Khóa luận Xác định tính sinh miễn dịch và hiệu quả của các loại vacxin từ vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập trên cá tra tại các vùng địa lý vào các thời điểm khác nhau thuộc đồng bằng sông Cửu Long

ụng của cá nheo Ictalurus punctatus làm giảm khả năng đề kháng với vi khuẩn Ed. ictaluri và có thể gây ra một số phản ứng phụ. Sự kết hợp giữa kháng nguyên và chất bổ trợ phèn chua bằng phƣơng pháp truyền thống khác nhau đƣợc sử dụng cho A. salmonicide, Y. ruckeri với kết quả khác nhau. Theo Udey và Fryer (1984), hỗn hợp phèn chua đã đƣợc sử dụng làm chất bổ trợ với vacxin kháng Vibrioisis bằng phƣơng pháp ngâm giúp gia tăng tiếp thu kháng nguyên, nên đƣợc xem là có ý nghĩa trong việc gia tăng đáp ứng miễn 17 dịch cho cá. Tuy nhiên, các nghiên cứu về sử dụng chất này để làm chất bổ trợ trong các loại vacxin cho cá hiện vẫn còn ít (Trích dẫn Đỗ Thị Hòa và ctv., 2004). 18 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Từ tháng 3 đến tháng đầu tháng 6 năm 2007 tại Trung Tâm Quốc Gia Giống Thủy Sản Nƣớc Ngọt Nam Bộ, Viện NC NTTS II. Từ cuối tháng 6 đến đầu tháng 8 năm 2007 tại Phòng vi khuẩn, Phòng sinh học phân tử thuộc Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trƣờng và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thuỷ Sản Khu Vực Nam Bộ, Viện NC NTTS II. 3.2 Vật liệu, Dụng cụ, Hóa chất 3.2.1 Vật liệu 1/ Mẫu cá giống Cá giống gồm 966 con khoảng hai tháng tuổi, sạch bệnh, có kích cỡ từ 40 – 60 g đƣợc sản xuất và nuôi trong môi trƣờng tốt nhất tại Trung Tâm Quốc Gia Giống Thuỷ Sản Nƣớc Ngọt Nam Bộ (trực thuộc Viện NC NTTS II). 2/ Vi khuẩn Ba chủng vi khuẩn Ed. ictaluri phân lập tại ba địa điểm khác nhau xảy ra vào thời điểm dịch bệnh, cá thu mẫu có những dấu hiệu bệnh tích điển hình nhƣ bơi lờ đờ, bỏ ăn, xuất huyết các vây và gốc vây; bên trong gan, thận, lách có nhiều đốm trắng nhỏ. Trong đó chủng vi khuẩn EI151 đã đƣợc phân lập, định danh (test sinh hoá, PCR) và xác định liều gây chết 50% (LD50) trên cá thí nghiệm là 22.500 tbvk/cá (tƣơng đƣơng 2,25 x104 tbvk/cá). 19 Bảng 3. 1. Ba chủng vi khuẩn Ed. ictaluri phân lập ở các thời điểm khác nhau Lô Kí hiệu Triệu chứng lâm sàng Địa điểm Ngày thu A Ei-23 Phân lập từ gan cá tra (57 – 60g). Cá bỏ ăn, mang bị trắng; bên trong máu có màu hồng nhạt, gan có đốm, thận không sƣng. Vĩnh Long 11/2/2006 B Ei-151 Phân lập từ thận cá tra (chiều dài thân khoảng 24 cm). Cá bỏ ăn, bơi lờ đờ, vây, thân xuất huyết, gan và thận có mủ trắng. Đồng Tháp 21/6/2006 C Ei-338 Phân lập từ lách cá tra. Cá bỏ ăn, xuất huyết các vây và gốc vây, thận có mủ. Đồng Tháp 11/8/2006 3/ Thức ăn: Thức ăn cho cá dạng viên nổi, là sản phẩm của công ty Uni-President (Đài Loan) và công ty Thức Ăn Thủy Sản Seafood (An Giang). 