Khóa luận Ứng dụng phương pháp mô học truyền thống khảo sát sự biến đổi cấu trúc tế bào tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbegii De Man 1879) bị bệnh đục thân

giới (FAO Fishery Statistics, 2002) Hình 2.5: Biểu đồ phân bố sản lƣợng TCX trên thế giới qua các năm (FAO Fishery Statistics, 2002) Có nhiều hình thức nuôi TCX hiện nay nhƣ nuôi tôm trên ruộng lúa, nuôi trong ao, nuôi trong mƣơng vƣờn, nuôi trong đăng và lồng, nuôi đơn hay nuôi hỗn hợp với cá, …. Năm 1984, sản lƣợng TCX thế giới đạt 5.246 tấn, năm 1989 đạt 17.608 tấn và năm 2000 đạt trên 119.000 tấn (FAO, 2002). Hầu hết sản lƣợng TCX trên thế giới đƣợc nuôi ở Châu Á, trong đó Trung Quốc có sản lƣợng lớn nhất, khoảng 128.000 tấn vào năm 2001. Năm 2002, Trung Quốc chiếm 58% tổng sản lƣợng TCX của thế giới. 9 Nghề nuôi TCX ở nƣớc ta là một nghề truyền thống, đặc biệt là vùng đồng bằng sông Cửu Long. Việc nghiên cứu sản xuất giống TCX đã đƣợc bắt đầu từ đầu thập niên 80 với qui trình nƣớc trong hở và tuần hoàn. Tuy nhiên, việc sản xuất giống nhân tạo chỉ phát triển từ 1999 khi nhu cầu con giống ngày càng cao, khi nghiên cứu và áp dụng thành công quy trình nƣớc xanh cải tiến. Trong nuôi tôm thịt, năm 2002 cả nƣớc đạt 10.000 tấn, chủ yếu tập trung sản lƣợng tại các tỉnh vùng đồng bằng sông Cửu Long nhƣ An Giang, Cần Thơ, Đồng Tháp, Bến Tre với diện tích nuôi mỗi tỉnh khoảng 200 – 800 ha. Có nhiều mô hình nuôi trồng thuỷ sản khác nhau đƣợc nông dân ứng dụng, phổ biến nhất là mô hình nuôi TCX luân canh với lúa, đạt 686 kg/ha/vụ, nuôi tôm kết hợp với lúa đạt năng suất bình quân 4,12 tấn/ha/vụ, nuôi ao đạt 1,2 tấn/ha/vụ, nuôi tôm đăng quầng trên sông (phát triển mạnh tại Đồng Tháp) với khoảng 300 quầng năm 2001 và 1.500 quầng vào năm 2002. Nhìn chung, nghề nuôi TCX trên thế giới hiện nay đang trên đà phát triển mạnh và sản lƣợng sẽ tăng 12 - 30 % mỗi năm và có thể đạt 750.000 – 1.000.000 tấn/năm vào năm 2010, trong đó Trung Quốc chiếm ƣu thế nhất về sản lƣợng, tiếp theo là Việt Nam, Ấn Độ, Bangladesh, Thái Lan. Tuy nhiên, sự phát triển nhanh chóng nhất của nghề nuôi TCX là trong những năm 1999 – 2001 với tốt độ tăng trƣởng đạt 30%/năm, đặt ra nhiều vấn đề cần xem xét để phát triển bền vững nghề nuôi tôm với bài học sâu sắc từ sự phát triển của nghề nuôi tôm biển (New, 2005). Rất nhiều vấn đề liên quan đến TCX đã và đang tiếp tục nghiên cứu và góp phần quan trọng vào ứng dụng thực tế (New, 2005). 2. 4 Các bệnh thƣờng gặp trên tôm càng xanh 2.7.1 Bệnh trên ấu trùng tôm càng xanh 2.4.1.1 Bệnh hoại tử cơ (idiopathic muscle necrosis) (IMN) Bệnh đƣợc biết bởi nhiều tên khác nhau: bệnh trắng cơ (white muscle disease), bệnh hoại tử cơ (muscle necrosis), bệnh đục cơ (muscle opacity hoặc milk prawn disease) (Tonguthai, 1997). Bệnh gây nên tỉ lệ chết cao ở ấu trùng TCX bởi các sợi cơ hoại tử. Nash và c.t.v. (1987) cho rằng IMN gây chết đến 60% ở hậu ấu trùng 28 ngày tuổi trong các trại sản xuất giống ở Thái Lan. Trên Macrobrachium rosenbergii, IMN 10 xảy ra khi tôm bị sốc môi trƣờng, do không đảm bảo vệ sinh, do thay đổi nhiệt độ, do