Khóa luận Quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B bằng phương pháp Real-Time PCR

xơ gan và ung thư gan nguyên phát với tỷ lệ tử vong là 1 - 2 triệu người. Các genotype HBV khác nhau phân bố ở vùng địa lý đặc trưng khác nhau: - Genotype A phổ biến ở Bắc Mỹ, Châu Âu, Nam Phi và Ấn Độ. - Genotype B và C thì phổ biến ở Châu Á. - Genotype D phổ biến ở Châu Âu (vùng Địa Trung Hải), Trung Đông, Ấn Độ và Nam Phi. - Genotype E phổ biến ở Tây Phi. - Genotype F phổ biến ở Trung và Nam Mỹ, Alaska. - Genotype G phổ biến ở Châu Âu, Mexico, Mỹ. - Genotype H thường thấy ở Trung Mỹ, Mỹ, Nhật Bản. Tình hình HBV thay đổi theo từng khu vực địa lý. Tùy theo tỷ lệ người mang HBsAg [+] mà người ta chia làm 3 khu vực chính: 1.3.1.1. Khu vực lưu hành thấp Tỷ lệ HBsAg [+] khoảng 0,1 - 0,5% dân số như ở Bắc Mỹ, Tây Âu và Úc. Tỷ lệ người mang HBsAg cao nhất ở khoảng tuổi từ 20 - 40, trẻ em hiếm khi bị nhiễm HBV. 1.3.1.2. Khu vực lưu hành trung bình Tỷ lệ HBsAg [+] khoảng 2 - 7% ở một số quốc gia miền Nam Châu Âu và Đông Âu, Nga, Nam Mỹ. Kiểu lây truyền thường là phối hợp nhưng lây nhiễm qua đường tình dục thường là quan trọng hơn. Tuổi bị lây nhiễm cao nhất là từ 25 tuổi (khoảng 50% dân số). Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 10 1.3.1.3. Khu vực lưu hành cao Tỷ lệ HBsAg [+] vào khoảng 8 - 15%. Đặc điểm dịch tễ học quan trọng của vùng này là nhiễm HBV thường gặp ở trẻ em và lây nhiễm qua đường chu sinh (đường lây từ mẹ sang con). Trung Quốc, Phi Châu, Đông Nam Á được xếp vào khu vực này. Ngoài ra người ta cũng ghi nhận sự lây nhiễm còn xảy ra ở tuổi thiếu niên do các trẻ bị lây lẫn nhau trong gia đình, hoặc trong bạn bè, thường gặp ở trẻ em châu Phi. Vì vậy, hầu hết dân số bị nhiễm có huyết thanh chẩn đoán HBV dương tính rất sớm, thường là sau 10 tuổi. Tuy nhiên, bệnh lại thường được phát hiện ở tuổi trưởng thành, lúc mà các biến chứng mãn tính của nhiễm HBV có thể đã xuất hiện như viêm gan mãn, xơ gan và ung thư gan nguyên phát. Do nhiễm ở tuổi còn nhỏ nên nguy cơ mang siêu vi mãn tính rất cao, những phát hiện này chứng tỏ rằng người trẻ mang HBV là người có khả năng lây nhiễm nhất. Việt Nam cũng được xếp vào khu vực lưu hành cao, nghĩa là nhiễm HBV khá phổ biến, tuy chưa có những nghiên cứu dịch tễ học thống nhất. 1.3.2. Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B trong nước Ở Việt Nam, cứ 5 - 7 người dân thì có một người nhiễm, chủ yếu là kiểu gene B và C. Virus B xâm nhập tế bào gan, biến chúng thành nơi sản xuất virus mới. Khi phát hiện ra sự bất thường này, hệ miễn dịch sẽ tấn công kẻ xâm lược. Nếu “cuộc chiến“ thắng lợi, tế bào gan tổn thương sẽ được thay thế bằng những tế bào khỏe mạnh và bệnh nhân sẽ được phục hồi. Nhưng ở một số người, hệ miễn dịch không loại trừ được virus và họ trở thành người mang virus viêm gan B mãn tính. Khoảng 10% số người nhiễm virus B rơi vào trường hợp này. Trong các trường hợp xấu nhất, các tế bào gan bị virus phá hoại bị thay thế bằng các mô sợi bất thường, dẫn đến xơ gan và ung thư gan. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 11 Trên bản đồ dịch tễ của thế giới, tỷ lệ dân số Việt Nam mang kháng nguyên HBsAg (chứng tỏ nhiễm HBV) là trên 8%, xếp vào hàng các quốc gia có tỷ lệ nhiễm HBV cao nhất thế giới. Nhận định này cũng được một số công trình nghiên cứu về dịch tễ học trong và ngoài nước xác nhận. Không phải tất cả các trường hợp nhiễm HBV đều cần phải được đặt ra vấn đề phải điều trị vì đa số bệnh nhân đều có thể tự khỏi nhờ cơ thể có thể tạo ra đáp ứng miễn dịch bằng kháng thể bảo vệ là kháng thể kháng kháng nguyên bề mặt của virus. Tuy nhiên vẫn có một tỷ lệ người nhiễm HBV cần phải được điều trị đặc hiệu bằng thuốc kháng virus một khi có dấu hiệu viêm gan mãn tính và lượng virus tăng cao. Hình 1.5. Sự phân bố HBsAg trên thế giới [25] 1.4. Đường lây của HBV, triệu chứng lâm sàng, biện pháp phòng ngừa và điều trị HBV [4],[8],[19] 1.4.1. Đường lây của HBV Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 12 Phương thức lây nhiễm chủ yếu trong viêm gan siêu vi B là lây qua đường tiêu hóa. Sự lây nhiễm sẽ dễ dàng xảy ra khi trong máu hoặc trong dịch tiết của người bệnh đã nhiễm có nồng độ siêu vi B rất cao và khi người bệnh tiếp xúc thường xuyên với các yếu tố nguy cơ trong một thời gian dài. Mặt khác, đa số những người mang siêu vi B mãn tính thường không có triệu chứng và họ không hề hay biết để dự phòng nguy cơ lây nhiễm cho những người xung quanh. Về phương diện dịch tễ học, người ta ghi nhận có ba phương cách lây nhiễm chính: v Lây truyền qua đường ngoài tiêu hóa do tiếp xúc với máu, các vật phẩm của máu Cách lây nhiễm này thường gặp ở các nhân viên y tế, người được truyền máu nhiều lần, người mắc bệnh máu khó đông và được lọc máu ngoài thận,… Ngoài ra, bệnh còn có thể lây qua đường tiêm chích hoặc khi sử dụng các dụng cụ không đảm bảo vô khuẩn như phẫu thuật, nội soi đường tiêu hóa, châm cứu, xỏ lỗ tai, xăm mình, chữa răng và nhất là những người nghiện ma túy sử dụng chung ống tiêm. HBV có tính đề kháng tương đối và bền vững khi được bảo quản ở nhiệt độ -20oC trong nhiều năm, có thể tồn tại ở 60oC trong bốn giờ. v Lây truyền qua đường tình dục Máu và các chất dịch của cơ thể như nước bọt, tinh dịch hoặc dịch âm đạo đều chứa virus. v Lây truyền từ mẹ sang con HBV được lây truyền chủ yếu trong lúc sanh hơn là lúc lây qua nhau thai. Mức độ nặng và tiên lượng của tình trạng lây nhiễm này tùy thuộc vào hai yếu tố: mức độ nhân đôi của siêu vi và thời gian bị nhiễm HBV cấp tính ở mẹ. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 13 1.4.2. Triệu chứng lâm sàng - Viêm gan cấp tính Thời gian ủ bệnh từ 1 - 6 tháng. Một số bệnh nhân có cảm giác như bị cảm nhẹ, đôi khi không biết mình bị HBV. Một số khác bị vàng da, mệt mỏi, đau nhức, buồn ói, chán ăn, sốt nhẹ, biến đổi cảm giác (hiện tượng đặc biệt là người ghiền thuốc lá tự nhiên không thích mùi thuốc lá), đau bụng (dưới sườn bên phải). Những trường hợp bị viêm nặng sẽ đưa đến gan to, ngầy ngật, khó ngủ, mê muội, lãng trí hoặc bất tỉnh. Biểu hiện lâm sàng: tăng nhiệt độ, vàng da (một tuần sau khi bị nhiễm và có thể kéo dài đến 1 - 3 tháng), gan to, lách to. Hiếm khi thấy bàn tay ửng đỏ hoặc “spider nevi” (mạch máu li ti kết tỏa thành hình nhện như hoa thị trên da). - Viêm gan mãn tính Phần lớn khi bị viêm mãn tính bệnh nhân hoàn toàn bình thường. Một số bị viêm mãn tính nặng thì tiếp tục bị các triệu chứng viêm cấp như mệt mỏi, chán ăn, đau bụng và suy gan. Biểu hiện lâm sàng: gan to, bàn tay ửng đỏ. Khi bị biến chứng sơ gan có thể bị ứ nước trong bụng, vàng da, loãng máu, chảy máu trong dạ dày, tĩnh mạch tỏa lớn từ rốn (do tăng áp làm giãn tĩnh mạch cửa gan), nam vú lớn như vú nữ, tinh hoàn teo nhỏ (vì gan yếu làm thay đổi cân bằng của các hormone giới tính). 1.4.3. Biện pháp phòng ngừa và điều trị HBV v Phòng bệnh Tiêm chủng vaccine: Sau khi tiêm vaccine, để đánh giá được hiệu quả bảo vệ của chúng cần làm xét nghiệm anti-HBsAg để phát hiện kháng thể chống virus đã được hình thành. Khi người bệnh xét nghiệm HBsAg [+] thì không được tiêm vaccine nữa. Hiện Việt Nam đã có vaccine viêm gan thế hệ III mới nhất Sci-B-Vac có độ an toàn và tính hiệu quả cao hơn trước rất nhiều. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 14 Tuyệt đối không dùng chung các dụng cụ có thể gây xây xát da, niêm mạc (dao cạo, bàn chải răng, dụng cụ y tế … hoặc truyền máu) để tránh lây lan từ người bệnh. Quan hệ tình dục có bảo vệ, có thể ngăn chặn sự lây nhiễm HBV. v Điều trị Khi mắc bệnh viêm gan B, thường sẽ xét nghiệm một mẫu máu của bệnh nhân để tìm các dấu hiệu của bệnh gan. Hai yếu tố sẽ xem xét kĩ lưỡng là lượng siêu vi (lượng HBV-DNA) lưu thông trong máu, và các enzyme của gan có thể cho biết tình trạng tổn thương gan. Kiểm soát lượng siêu vi trong máu, duy trì lượng enzyme ở mức bình thường, và tăng cường hệ miễn dịch của bệnh nhân để ngừa bệnh hiệu quả. Hiện nay, có các loại thuốc giúp có tác dụng chữa bệnh viêm gan B, nhưng không thể chữa khỏi được. Các loại thuốc này được gọi là interferon và thuốc kháng siêu vi. - Interferon Interferon, một chất đạm tự nhiên trong cơ thể, có tác dụng tăng cường hệ miễn dịch để ngừa bệnh. Các nhà nghiên cứu đã bào chế các loại interferon tổng hợp có tác dụng giúp hệ miễn dịch chống viêm nhiễm trong gan và tăng lượng kháng thể chống loại siêu vi này. Interferon có thể giúp cải thiện tình trạng sức khỏe lá gan và giảm bớt lượng siêu vi trong gan. Việc điều trị bằng interferon thường diễn ra trong một thời gian nhất định, thường là vài tháng, và có thể giúp cải thiện vĩnh viễn tình trạng sức khỏe của gan mà không gây ra triệu chứng kháng siêu vi. Chính vì vậy, interferon là biện pháp điều trị tốt nhất được nhiều người lựa chọn đầu tiên, do nó có hoạt tính chống virus và kích thích hệ miễn dịch. - Thuốc kháng siêu vi Thuốc kháng siêu vi (dạng thuốc viên hoặc thuốc nước) can thiệp vào quá trình tái tạo HBV để ngăn chặn tình trạng tái tạo siêu vi HBV mới. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 15 Có bốn loại thuốc kháng siêu vi đã được Cơ quan Quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) chấp nhận. Các loại thuốc kháng siêu vi khác nhau ở chỗ, chúng chú trọng tới một bộ phận khác nhau trên bộ gene của siêu vi. Tuy nhiên, dần dần HBV có thể phát sinh các đột biến giúp siêu vi này tiếp tục sinh sôi bất kể điều trị bằng thuốc viên kháng siêu vi. Hiện tượng này gọi là “kháng” siêu vi, vì siêu vi có thể “kháng lại” thuốc kháng siêu vi. Các loại thuốc kháng siêu vi có thể có tác dụng trong một thời gian để giảm bớt lượng siêu vi và mức enzyme, tuy nhiên khi hiện tượng kháng thuốc xảy ra thì các mức này lại bắt đầu tăng cao. Các nhà nghiên cứu vẫn chưa bào chế được loại thuốc kháng siêu vi hoặc biện pháp điều trị kết hợp hoàn hảo có tác dụng xóa bỏ hoàn toàn HBV. Các loại thuốc kháng siêu vi hiếm khi tạo ra các triệu chứng là phản ứng phụ. Hiện nay FDA chấp nhận 5 thuốc để điều trị viêm gan mãn virus B: interferon alpha-2b (1992), lamivudine (1998), adefovir dipivoxil (2002) và entecavir (2005) và peginterferon alpha-2a (tháng 5-2005). 1.5. Các phương pháp chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B 1.5.1. Phương pháp huyết thanh học (phát hiện kháng thể) và hóa miễn dịch (phát hiện kháng nguyên) [5] HBV cũng tạo ra kháng nguyên “e” hay HBeAg, được phóng thích vào máu và phát hiện bằng thử nghiệm huyết thanh học. Sự hiện diện HBeAg và DNA virus lưu hành trong máu là một dấu hiệu chỉ điểm virus đang tăng sinh và có độ gây nhiễm rất cao. Khi tình trạng nhiễm trùng phục hồi, HBeAg và HBsAg không còn trong máu, và có dấu hiệu chuyển đổi huyết thanh: xuất hiện các kháng thể anti-HBe và anti-HBs. Vì vậy, dựa vào nguyên lý tính đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể có thể chẩn đoán HBV bằng kỹ thuật ELISA. Các bước cơ bản: - Kháng nguyên - antigen (KN) chưa biết, được gắn trên một bề mặt. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 16 - Kháng thể - antibody (KT) biết trước. Kháng thể này được gắn kết với enzyme. - Thêm vào một cơ chất (subtance), enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được. - Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa KN - KT. Sự hiện diện của phức hợp KN - KT sẽ quyết định cường độ sáng phát ra. Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt cũng như lượng KN trong mẫu nghiên cứu. Nhưng phương pháp này rất hạn chế do KN không đặc hiệu sẽ ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm. 1.5.2. Phương pháp sinh học phân tử 1.5.2.1. Phương pháp khuếch đại tín hiệu bằng DNA nhánh (bDNA) [8] Là phương pháp phát hiện và định lượng DNA (hoặc RNA) bằng kỹ thuật lai và khuếch đại tín hiệu trên pha rắn là các giếng thử nghiệm. Phương pháp được thực hiện theo các bước sau: (1) HBV-DNA nếu có trong mẫu thử sẽ lai với các đoạn dò đích (target probes), có hai loại: một loại có đầu đặc hiệu với đoạn dò tóm bắt, một loại có đầu đặc hiệu với DNA nhánh (bDNA). (2) Trên bề mặt của các giếng thử nghiệm có gắn các đoạn dò tóm bắt (capture probes). Các đoạn dò này sẽ tóm bắt các đoạn dò đích, đã được lai với HBV-DNA, nhờ đó đã tóm bắt HBV-DNA lên giếng thử nghiệm. (3) Các đoạn dò đích, đã lai với HBV-DNA, có đầu đặc hiệu bDNA vẫn được tự do sẽ được lai với bDNA. (4) Các nhánh của bDNA sẽ được lai với các đoạn dò phát hiện đã đánh dấu enzyme Alkaline phosphatase, nhờ đó phát hiện được sự hiện diện của HBV-DNA đã bị tóm bắt trên giếng. Phương pháp này có thể phát hiện một lượng tối thiểu là 7.105 phân tử DNA trong một ml máu. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 17 Hình 1.6. Nguyên lý phát hiện HBV bằng phương pháp bDNA [14] Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 18 1.5.2.2. Phương pháp PCR [1],[3],[22] v Nguyên tắc Đây là một kỹ thuật tạo dòng in vitro, không cần sự hiện diện của tế bào, cho phép khuếch đại một đoạn DNA nằm giữa hai vùng trình tự oligonucleotide đã biết trước. Hai trình tự oligonucleotide này được gọi là mồi xuôi - bắt cặp với mạch [+] DNA và mồi ngược bắt cặp với mạch [-] DNA. Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn: - Giai đoạn biến tính Nhiệt độ phản ứng là 94oC trong 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNA biến tính tách ra làm đôi hoàn toàn, tất cả hoạt động của các enzyme đều dừng lại, phân tử DNA duỗi thẳng ra hoàn toàn, từ đó dễ dàng cho việc bắt cặp và gắn các Nu vào mạch đơn đó theo nguyên tắc bổ sung. - Giai đoạn bắt cặp Các primer (đoạn mồi) là các đoạn Nu ngắn (khoảng 20 - 25 Nu) sẽ bắt cặp vào các chuỗi đơn DNA sau khi biến tính theo nguyên tắc bổ sung. Sự bắt cặp này sẽ có hai ý nghĩa đặc hiệu: đặc hiệu theo nguyên tắc bổ sung với đoạn gene mà ta cần khuếch đại và đặc hiệu theo chiều dài của đoạn gene khuếch đại. - Giai đoạn kéo dài Sau khi primer bắt cặp đặc hiệu với các mạch đơn DNA, nhờ tác dụng của enzyme Taq polymerase ở điều kiện thích hợp sẽ gắn các Nu vào các primer theo nguyên tắc bổ sung, từ đó làm cho đoạn mồi dài ra và hình thành nên một mạch đơn mới bổ sung với mạch đơn cũ. Và một bản sao DNA mới đã được hình thành. Như vậy, sau giai đoạn này ta có được hai phân tử DNA có cấu trúc giống hệt như phân tử DNA ban đầu. Chu kỳ này được lặp lại nhiều lần (30-40 lần), kết quả từ một số lượng DNA đích ban đầu (N), sau n chu kỳ sẽ tạo thành N x 2n bản sao. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 19 Hình 1.7. Nguyên lý PCR [9] v Các thành phần trong phản ứng PCR Một phản ứng PCR thường gồm 6 thành phần cơ bản sau: - DNA mạch khuôn DNA mạch đôi hay mạch đơn đều có thể là nguồn vật chất ban đầu cho phản ứng PCR, chúng được tách chiết từ tế bào thực vật, động vật, vi khuẩn hoặc virus. Ngoài ra, RNA cũng là một nguồn vật liệu cho phản ứng khuếch đại nếu nó được phiên mã ngược thành cDNA. Nồng độ DNA ban đầu trong phản ứng không cần quá cao, có thể chỉ cần một phân tử DNA ban đầu cho Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 20 một phản ứng. Thông thường, nồng độ DNA ban đầu tốt nhất cho phản ứng PCR ở khoảng 105 bản sao/phản ứng. - Mồi Đây là một trong những yếu tố quan trọng nhất trong phản ứng PCR, có vai trò làm mồi cho hoạt động kéo dài mạch của DNA polymerase. Do đó, việc thiết kế mồi phải được tiến hành thật chính xác, tránh ảnh hưởng đến hiệu quả và độ chuyên biệt của phản ứng PCR. Nồng độ mồi trong mỗi phản ứng PCR phải được tính toán tối ưu bằng thực nghiệm. Nếu nồng độ mồi quá cao sẽ dẫn đến hiện tượng khuếch đại kí sinh, ngược lại sẽ làm hiệu quả khuếch đại của phản ứng không cao. Giới