3.2.2 Thiết bị và dụng cụ Các thiết bị - dụng cụ cho gây nhiễm thực nghiệm: Bể xi măng, Máy sục khí; Các bể kính dung tích 200L, vợt, lƣới, xô,... Cân phân tích, Bơm tiêm, Kéo, Kẹp, Ðèn cồn. Các thiết bị - dụng cụ cho phân tích mẫu: Kính hiển vi; Tủ lạnh; Máy lắc (Stuart Scientific); Máy ly tâm (Hettich Zentrifugen); Đĩa petri; Que cấy; Bình tam giác; Ống nghiệm; Ðĩa microplate 96 giếng (dạng hình chữ "U"); Pipetman và pipette. 20 3.2.3 Hoá chất - Dung dịch formalin 36 %; Dung dịch formol 0,4 % (Merck) - Thuốc gây mê cá (Ethylenglycol monophenylether – C2H10O2)(Merck) - Các chất bổ trợ: Montanide ISA 70 M-PG (Seppic, Pháp); Phèn chua (Merck, Mỹ). - Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: Môi trƣờng nƣớc thịt (NAVETCO); Môi trƣờng thạch máu (gồm môi trƣờng tổng hợp thƣơng mại và 7% máu cừu). - Hóa chất khác: Nƣớc cất vô trùng; Cồn 96o và 70o; Nƣớc muối sinh lý 0,85%. 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1 Chuẩn bị cá Vệ sinh bể, bắt cá vào bể từ năm đến bảy ngày trƣớc khi làm thí nghiệm. Cá trƣớc khi đƣa vào bể phải đƣợc cân và đo để chọn đàn cá tƣơng đối đồng nhất khi làm thí nghiệm. Thí nghiệm đƣợc bố trí trong điều kiện nhiệt độ môi trƣờng nƣớc khoảng 28 - 30 oC, hệ thống lọc nƣớc hoạt động liên tục, cho cá ăn thức ăn viên nổi hai lần/ngày vào lúc 6h và 17h, mỗi tuần thay bông lọc một lần cho máy lọc nƣớc. 3.3.2 Chuẩn bị vacxin Nuôi cấy vi khuẩn: Vi khuẩn từ các ống đông khô ria lên các đĩa thạch máu 7%, nuôi cấy từ 36 - 48 giờ ở nhiệt độ 28 - 30oC. Chọn khuẩn lạc to, đẹp, đứng riêng lẻ cho vào bình cầu chứa 250 ml nƣớc thịt dinh dƣỡng, nuôi cấy trên máy lắc trong vòng 36 - 48 giờ ở nhiệt độ 28 - 30oC, đo độ đục và đếm để xác định số lƣợng vi khuẩn. Bất hoạt vi khuẩn: Vô hoạt huyền dịch này bằng dung dịch formol với tỉ lệ 0,4 % trong 48 giờ ở nhiệt độ 4oC. Để kiểm tra lại vi khuẩn có hoàn toàn bị bất hoạt hay không, ta cấy vi khuẩn mới bất hoạt lên môi trƣờng thạch máu, nếu vi khuẩn không mọc, ta kết luận vi khuẩn đã bị bất hoạt. 21 Thêm chất bổ trợ: Trộn dung dịch chất bổ trợ (theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất) với canh khuẩn vô hoạt sao cho 0,2 ml vacxin chứa 108, 109 và 3x109 tế bào vi khuẩn (TBVK).  Vaxcin không có chất bổ trợ  Vaxcin với chất bổ trợ Montanide ISA 70 M-PG (70% chất bổ trợ và 30% tế bào vi khuẩn) dạng nhũ dầu.  