giảm oxi hoà tan, do hoạt động quá mức hay do môi trƣờng sống chật hẹp. Bệnh cũng có thể xảy ra sau khi đem hậu ấu trùng đƣa vào ao nuôi thịt 1 hoặc 2 ngày, có thể do tôm bị sốc khi vào sống trong môi trƣờng mới. Để khống chế sự việc này, nên giữ hậu ấu trùng tôm trong ao ƣơng vài ngày trƣớc khi chính thức thả vào ao nuôi. 2.4.1.2 Bệnh giữa chu kỳ (mid-cycle disease) (MCD) Nhìn chung bệnh xảy ra từ giai đoạn ấu trùng thứ VI đến XI. Anderson và c.t.v. (1990) cho biết một tỉ lệ chết cao xảy ra trên ấu trùng ở các trại ƣơng TCX ở Malaysia trong khoảng thời gian 16 ngày sau khi nở. Triệu chứng bệnh tƣơng tự trong trƣờng hợp thối rữa do vi khuẩn xảy ra trong tự nhiên. Ấu trùng bỏ ăn hay giảm ăn và xảy ra hiện tƣợng ăn thịt lẫn nhau (các con yếu bị con khoẻ hơn ăn thịt). Ấu trùng bị bệnh thƣờng có màu nâu xanh và bơi một cách yếu ớt và không thể định phƣơng hƣớng. Hiện không xác định đƣợc tác nhân gây bệnh, có thể là do Enterobacter aerogenes (Johnson, 1978; Brock, 1988). Brock (1983) cho rằng chế độ vệ sinh tốt không thể chống lại mầm bệnh, cần nên có chế độ dinh dƣỡng đặc biệt với đầy đủ artermia cần thiết. 2.4.1.3 Bệnh hoại tử cơ do vi khuẩn (bacterial necrosis) Những con ấu trùng bị bệnh, thân tôm thƣờng có màu xanh xám, không ăn, yếu ớt và rơi xuống đáy bể, trên râu và trên các phần phụ xuất hiện những đốm nâu. Tác nhân gây bệnh này đã đƣợc xác định, bao gồm các vi khuẩn hình sợi Leucothrix spp., các cầu khuẩn và các vi khuẩn hình que hiện diện trên các sợi mang và trên các phần phụ. Bệnh thƣờng xâm hại trên các ấu trùng IV-V, gây nên sự chết hàng loạt (100%) trong 48 giờ (Aquacop, 1977). 2.4.1.4 Bệnh phát sáng (luminous disease) Vibrio harveyi đƣợc xác định là tác nhân gây nên bệnh này trên các ấu trùng giai đoạn sớm, một bệnh rất thƣờng gặp cả trên đối tƣợng tôm nƣớc ngọt và tôm nƣớc mặn. Ngoài đặc điểm phát sáng vào ban đêm, một đặc điểm rất dễ nhận thấy, còn có thể quan sát thấy trên các con tôm bệnh các vùng cơ mờ đục, bơi lội yếu dần và chết. Đây là một căn bệnh nghiêm trọng, có khả năng gây chết đến 100%, và có thể kháng lại một số thuốc sử lý. Sae-oui và c.t.v. (1978) đã làm một thí nghiệm kiểm tra tính nhạy cảm của Vibrio harveyi tìm thấy trên P. merguiensis, kết quả chứng minh rằng 11 Ca(HOCl)2 với nồng độ 20 – 30 ppm hoặc formalin nồng độ 50 ppm có khả năng giết chết hoàn toàn loài vi khuẩn này trong môi trƣờng. 2.4.1.5 Bệnh lột vỏ không hoàn toàn (exuvia entrapment disease) (EED) Bệnh ảnh hƣởng nặng nhất trên TCX ở giai đoạn ấu trùng cuối và giai đoạn PL sớm, đƣợc xem nhƣ một hội chứng. Ấu trùng bị hội chứng này không thể lột vỏ hoàn toàn ra khỏi các phần phụ khi chúng thay vỏ, nhƣ không thể trút vỏ khỏi mắt, chủy hay các phần phụ khác của cơ thể, hoặc sau khi lột vỏ chúng trở nên dị tật, kết quả tạo sự cản trở khi chúng di chuyển và có thể khiến chúng bị chết. Nguyên nhân của hội chứng này không đƣợc rõ, có thể do chất lƣợng nƣớc trong bể nuôi quá bẩn hay do khẩu phần dinh dƣỡng không hợp lý. 2.4.1.6 Bệnh do động vật nguyên sinh Zoothamnium sp., Epistylis sp., Vorticella sp., Acineta