hạn nồng độ mồi thường là 0.1 - 1µl. Mồi thiết kế phải tuân thủ những nguyên tắc sau: · Tm của mồi “xuôi” và mồi “ngược” không khác nhau quá 5oC. · Tránh sự bắt cặp bổ sung giữa mồi “xuôi” và mồi “ngược”. · Tránh các cấu trúc “kẹp tóc” trong thành phần mỗi mồi. · Thành phần nucleotide của mồi phải cân bằng. · Tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần. · Thành phần GC khoảng 40 - 60%. · Trình tự mồi phải đặc trưng cho trình tự DNA cần nhân bản. - Enzyme chịu nhiệt Taq polymerase Enzyme này có thể chịu được nhiệt độ tới 95oC. Một phản ứng PCR từ 25 - 50µl thông thường có liều lượng Taq polymerase nằm trong giới hạn từ 0.5 - 2.5 đơn vị. - MgCl2 Có vai trò là một cofactor cho enzyme DNA polymerase hoạt động. Ngoài ra, mồi; DNA bản mẫu; dNTPs; EDTA cũng có thể liên kết với MgCl2 và do đó sẽ cạnh tranh với DNA polymerase. Nếu nồng độ MgCl2 cao sẽ dẫn Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 21 đến hiện tượng khuếch đại kí sinh. Vì vậy, phải thiết kế nồng độ MgCl2 tối ưu nhất cho từng phản ứng PCR cụ thể, thông thường là từ 1.5 - 4mM. - Dung dịch đệm PCR Dung dịch này có vai trò cung cấp những ion cần thiết cho phản ứng xảy ra. Tùy theo nguồn DNA polymerase mà nồng độ và pH của dung dịch đệm cũng như nồng độ KCl tối ưu sẽ thay đổi cho phù hợp. Thông thường, một phản ứng PCR sẽ có dung dịch đệm điển hình là: 50mM KCl, 10mM Tris - HCl, pH 8.3 ở nhiệt độ phòng. - dNTPs (deoxyribonucleotide triphosphate) Gồm bốn loại nucleotide được dùng trong phản ứng PCR là: dATP, dTTP, dGTP, dCTP. Nồng độ của mỗi loại nu trong mỗi phản ứng (với nồng độ MgCl2 1.5mM) là 200-250µl. 1.5.2.3. Phương pháp Real-time PCR [6] ü Nguyên lý của Real-time PCR Real-time PCR kiểm soát lượng huỳnh quang giải phóng ra trong phản ứng, từ đó có thể biết được lượng sản phẩm PCR trong từng thời điểm (chu kỳ) của quá trình khuếch đại, trái ngược với PCR truyền thống chỉ biết được lượng sản phẩm được khuếch đại ở thời điểm cuối cùng của phản ứng khuếch đại. - Real-time PCR là một phản ứng động, cho phép phát hiện “huỳnh quang phát ra nhờ sự khuếch đại của sản phẩm PCR” tại mỗi chu kỳ của phản ứng PCR. - Phân tích kết quả phản ứng mà không cần bước điện di trên gel. - Phân tích kết quả huỳnh quang phát ra theo thời gian tại mỗi chu kỳ phản ứng PCR bằng máy tính. Các đặc tính của Real-time PCR Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 22 - Thiết bị Real-time PCR khác thiết bị PCR chỉ đơn giản bằng cách bổ sung thêm thiết bị quang học vào máy PCR thông thường. - Bổ sung cơ chất huỳnh quang vào hỗn hợp phản ứng và tiến hành phản ứng PCR bằng máy Real-time PCR. - Phản ứng huỳnh quang tại mọi điểm xác định nhờ thiết bị quang học. ü Hiện nay có bốn kiểu phản ứng được sử dụng trong kỹ thuật Real-time PCR với độ nhạy tương đương. Cả bốn phương pháp đều sử dụng các chất nhuộm phát huỳnh quang (fluorescent dye), có sự kết hợp bước nhân bản và phát hiện sản phẩm PCR mục tiêu nhằm theo dõi hàm lượng sản phẩm PCR mục tiêu theo thời gian thật (real-time) của phản ứng. Phương pháp đơn giản nhất là sử dụng một chất hóa học phát huỳnh