Vaxcin với chất bổ trợ phèn chua 0,4%: sử dụng phèn chua tinh khiết pha với nƣớc cất tạo ra dung dịch 20%. Tiếp tục tổ hợp huyền dịch vi khuẩn đã bất hoạt với dung dịch phèn chua 20% với tỉ lệ 50:1. Hấp tiệt trùng ở 116oC trong 30 phút. 3.3.3 Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn sống Vi khuẩn từ ống đông khô ria lên các đĩa thạch máu, nuôi cấy từ 36 - 48 giờ ở nhiệt độ 28 - 30oC. Chọn khuẩn lạc to, đẹp, đứng riêng lẻ cho vào bình tam giác chứa 100 ml nƣớc thịt dinh dƣỡng, nuôi cấy ở 28 - 30oC trong vòng 36 - 48 giờ. Trƣớc khi sử dụng pha loãng bằng nƣớc muối sinh lý vô trùng ở độ pha loãng 10-2. Công cho cá với liều 0,2 ml/con (nếu nuôi vi khuẩn ở 28 - 30oC từ 36 - 48 giờ trong nƣớc thịt dinh dƣỡng thì nồng độ vi khuẩn đạt khoảng 5x108 CFU/ml). Ở độ pha loãng 10-2 thì 0,2 ml chứa khoảng 106 CFU. Xác định số lượng tế bào vi khuẩn sống: Pha loãng sáu lần theo hệ số 10 từ huyền dịch trên (100) để thành các dung dịch có độ pha loãng nhƣ sau: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 tƣơng ứng với các kí hiệu 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6. Từ mỗi độ pha loãng trên hút 20 µl nhỏ giọt lên đĩa thạch máu 7% (lặp lại hai lần), để khô rồi ủ ở 30°C trong 2 ngày. 22 3.3.4 Phƣơng pháp gây nhiễm thực nghiệm Cá đƣợc thuần trong bể kiếng từ bảy đến 10 ngày trƣớc khi tiến hành thí nghiệm. Gây nhiễm cho cá bằng cách tiêm vào xoang bụng. Tiêm cá với thể tích cố định là 0,2 ml/cá. Khi tiêm cá đƣợc gây mê bằng thuốc gây mê Ethylenglycol monophenylether nồng độ 0,17 ppm trong 2 – 3 phút. Dùng kim tiêm 1 ml tiêm trực tiếp vào xoang bụng cá sao cho kim tiêm và cá tạo thành một góc 30o (Hình 3.1). Hình 3. 1. Thao tác tiêm cá 3.3.5 Phƣơng pháp theo dõi cá sau khi gây nhiễm Sau khi gây nhiễm cá, theo dõi và ghi nhận các biểu hiện của cá trong bể, nếu cá chết trong vòng 24 giờ sau khi tiêm thì chứng tỏ cá bị sốc do tiêm. Theo dõi biểu hiện cá sau hai đến ba ngày gây nhiễm: cá bơi lờ đờ, bơi không định hƣớng, cá bỏ ăn, gầy yếu,... ngoài ra xem cá có xuất huyết các vây và gốc vây; xuất huyết hậu môn, hốc mắt, mắt đỏ, viêm loét chỗ tiêm,... Khi cá chết, giải phẫu cá có những biểu hiện xuất huyết nội tạng dẫn tới chảy máu xoang bụng, ruột chứa dịch vàng, xoang bụng chứa dịch trắng xem biểu hiện của các cơ quan bên trong nhƣ thận trƣớc và sau, gan, lách sƣng, nhũn, thâm đen, có mủ. 3.3.6 Phƣơng pháp thu mẫu máu, mẫu vi khuẩn 1/ Thu mẫu máu: Dùng kim tiêm 1 ml tiêm vào động mạch chủ lƣng, hƣớng kim nghiêng so với cá 30o, khi kim tiêm đụng xƣơng cá thì dừng lại, đƣa mũi kim lệch về phía 23 bụng, rút nhẹ pittông cho máu chảy lên (Hình 3.2). Lấy 0,6 ml máu/con cho vào eppendorf để lắng tách lớp, để qua đêm ở 4oC, rồi lấy phần huyết thanh cho vào eppendorf mới, bảo quản huyết thanh ở -20oC. Hình 3. 2. Thao tác lấy máu cá 2/ Thu mẫu vi khuẩn: Khi cá lờ đờ, sắp chết, mổ khám và chọn những cá có dấu hiệu bệnh tích điển hình. Tiến hành lấy mẫu vi khuẩn bằng cách dùng kéo vô trùng cắt phần thận hay gan, lách cho vào eppendorf vô trùng, giữ mẫu lạnh ở 4oC và chuyển về phòng thí nghiệm để tiến hành phân lập, định danh vi khuẩn (Hình 3.3). Hình 3. 