sp. là những động vật nguyên sinh đƣợc biết là có khả năng gây bệnh trên ấu trùng loài tôm Macrobrachium rosenbergii. Chúng gây nên những vệt mờ đục trên tôm ấu trùng, có thể đƣợc loại bỏ khi ấu trùng lột xác, nhƣng cũng có khả năng gây cản trở quá trình lột xác và gây chết. Ấu trùng có nhiều khả năng bị tấn công hơn tôm trƣởng thành, nguyên nhân do các ao nuôi kém vệ sinh, chất lƣợng nƣớc xấu, khi cải thiện chất lƣợng nƣớc ao nuôi bệnh sẽ hết. 2.4.1.7 Bệnh do virus Cho đến ngày nay, những loài virus đƣợc phát hiện là tác nhân gây bệnh dịch trên TCX bao gồm Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) và Extra small virus (EXV) (Qian và c.t.v., 2003); Parvolike virus (Anderson và c.t.v., 1990; Lightner và c.t.v., 1994); Infectious hypodermal and haematopancreatic necrosis virus (IHHNV) (Hsieh và c.t.v., 2006). Đối với WSSV (White Spot Syndrome Virus), TCX hoàn toàn có khả năng kháng lại mầm bệnh xâm nhiễm bằng một cơ chế đặc biệt vẫn chƣa hiểu rõ (Hameed, 2000). 2.4.1.8 Bệnh do cấu trúc lớp vỏ không bình thƣờng Lớp vỏ đƣợc cấu tạo chủ yếu bằng canxi hay có thể nói canxi chính là bộ xƣơng của loài giáp xác này. Chính vì thế nếu thành phần canxi trong lớp vỏ thay đổi, trở nên quá ít hay quá nhiều, lớp vỏ sẽ trở nên mềm hoặc bị dị dạng, cản trở sự di chuyển và 12 sự phát triển của tôm (ảnh hƣởng đến khả năng săn mồi, trốn tránh kẻ thù, khó lột vỏ, ...), có thể gây chết tôm nhƣng thƣờng ở tỉ lệ thấp. 2.7.2 Những bệnh thƣờng gặp trên tôm trƣởng thành 2.4.2.1 Bệnh tổn thƣơng lớp vỏ Bệnh này đƣợc biết bởi nhiều tên khác nhau: bệnh đốm nâu, bệnh đốm đen. Chƣa rõ nguyên nhân gây nên bệnh này, có thể do nhiều tác nhân khác nhau gây nên, bao gồm những tổn thƣơng của lớp kitin hay những bất thƣờng do cơ học, do dinh dƣỡng, do tác nhân hoá học hoặc những nhân tố khác, tạo điều kiện cho vi khuẩn hay nấm xâm nhập gây bệnh. Những con tôm bị bệnh có triệu chứng hoại tử, sƣng viêm và sau đó để lại các vết đen trên thân và trên các phần phụ khác. Môi trƣờng nƣớc quá bẩn, nhiều chất hữu cơ với mật độ vi khuẩn cao đƣợc coi là nguyên nhân gây nên sự thƣơng tổn lớp vỏ của TCX (Macrobrachium rosenbergii), bao gồm các vi khuẩn có khả năng sinh enzyme ngoại bào (lipase và protease) nhƣ Aeromonas sp., Pseudomonas sp., Vibrio sp. 2.4.2.2 Bệnh đen mang (black gill disease) Mang tôm xuất hiện những vết đen là do sự tập trung của các sản phẩm hóa học hay do quá trình nitơ hoá dẫn đến sự đen hóa cơ quan mang của tôm (Tonguthai, 1997), tôm có thể bị chết do stress vì nồng độ amonia hay nitrite trong ao nuôi, quá cao so với ngƣỡng nồng độ nitrite thấp nhất có thể gây chết tôm khoảng 2 mg/l (Tonguthai, 1997). Những nghiên cứu mô bệnh học cho thấy có sự tập trung sắt trong tế bào mang TCX, đây có thể là kết quả của sự ô nhiễm sắt trong ao nuôi. 2.4.2.3 Bệnh trắng thân (white prawn disease) Đôi khi đƣợc gọi là hội chứng trắng, chỉ tấn công TCX (Macrobrachium rosenbergii) trƣởng thành, thƣờng trên tôm cái. Bệnh tấn công làm lớp mô bên dƣới lớp kitin chuyển trắng đục và mềm nhƣng các mô cơ vẫn bình thƣờng. 