quang có khả năng gắn vào phân tử DNA mạch đôi. Ba phương pháp còn lại sử dụng các probe có đánh dấu bằng chất huỳnh quang để lai đặc hiệu với sản phẩm PCR mục tiêu. v Molecular beacon Loại mẫu dò này có cấu trúc dạng vòng và cuống. Phần cấu trúc dạng vòng sẽ bắt cặp bổ sung đặc hiệu với trình tự DNA mục tiêu, còn phần cấu trúc dạng cuống được tạo thành từ các base nằm ở hai đầu mút của mẫu dò bắt cặp bổ sung với nhau nhờ liên kết hydro. Một đầu mẫu dò sẽ được gắn một chất hóa học phát huỳnh quang, đầu kia được gắn một chất hóa học khác có nhiệm vụ “dập tắt” (quencher) bằng cách làm tiêu giảm năng lượng dưới dạng nhiệt mà nó nhận được từ chất phát huỳnh quang, ngăn cản ánh sáng huỳnh quang không phát ra. Ở trạng thái tự do trong không gian, phần cấu trúc dạng cuống làm cho hai đầu của mẫu dò gần nhau, lúc đó phần quencher sẽ phát huy tác dụng. Nhưng khi bắt cặp bổ sung đặc hiệu với một trình tự mục tiêu, dạng vòng cuống của mẫu dò sẽ mất đi và trở thành dạng thẳng, khoảng cách giữa chất phát huỳnh quang và mẫu dò gia tăng làm cho chất huỳnh quang có Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 23 khả năng phát sáng, lúc đó các thiết bị chuyên dụng sẽ tiếp nhận và phân tích tín hiệu. Molecular beacon có tính đặc hiệu rất cao do yêu cầu của chúng về khả năng bắt cặp bổ sung với trình tự DNA là tuyệt đối. Vì xét về mặt nhiệt động học, sự hình thành cấu trúc kẹp tóc ở beacon thuận lợi hơn sự hình thành các phân tử lai không hoàn chỉnh, nếu beacon không bắt cặp bổ sung hoàn toàn với trình tự mục tiêu, hiện tượng lai sẽ không xảy ra, và đương nhiên tín hiệu huỳnh quang sẽ không có. Việc thiết kế mẫu dò dạng beacon rất khó và quan trọng, trình tự nucleotide trong phần cấu trúc dạng cuống phải được thiết kế sao cho quencher và chất phát huỳnh quang phải tiếp xúc với nhau, nếu không sẽ làm một phần ánh sáng huỳnh quang phóng thích không đặc hiệu dẫn đến sai lệch trong kết quả định lượng. Mặt khác, các liên kết trong cấu trúc dạng cuống không được quá mạnh, như thế sẽ làm cản trở sự bắt cặp giữa beacon và trình tự DNA mục tiêu. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 24 Hình 1.8. Tóm tắt cơ chế hoạt động của Beacon probe trong Real-time PCR [7] Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 25 v Chất nhuộm gắn với DNA mạch đôi Chất nhuộm này gắn với mọi phân tử DNA mạch đôi và chỉ phát tín hiệu huỳnh quang khi gắn vào chúng. Cường độ huỳnh quang phát ra của chất nhuộm này tỷ lệ thuận với hàm lượng DNA có trong phản ứng PCR. Hai chất nhuộm phát huỳnh quang thường được sử dụng là SYBR Green I và Ethidium bromide. Trong phản ứng PCR, các chất nhuộm sẽ gắn vào DNA mạch đôi mới được tổng hợp trong bước kéo dài và rời ra khi các phân tử DNA bị biến tính. Nhược điểm của phương pháp này phản ứng sẽ cho kết quả định lượng không chính xác nếu có sản phẩm ký sinh. v Mẫu dò đôi (Hybridization probe) Phương pháp này có độ đặc hiệu rất cao do việc sử dụng cùng lúc hai mẫu dò bắt cặp với trình tự DNA mục tiêu. Một mẫu dò sẽ gắn chất cho huỳnh quang (fluorescein donor) ở đầu 3’ phát ánh sáng xanh, một mẫu dò