong, mùi, vị. Chỉ tiêu cảm quan đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp cho điểm. Chỉ tiêu sinh hóa: đạm formol, đạm amoniac, đạm amin đƣợc kiểm tra 3 ngày một lần. Sau khi đã hoàn thành sản phẩm tối ƣu sẽ cho kiểm tra chỉ tiêu đạm tổng số tại Trung Tâm Phân Tích trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp.HCM. Đạm amoniac/ đạm tổng số x 100%. Đạm formol/ đạm tổng số x 100%. Đạm amin/ đạm tổng số x 100%. Phƣơng pháp xác định các chỉ tiêu: Chỉ tiêu sinh hóa. Đạm formol đƣợc xác định bằng phƣơng pháp định lƣợng nitơ formol (Phụ lục 7). Đạm amoniac đƣợc xác định bằng phƣơng pháp cất kéo hơi nƣớc (Phụ lục 8). Đạm amin = đạm formol - đạm amoniac. Chỉ tiêu cảm quan Đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp cảm quan cho điểm theo bảng chỉ tiêu (Phụ lục 11). Xử lí số liệu Các số liệu đƣợc xử lí trên chƣơng trình STAGRAPHIC 7.0. 31 Bảng 3.2. Bảng chỉ tiêu cảm quan sản phẩm nƣớc mắm. Chỉ tiêu Hệ số quan trọng Điểm Yêu cầu Màu sắc 0,8 5 4 3 2 1 Màu nâu vàng, nâu đỏ đặc trƣng. Màu vàng nâu. Màu vàng rơm.. Màu vàng nhạt, vàng xám, nâu xám. Màu vàng tái, xám của nƣớc mắm hỏng. Mùi 1,2 5 4 3 2 1 Có mùi thơm dịu đặc trƣng của nƣớc mắm.Không có mùi lạ. Có mùi thơm khá dịu đặc trƣng của nƣớc mắm.Không có mùi lạ. Có mùi thơm rất dịu đặc trƣng của nƣớc mắm. Không có mùi thơm đặc trƣng của nƣớc mắm, có chút mùi lạ. Có mùi lạ nhƣ mùi thối, mốc. Vị 1,2 5 4 3 2 1 Vị ngọt của đạm, có hậu vị rõ đặc trƣng của nƣớc mắm. Vị ngọt của đạm, có hậu vị đặc trƣng của nƣớc mắm. Vị ngọt của đạm, ít hậu vị. Vị ngọt của đạm kém, có vị lạ. Chát gắt, có vị lạ, không có vị của nƣớc mắm. Độ trong 0,8 5 4 3 2 1 Trong sáng, không vẫn đục, không có cặn. Trong sáng, có rất ít cặn muối đóng ở đáy chai. Nƣớc mắm trong, có ít cặn muối đóng ở đáy chai. Nƣớc mắm trong, có ít cặn và vật thể lạ lắng ở đáy. Vẫn đục, có nhiều vật thể lạ, muối lắng ở đáy. 32 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1.Kết quả quá trình phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng chịu mặn, thủy phân tốt và sinh hƣơng đặc trƣng nƣớc mắm. 4.1.1.Kết quả quá trình phân lập các chủng vi sinh vật. 4.1.1.1.Kết quả quá trình phân lập các chủng vi khuẩn hiếu khí. Quan sát hình dạng khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn hiếu khí trên môi trƣờng NA: Khuẩn lạc thứ nhất: Khuẩn lạc hình tròn, nhô, màu trắng, bề mặt khuẩn lạc nhám tạo lớp màng, mọc trên bề mặt thạch. Nhuộm gram và quan sát dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần: Tế bào có dạng hình que, kích thƣớc từ 1,8 – 2 µm, bắt màu gram dƣơng, bào tử nằm ở giữa tế bào, tế bào đứng riêng lẻ. Phản ứng catalase (Phụ lục 10) (+) dƣơng tính, không có hiện tƣợng sủi bọt khí. Hình 4.1. Khuẩn lạc Bacillus sp.1 Tế bào vi khuẩn (X100) 33 Khuẩn lạc thứ hai: Khuẩn lạc hình tròn, nhô, màu trắng, bề mặt khuẩn lạc bóng, mọc trên bề mặt thạch. Nhuộm gram và quan sát dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần: Tế bào có dạng hình que, kích thƣớc từ 0,5 – 1,5 µm, bắt màu gram dƣơng, bào tử nằm ở giữa tế bào, tế bào đứng riêng lẻ. Phản ứng catalase (Phụ lục 10) (+) dƣơng tính, không có hiện tƣợng sủi bọt khí. Hình 4.2. Khuẩn lạc Bacillus sp.2 Tế bào vi khuẩn (X100) Khuẩn lạc thứ ba: Khuẩn lạc hình tròn, nhô, màu trắng, có quầng trong răng cƣa xung quanh, bề mặt khuẩn lạc nhám tạo lớp màng, có tâm vàng đục nhô ở giữa, mọc trên bề mặt thạch. Nhuộm gram và quan sát dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần: Tế bào có dạng hình que, kích thƣớc từ 1 – 1,5 µm, bắt màu gram dƣơng, bào tử nằm ở giữa tế bào, tế bào đứng riêng lẻ hay tạo thành chuỗi . Phản ứng catalase (Phụ lục 10) (+) dƣơng tính, không có hiện tƣợng sủi bọt khí. 34 Hình 4.3. Khuẩn lạc Bacillus sp.3 Tế bào vi khuẩn (X100) Khuẩn lạc thứ tƣ: Khuẩn lạc hình tròn, nhô, màu trắng, bề mặt khuẩn lạc nhám tạo lớp màng, mọc trên bề mặt thạch. Nhuộm gram và quan sát dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần: tế bào có dạng hình que, kích thƣớc từ 1 – 1,5 µm, bắt màu gram dƣơng, bào tử nằm ở giữa tế bào, tế bào đứng riêng lẻ hay kết thành chuỗi. Phản ứng catalase (Phụ lục 10) (+) dƣơng tính, không có hiện tƣợng sủi bọt khí. Hình 4.4. Khuẩn lạc Bacillus sp.4 Tế bào vi khuẩn (X100) 35 Khuẩn lạc thứ năm: Khuẩn lạc hình tròn, nhô, màu trắng, có quầng trong răng cƣa xung quanh, bề mặt khuẩn lạc nhám tạo lớp màng, mọc trên bề mặt thạch. Nhuộm gram và quan sát dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần: Tế bào có dạng hình que, kích thƣớc từ 1 – 2 µm, bắt màu gram dƣơng, bào tử nằm ở giữa, tế bào đứng riêng lẻ. Phản ứng catalase (Phụ lục 10) (+) dƣơng tính, không có hiện tƣợng sủi bọt khí. Hình 4.5. Khuẩn lạc Bacillus sp.5 Tế bào vi khuẩn (X100) 4.1.1.2.Kết quả quá trình phân lập các chủng vi khuẩn kị khí Khuẩn lạc thứ nhất: Khuẩn lạc có dạng rễ cây sợi nhỏ, màu trắng, mọc sâu trong thạch. Nhuộm gram và quan sát dƣới kình hiển vi với độ phóng đại 1000 lần: tế bào vi khuẩn có dạng hình chìa khóa, phình to một đầu, bắt màu gram dƣơng, kích thƣớc từ 1 – 1,5 µm, bào tử nằm ở đầu tế bào, tế bào đứng riêng lẻ. Phản ứng catalase (Phụ lục 10) (-) âm tính, không có hiện tƣợng sủi bọt khí. 36 Hình 4.6. Khuẩn lạc Clostridium sp.1 Tế bào vi khuẩn (X100) Khuẩn lạc thứ 2: Khuẩn lạc có dạng rễ cây sợi to, màu trắng, mọc sâu trong thạch. Nhuộm gram và quan sát dƣới kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần: Tế bào có dạng hình chìa khoá, phình to 1 đầu, bắt màu gram dƣơng, kích thƣớc từ 2 – 6 µm, bào tử nằm ở giữa tế bào, tế bào đứng riêng lẻ. Phản ứng catalase (Phụ lục 10) (-) âm tính, không có hiện tƣợng sủi bọt khí. Hình 4.7. Khuẩn lạc Clostridium sp.2 Tế bào vi khuẩn (X100) 37 4.1.2.Kết quả khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc. Thí nghiệm khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi sinh vật phân lập từ chƣợp gồm 7 nghiệm thức, 1 yếu tố, số lần lặp lại là 2 trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm. Sau 84 giờ thuỷ phân, quan sát hiện tƣợng tạo lớp ván trên bề mặt môi trƣờng đối với các chủng Bacillus sp. và hiện tƣợng tạo khối tế bào nằm ở đáy chai đối với các chủng Clostridium sp. Tiến hành đo hoạt lực của các chủng vi sinh vật dựa vào khả năng thủy phân đƣợc đo bằng phƣơng pháp định lƣợng nitơ formol sau mỗi lần bổ sung muối kết quả thu đƣợc nhƣ sau: Bảng 4.1. Kết quả khảo sát hàm lƣợng đạm formol sinh ra của các chủng vi sinh vật trong môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm ở nồng độ muối 0%. Chủng vi sinh vật Hàm lƣợng đạm formol ở nồng độ muối 0% (g/l) Lần Trung bình 1 2 B1 2,016 1,904 1,960 B2 1,792 1,792 1,792 B3 1,344 1,456 1,400 B4 2,016 2,016 2,016 B5 1,344 1,232 1,288 C1 1,792 1,568 1,680 C2 1,568 1,568 1,568 38 Bảng 4.2. Kết quả khảo sát hàm lƣợng đạm formol sinh ra của các chủng vi sinh vật trong môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm ở nồng độ muối 3%. Chủng vi sinh vật Hàm lƣợng đạm formol ở nồng độ muối 3% (g/l) Lần Trung bình 1 2 B1 1,568 1,568 1,568 B2 1,344 1,456 1,400 B3 0,896 1,120 1,008 B4 1,792 1,792 1,792 B5 1,120 1,232 1,176 C1 1,568 1,456 1,512 C2 1,344 1,344 1,344 Bảng 4.3. Kết quả khảo sát hàm lƣợng đạm formol sinh ra của các chủng vi sinh vật trong môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm ở nồng độ muối 10%. Chủng vi sinh vật Hàm lƣợng đạm formol ở nồng độ muối 10% (g/l) Lần Trung bình 1 2 B1 1,792 1,792 1,792 B2 1,568 1,680 1,624 B3 1,344 1,456 1,400 B4 2,016 2,128 2,072 B5 1,344 1,456 1,400 C1 1,792 1,792 1,792 C2 1,680 1,568 1,624 39 Đồ thị 4.1. Biến thiên khả năng sinh đạm formol của các chủng vi sinh vật trong môi trường nước chiết nấm rơm theo nồng độ muối. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0% 5% 10% 15% 20% Nồng độ muối H àm lư ợ n g đ ạm f or m ol l (g /l) B1 B2 B3 B4 B5 C1 C2 Bảng 4.4. Kết quả khảo sát hàm lƣợng đạm formol sinh ra của các chủng vi sinh vật trong môi trƣờng nƣớc chiết nấ