2.4.2.4 Bệnh đỏ thân (red discoloration) Bệnh chỉ gây hại trên tôm trƣởng thành, làm biến đổi màu sắc phần đuôi sang màu đỏ nhạt, có thể do sự phân tán sắc tố hay mất một số sắc tố. Hiện nay chƣa xác định đƣợc tác nhân gây nên bệnh này. 2.4.2.5 Bệnh do kí sinh trùng 13 2.4.2.6.1 Protozoa Hall (1979) cho rằng Corthunia sp., Epistylis sp., Vorticella sp. là những động vật nguyên sinh gây bệnh phổ biến nhất. Thông thƣờng chúng ký sinh trên lớp vỏ bên ngoài, trong hốc mắt, râu, chân đuôi (uropod) và trứng (trên tôm cái đang mang trứng). Một khi chúng kí sinh trên thân tôm, chúng sẽ làm cản trở quá trình lột xác của tôm và có thể gây chết do thiếu oxi huyết. 2.4.2.6.2 Metazoan Macrobrachium spp. đóng vai trò nhƣ một vật chủ trung gian mang ấu trùng của loài sán lá Carnaeophallus choanophallus (Johnson, 1978). Trên tôm Macrobrachium rosenbergii trƣởng thành nuôi ở Thái Lan cũng đã phát hiện một loài sán lá ký sinh nhƣng chƣa định danh đƣợc (Nash, 1989). 2.4.2.6.3 Isopod Nhóm động vật chân chèo gây hại trên tôm nƣớc ngọt thuộc về họ Bopyridae (Johnson, 1978). Một loài Isopod tìm thấy trong mang của những con tôm bệnh đã đƣợc nghiên cứu và phân loại, có thể là loài Probopyrus buitendijki, đƣợc cho là tác nhân ký sinh trên Macrobrachium rosenbergii ở vùng Đông Nam Á. 2. 5 Bệnh đục thân Bệnh xuất hiện ở một số quốc gia và vùng lảnh thổ: Khu vực châu Á (Trung Quốc, Đài Loan, Ấn Độ, Thái Lan, Philippin, Malaisia) và vùng Caribbean (Cộng hoà Dominican, những hòn đảo phía Tây nƣớc Pháp). Gần đây bệnh đã xuất hiện tại các trại sản xuất giống của Việt Nam. Bệnh đục thân gây một số triệu chứng lâm sàng sau: Các bó cơ mờ đục (Akiyama và c.t.v., 1982; Nash và c.t.v., 1987; Brock, 1988). Xảy ra với xác xuất cao nhất ở giai đoạn ấu trùng thứ IV - VI. Tôm bỏ ăn, rớt xuống đáy bể nuôi và bị ăn thịt bởi những ấu trùng khỏe hơn. Hình dáng ngoài của tôm có màu xám xanh, bơi yếu ớt, thƣờng bơi theo đƣờng xoắn ốc. Tỉ lệ chết cao, đột ngột, có thể lên đến 100% trong vòng 5 ngày kể từ khi phát hiện có dấu hiệu bị đục cơ. 14 Lờ đờ, giảm ăn, phần cơ bụng có màu trắng đục. Vùng đuôi (telson) bị đục trƣớc và dần dần chuyển sang phần thân tôm, và sau một thời gian thì tất cả cơ phần bụng và phần đầu ngực đều chuyển sang màu trắng đục. Triệu chứng mô học o Hao mòn khối gan tụy (Bower, 1998). o Hoại tử các sợi cơ (Vijayan, 2005; Bonami, 2005; Qian, 2003). Hình 2.6: Dấu hiệu lâm sàng bệnh đục thân trên TCX (Hameed (A, C); Vijayan, 2005 (B), Cheng và Chen, 1998 (D)). (A) và (B) Sự trắng cơ xảy ra trên PL TCX, cho thấy sự biến đổi hoàn toàn màu sắc PL. (C) và (D) Sự trắng cơ xảy ra trên tôm trƣởng thành; (D) So sánh hai mẫu tôm bệnh và không bệnh đục cơ, ở trạng thái bình thƣờng có màu hơi đục, khối gan tụy có màu gạch tƣơi (hình phía trên), khi bệnh, cơ chuyển sang đục và khối gan tụy chuyển màu vàng nhạt (hình phía dƣới). Theo Tonguthai (1977), trên TCX có nhiều bệnh gây triệu chứng đục cơ: Idiopathic muscle necrosis (IMN) (Nash và c.t.v., 1987; Brock, 1988), Larval mid- cycle disease (MCD) (Anderson và c.t.v., 1990; Johson, 1979; Brock, 