sẽ gắn chất nhận huỳnh quang (fluorescein accepter) ở đầu 5’ và luôn chặn ở đầu 3’ DNA sao cho Taq polymerase không thể kéo dài mạch từ đầu này. Trong dung dịch phản ứng, khi chất cho và chất nhận cách xa nhau thì tín hiệu nền là tín hiệu huỳnh quang do chất cho phát ra (màu xanh), nhưng khi có sự bắt cặp xảy ra, hai mẫu dò sẽ được sắp xếp sao cho phần đầu của mẫu dò này tiếp xúc với phần cuối của mẫu dò kia, lúc đó chất nhận huỳnh quang sẽ phát ra một ánh sáng huỳnh quang mới có bước sóng lớn hơn ánh sáng mà nó nhận được (màu đỏ) nhờ hiệu ứng FRET (sự chuyển năng lượng huỳnh quang kiểu cộng hưởng). Cường độ ánh sáng huỳnh quang phát ra tỷ lệ thuận với hàm lượng DNA trong mẫu. Ưu điểm của phương pháp này là việc thiết kế mẫu dò tương đối linh động, dễ dàng hơn so với việc thiết kế beacon. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 26 Hình 1.9. Tóm tắt cơ chế hoạt động của probe đôi trong Real-time PCR [7] Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 27 v Mẫu dò thủy giải (Hydrolysis probe) Còn được gọi là Taqman probe. Mẫu dò này được gắn một chất phát huỳnh quang (reporter) ở đầu 5’ và một chất “dập tắt” huỳnh quang (quencher) ở đầu 3’ sao cho ánh sáng huỳnh quang phát ra bị hấp thu bởi quencher. Trong phản ứng PCR, mẫu dò này sẽ bắt cặp bổ sung đặc hiệu với trình tự DNA mục tiêu, khi Taq polymerase kéo dài mạch bổ sung từ đầu 3’ của mồi đến tiếp xúc với mẫu dò, nó sẽ thể hiện hoạt tính 5’ - 3’ exonuclease là loại bỏ các nucleotide ở đầu của mẫu dò và thay bằng nucleotide mới. Khi đó, chất phát huỳnh quang sẽ tách rời khỏi mẫu dò và phát tín hiệu, còn quencher bị mất tác dụng dập tắt. Ánh sáng huỳnh quang phát ra sẽ tương ứng với hàm lượng sản phẩm PCR có trong phản ứng. Taqman probe có tính đặc hiệu cao, chỉ bắt cặp và phát tín hiệu nếu trình tự bổ sung với mạch khuôn là hoàn toàn, vì vậy các sản phẩm ký sinh nếu có cũng không được phát hiện. Thông thường, Taqman probe có nhiệt độ nóng chảy (Tm) cao hơn cặp mồi từ 8 - 10oC nhằm tạo điều kiện cho việc bắt cặp và thủy giải mẫu dò bởi Taq polymerase. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 28 Hình 1.10. Tóm tắt cơ chế hoạt động của Taqman probe trong Real- time PCR [7] Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 29 ü Một số điều lưu ý khi thực hiện phản ứng Real-time PCR - Kích thước sản phẩm PCR trong phản ứng Real-time PCR Chiều dài tối ưu của sản phẩm PCR trong phản ứng Real-time PCR thường nhỏ hơn 100bp. Đôi khi có thể tăng kích thước sản phẩm nhân bản đến 400bp trong một số trường hợp với Taqman probe. Sản phẩm PCR có kích thước ngắn, nhân bản hiệu quả hơn và chịu các điều kiện bất lợi của phản ứng tốt hơn so với các sản phẩm có kích thước dài có thể biến tính ở nhiệt độ 92oC và chỉ cần 15 giây để Taq polymerase tổng hợp hoàn toàn một mạch mới bổ sung. - Probe Người ta thường thiết kế probe trước khi thiết kế cặp primer. Cặp primer được thiết kế phải nằm gần với vị trí của probe nhưng không được trùng lắp. Thành phần GC trong trình tự nucleotide của probe phải nằm trong khoảng 20 - 80%. Cần tránh các nucleotide lặp lạ