1988), Bacterial A B C D 15 necrosis (Aquacop, 1977), Viral disease (Anderson và c.t.v., 1990), white muscle disease (white tail disease) (Hameed, 2005). Tác nhân gây nên căn bệnh này hiện vẫn chƣa rõ. Brower (1998) cho rằng Enterobacter aerogenes có khả năng gây hiện tƣợng đục cơ trên ấu trùng TCX ở giai đoạn IV-XI, Cheng và Chen (1998) đề nghị một loài vi khuẩn giống Enterococcus (Enterococcus-like bacterium) (Hình 2.7). Gần đây dịch bệnh trắng đuôi bùng phát tại nhiều quốc gia trên thế giới, gây triệu chứng đục các bó cơ ở phần đuôi TCX. Nhiều tác giả đã nghiên cứu và công bố tác nhân chính là MrNV (Macrobrachium rosenbergii nodavirus) và XSV (extral small virus) (Yoganandhan, 2006; Vijayan, 2005); Bonami, 2005; Qian, 2003). Hiện không có bất kỳ một bài báo khoa học nào ghi nhận những biến đổi mô học trên cơ thể TCX bị đục thân, ngoại trừ dấu hiệu hoại tử các bó cơ ở phần đuôi. Hình 2.7: Hình dạng tế bào của Enterococus KM002 dƣới kính hiển vi điện tử (Cheng & Chen, 1998) Enterococcus-like bacterium là một song cầu khuẩn Gram (+), có quan hệ gần gũi với Enterococcus seriolicida, vi khuẩn giống Enterococcus này đƣợc phát hiện trên tôm bị đục thân tại Hàn Quốc (Cheng và Chen, 1998). Thực nghiệm của tác giả này cho thấy rằng khi xâm nhiễm vi khuẩn này vào Macrobrachium rosenbergii sẽ gây tỉ lệ chết cao, gây chết 100% trong vòng một tuần. MrNV là một RNA virus hình đa diện, tròn có đƣờng kính 26-27 nm, một chủng trong họ Nodaviridae (Hình 2.8). Bộ gen gồm 2 phân tử RNA-1 và RNA-2 kích thƣớc tƣơng ứng là 2,9 và 1,3 kb. Vỏ capsid là một loại prôtein có trọng lƣợng phân tử 43 kDa (Bonami và c.t.v., 2005). Là một RNA virus, MrNV thực hiện quá trình sao chép trong nguyên sinh chất của hầu hết các tổ chức mô cơ thể TCX. XSV, một tiểu 16 thể giống virus có liên quan đến MrNV, có hình đa diện đƣờng kính 14-16 nm. Bộ gen của XSV là một phân tử RNA kích thƣớc 0,9 kb, mã hoá tạo nên vỏ capsid là hai chuỗi polipeptide trọng lƣợng phân tử 16 và 17 kDa (Bonami và Widada, 2004). Là một tiểu thể giống virus có kích thƣớc nhỏ, lại không mang các đoạn gen mã hoá enzyme cho quá trình sao chép, Widada và Bonami (2004) cho rằng cần có sự hiện diện của MrNV nhƣ là một yếu tố xúc tác không thể thiếu cho quá trình sao chép XSV trong các tổ chức mô TCX. Tuy vậy quan hệ này vẫn chƣa đƣợc hiểu rõ ràng. Hình 2.8: Hình dạng XSV (A) và MrNV (B) dƣới kính hiển vi điện tử (Bonami và c.t.v., 2005). Bar = 100 nm. Vị trí của MrNV trong họ Nodaviridae đƣợc ghi nhận trong Hình 2.9. Hình 2.9: Vị trí của Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) trong họ nodavirus (Bonami, 2005) A B A 17 2. 6 Các phƣơng pháp nghiên cứu mô học 2.6.1 Phƣơng pháp mô học truyền thống Phƣơng pháp mô học truyền thống là phƣơng pháp dùng kính hiển vi quang học (độ phóng đại tối đa 1.200 lần) quan sát cấu trúc mô, cấu trúc tế bào, xác định các trạng thái bệnh lý của mô - tế bào. Mẫu đƣợc cố định trong dung dịch Davision (mẫu giáp xác) hoặc dung dịch Bouin (mẫu cá), sau đó đem xử lý, đúc parafin, cắt và nhuộm. Quan sát lát cắt bằng kính hiển vi quang học. 2.6.2 Phƣơng pháp phóng xạ tự chụp Phƣơng pháp này dùng để khảo sát các hiện tƣợng bên trong mẫu mô bằng cách dùng phóng xạ. Ngƣời ta đƣa các tiền chất là các phân tử phóng xạ nhƣ: acid amin phóng xạ, nucleotide phóng xạ vào tế bào. Các phân tử này đƣợc tế bào tổng hợp thành các phân tử có cấu trúc lớn hơn. Tiêu bản đƣợc phủ một lớp tráng (lớp phim) và đƣợc bảo quản trong hộp tối. Các hạt Bromide bạc khi gặp phóng xạ sẽ hình thành các hạt bạc đen. Cấu trúc có chứa phân tử phóng xạ sẽ thấy có những hạt bạc đen. Mẫu đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi quang học hoặc kính hiển vi điện tử. Phƣơng pháp này cho biết nhiều hoạt động của nhiều cấu trúc ở cấp độ vi thể. 2.6.3 Phƣơng pháp hóa mô miễn dịch Dựa trên lý thuyết kết gắn kháng nguyên với kháng thể. Kháng thể đƣợc dùng có chất đánh dấu để phát hiện và định vị các prôtein đặc hiệu. Tùy theo chất đánh dấu (huỳnh quang, men, hạt vàng) mà tiêu bản đƣợc quan sát ở các loại kính hiển vi khác nhau. 2.6.4 Phƣơng pháp lai tại chổ Kỹ thuật này phù hợp để phát hiện các DNA bất thƣờng. Chuỗi DNA đƣợc biến tính bằng nhiệt độ hay hóa chất tạo dạng sợi đơn. Sau đó đƣợc gắn với đoạn dò (probe) chuyên biệt có đánh dấu. 18 2. 7 Cấu trúc tế bào chơ quan gan tụy và mang tôm càng xanh 2.7.1 Cấu trúc tế bào cơ quan gan tụy Hình 2.10: Cấu trúc tế bào cơ quan gan tụy TCX (Cheng và Chen, 1998). Hp - tế bào F; Hpb - tế bào B; Hbr - tế bào R; Mfn – nhân tế bào biểu mô; Mef - lớp tế bào biểu mô; Sin – xoang tạo máu; Lm – lumen. Haematoxylin và Eosin. Hình 2.10 mô tả cấu trúc tế bào cơ quan gan tụy (Cheng và Chen, 1998) trên Macrobrachium rosenbergii không mang bệnh, cho thấy khá rõ cấu trúc của các tổ chức tế bào khác nhau. Ở tôm bình thƣờng không mang bệnh, tiếp diện ngang của khối gan tụy cho thấy một cấu trúc gồm nhiều tuyến hình ống (tubule) liên kết chặt chẻ với nhau bằng một lớp biểu mô liên kết đơn. Tiếp diện ngang của thành trong của các tubule này có dạng hình hoa thị thông đến bộ máy tiêu hóa. Các tế bào trong khối gan tụy đƣợc phân thành nhiều nhóm khác nhau: nhóm tế bào E (E-cells) (embryonic cells) ở giai đoạn đầu của sự phát triển (tế bào mầm), tìm thấy ở biên của tuyến hình ống; nhóm tế bào F (F-cells) (Fibrillezellen cells) bắt màu đen và không có không bào trên tiêu bản quan sát dƣới kính hiển vi quang học; nhóm tế bào B (B-cells) (Blasenzellen cells) hình cầu trong chứa dịch chất tiêu hóa; nhóm tế bào R (R-cells) (Restzellen cells) dự trữ năng lƣợng chứa những giọt lipid và mạng lƣới nội chất nhám. Một vài tế bào trên tiêu bản đang trong giai đoạn phân chia tế bào. Những kẻ hở giữa các tuyến hình ống đƣợc xem là bình thƣờng. 19 2.7.2 Cấu trúc tế bào cơ quan mang Hình 2.11: Cấu trúc tế bào cơ quan mang (Li, Zhao và Yang, 2006), cho thấy sự sắp xếp tuần tự của các phiến mang (L - lamellae) và các khoảng trống (ILS - interlamellar space). HC - hemocyte; PC - pillar cell. Haematoxylin và Eosin, x 20. TCX có 16 sợi mang, mỗi bên 8 sợi, dài 4 – 8 mm ở tôm chƣa trƣởng thành. Bề mặt của mỗi sợi mang đƣợc bao phủ bởi một lớp kitin mỏng, phía dƣới lớp kitin là một lớp biểu mô đơn. Trên mỗi sợi mang có nhiều phiến mang (lamellae), bên trong chứa hồng cầu và biểu mô (Hình 2.11). 20 Phần III BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP THỰC HIỆN 3.1 Bố trí thí nghiệm 3.1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện Thời gian: từ 4/2007 đến 8/2007. Địa điểm phân tích: Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo môi trƣờng và Phòng ngừa dịch bệnh thủy sản khu vực Nam Bộ (trực thuộc Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản II). Địa điểm thu mẫu: o Trại giống 1: Thị xã Long Xuyên, tỉnh An Giang. o Trại giống 2: Huyện Châu Thành, An Giang. o Trại giống 3: Xã Quới Sơn, Huyện Châu Thành, Bến Tre. o Trại giống 4: Xã An Hiệp, Huyện Châu Thành, Bến Tre. 3.1.2 Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc chia thành hai nhóm: Thu mẫu định kỳ: tại trại giống chú Hùng và trại giống Hải Duyên. o Tại trại giống 1: Thu mỗi lần 4 mẫu x 3 lần. o Tại trại giống 2: thu 3 lần, lần 1 thu 9 mẫu (B1  B9), lần 2 thu 5 mẫu (B2, B3, B5, B6,B7), lần 3 thu 1 mẫu (B6). Thu mẫu bệnh: tại trại giống 3 và trại giống 4. 3.2 Vật liệu, trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất 3.2.1 Trang thiết bị, dụng cụ, hoá chất cần chuẩn bị 3.2.1.1 Trang thiết bị Máy xử lý mẫu tự động Bình rót parafin Bộ phận làm lạnh mẫu Máy cắt mẫu microtome 21 Nồi nƣớc có chỉnh nhiệt độ Bàn ấm cố định mẫu trên lam kính Tủ ấm Máy nhuộm mẫu tự động Kính hiển vi quang học 3.2.1.2 Dụng cụ Khung chứa mẫu có nấp đậy Đèn cồn Kéo Panh Khung inox dùng để đúc mẫu Lam Lamel 3.2.1.3 Hoá chất Cồn 70% Cồn 80% Cồn 90% Cồn tuyệt đối 99,5% Chloroform Parafin Xylen Thuốc nhuộm Hematoxylin, Eosin Keo dán: Baum Canada Formalin Acid acetic glacial Nƣớc cất 3.2.2 Phƣơng pháp tiến hành 3.2.2.1 Lấy mẫu 22 Khối gan tụy của tôm bị tiêu hủy rất nhanh sau khi tôm chết (sự tiêu hủy mô do các enzyme tiết ra từ các tế bào gan tụy đã chết), điều này có nghĩa là cấu trúc của khối gan tụy khi tôm chết sẽ bị phân huỷ rất nhanh. Do đó mẫu phải đƣợc cố định nhanh khi tôm vẫn còn sống, để đảm bảo cấu trúc mô học của khối gan tụy không bị thay đổi. Dung dịch Davision có thành phần nhƣ sau: Acid acetic glacial : 115ml Cồn 95% : 330ml Formalin : 200ml Nƣớc cất : 335ml Hoà tan các thành phần lại với nhau và bảo quản ở nhiệt độ phòng. Theo FAO (2000), nên ngâm trực tiếp ấu trùng và hậu ấu trùng (Postlarvae) (PL) giai đoạn sớm trong dung dịch cố định với tỉ lệ tối thiểu là 10 thể tích dung dịch cố định với 1 thể tích mô tôm. Thể tích này rất quan trọng trong việc bảo quản mẫu có hiệu quả, việc cố gắng làm giảm tỉ lệ này để giảm chi phí có thể làm cho mẫu mô không đạt yêu cầu cho quá trình đọc mẫu. 3.2.2.2 Xử lý mẫu Mẫu tôm post sau khi cố định xong tiến hành xử lý mẫu. Mẫu đƣợc lấy ra khỏi dung dịch cố định và tiến hành xử lý mẫu, với sơ đồ nhƣ sau: Tổng thời gian xử lý mẫu là 12,5 giờ. Sau khi xử lý xong tiến hành đúc mẫu. 3.2.2.3 Cách đúc mẫu Mục đích của việc đúc mẫu là làm cho mẫu tôm đƣợc cố định để có thể cắt với lát mỏng (khoảng 5µm) cho việc quan sát trên kính hiển vi dễ dàng, chính xác không làm thay đổi cấu trúc của các tổ chức tế bào. Cần phải thực hiện tuần tự theo các bƣớc sau: 23 Đặt mẫu vào đáy khuôn inox sao cho mặt tiếp xúc của mẫu với đáy khuôn là lớn nhất. Thực hiện bƣớc này tốt thì hình ảnh khối gan tụy và cơ quan mang có diện tích lớn, dễ quan sát cấu trúc mô bên trong. Rót parafin vào khuôn, cố gắng giữ mẫu sao cho mẫu ở trung tâm khuôn (để khi tiến hành cắt mẫu và quan sát trên kính hiển vi đƣợc tốt hơn), đậy nắp cassette lại. Đặt khuôn inox lên trên bề măt của dụng cụ làm lạnh, đợi khoảng 15 phút sau tách khối parafin ra đặt trực tiếp lên bàn lạnh. 3.2.2.4 Cách cắt mẫu Dùng máy cắt microtome, lát cắt có độ dày 5 – 6 micromet. Lát cắt đƣợc đặt lên lam, cho vài giọt cồn 70% lên, làm căng bề mặt mẫu bằng cách cho qua bể nƣớc ấm khoảng 40oC, sau đó đính mẫu lên lam và đặt vào bàn ấm ở nhiệt độ 40oC trong vòng 4 đến 6 giờ thì tiến hành nhuộm mẫu. 3.2.2.5 Nhuộm mẫu Theo phƣơng pháp của Sheenhan và Hrapchak (1980), dùng thuốc nhuộm là Haematoxylin và Eosin. Sơ đồ nhuộm mẫu: Nhỏ một giọt keo Boume Canada ngay lên trên tiêu bản mẫu và đặt lamel lên, ép sát lame lên lam kính, cố gắng tránh sự hình thành bọt khí bên trong. 3.2.2.6 Quan sát trên kính hiển vi Đặt tiêu bản lên kính hiển vi, tiến hành quan sát hình thái cấu tạo tế bào khối gan tụy, cơ quan mang, cơ của mẫu. 24 Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả Bằng phƣơng pháp mô học truyền thống, chúng tôi đã khảo sát cấu trúc tế bào TCX (Macrobrachium rosenbergii De Man 1879) bị bệnh đục thân và không bị bệnh đục thân nhƣng có những dấu hiệu bất thƣờng. Tổng số mẫu tôm chúng tôi thu đƣợc là 34 mẫu ấu trùng và hậu ấu trùng tại An Giang và Bến Tre, các mẫu ấu trùng tôm đƣợc thu đều có dấu hiệu giảm ăn, ít vận động, bơi lội thất thƣờng (bơi lờ đờ, bơi theo đƣờng xoắn ốc, …) trong đó có 11 mẫu tôm ấu trùng và hậu ấu trùng thu tại Bến Tre bị đục thân. 4.1.1 Kết quả khảo sát mô học mẫu tôm càng xanh thu định kỳ không có dấu hiệu đục thân Các đặc điểm chung của mẫu ấu trùng và hậu ấu trùng TCX thu tại An Giang đƣợc trình bày trong Bảng 4.1. 25 Bảng 4.1: Dấu hiệu lâm sàng mẫu tôm thu ngẫu nhiên tại An Giang Trại giống Đợt Kí hiệu Ngày thu Tuổi thu (ngày) Tình hình chung Dấu hiệu lâm sàng mẫu thu 1 I B1 16/06/2007 18 (L) - Sản xuất giống theo qui trình nƣớc xanh cải tiến. - Chất lƣợng nƣớc bể nuôi không đƣợc đảm bảo, ban đầu tốt, tảo phát triển nhiều, sau chất lƣợng suy giảm, tảo không phát triển đƣợc, màu nƣớc chuyển sang trong và nâu. - Tỉ lệ chết tăng dần theo sự phát triển của ấu trùng tôm TCX. - Không bị đục thân. - Lờ đờ, biếng ăn, biếng động. - Mất phƣơng hƣớng, bơi xoay vòng. B2 -nt- 19 (L) B3 -nt- 20 (L) B4 -nt- 21 (L) II B1 29/06/2007 31 (L) B2 -nt- 32 (L) B3 -nt- 33 (L) B4 -nt- 34 (L) 2 I B1 16/06/2007 PL 4 B2 -nt- 16 (L) B3 -nt- 16 (L) B4 -nt- PL 5 B5 -nt- 16 (L) B6 -nt- 14 (L) B7 -nt- 17 (L) B8 -nt- 17 (L) B9 -nt- 14 (L) II B2 29/06/2007 39 (PL) B3 -nt- 27 (L) B5 -nt- 40 (PL) B6 -nt- 40 (PL) B7 -nt- 37 (PL) III B6 06/07/2007 49 (PL) Bảng 4.1 cho thấy tất