3. Thao tác lấy mẫu vi khuẩn trên thận 24 3.3.7 Phƣơng pháp vi ngƣng kết xác định hiệu giá kháng thể Nguyên tắc: Phản ứng vi ngƣng kết là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu thể hiện dƣới dạng các hạt nhìn thấy đƣợc. Phản ứng này đƣợc thực hiện trên phiến nhựa 96 giếng. Pha loãng dung dịch kích thích ngay trên các dãy vi giếng của phiến nhựa bằng dung dịch đệm PBS có 0,6% BSA, cho đồng nhất thể tích huyền dịch kháng nguyên, trộn đều để yên ở nhiệt độ phòng hoặc qua đêm. Sau đó quan sát trực tiếp hoặc bằng kính lúp: nếu có mạng ngƣng kết bao phủ đáy là phản ứng dƣơng tính (+), ngƣợc lại nếu kháng nguyên tụ xuống đáy giếng thành một lớp màu trắng là phản ứng âm tính (-). Phƣơng pháp: + Chuẩn bị kháng thể: huyết thanh đƣợc xử lí bằng cách đun cách thủy 56 o C/32 phút để bất hoạt bổ thể. + Chuẩn bị kháng nguyên: vi khuẩn từ ống thạch nghiêng đã nuôi cấy 36 - 48h ở 28 - 30oC trộn với 5 ml nƣớc muối sinh lí trong ống nghiệm, đun ở 100oC/1h. Pha loãng 50 µl huyền dịch vi khuẩn sống bằng nƣớc muối sinh lí 0,85% NaCl có 0,5 % formaline, nồng độ vi khuẩn bây giờ khoảng 108 - 109 tbvk/ml. Các bƣớc tiến hành: - Hút 50 µl dung dịch PBS 0,6% BSA vào các giếng từ hai đến 12 (Hình 3.4). - Giếng thứ nhất, gồm 90 µl dung dịch PBS 0,6% BSA và 10 µl huyết thanh, độ pha loãng của huyết thanh là 1:10, trộn đều. - Sau đó, hút 50 µl dung dịch từ giếng thứ nhất chuyển lần lƣợt qua các giếng đến giếng 11 thì bỏ dung dịch này (không cho qua giếng 12 là giếng đối chứng). Nhƣ thế ta đã pha loãng bậc hai liên tiếp huyết thanh từ độ pha loãng đầu tiên. Giếng 12 chỉ có 50 µl PBS 0,6% BSA (không có huyết thanh). - Cho 50 µl huyền dịch vi khuẩn vào các giếng. Gõ nhẹ bốn cạnh của phiến nhựa để trộn đều hỗn hợp kháng nguyên - kháng thể. Ủ 2 giờ ở 37oC, sau đó ủ qua đêm ở 4oC 25 - Quan sát hiện tƣợng ngƣng kết. Giếng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A H PBS (µl) 90 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Huyết thanh(µl) 10 50 Vi khuẩn(µl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Hình 3. 4. Sơ đồ cụ thể hóa các bƣớc tiến hành phản ứng vi ngƣng kết 3.3.8 Phƣơng pháp xử lý thống kê Số liệu đƣợc xử lý thống kê bằng trắc nghiệm F của phần mềm statgraphic 7.0. 3.4 Bố trí thí nghiệm 3.4.1 Thí nghiệm 1: Xác định hiệu quả vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu Mục tiêu của thí nghiệm này là nhằm xác định khả năng sử dụng của chất bổ trợ nhũ dầu Montanide ISA 70M-PG của Seppic. - Bố trí sử dụng ba loại vacxin A, B, C tƣơng ứng với chủng vi khuẩn kí hiệu lần lƣợt là Ei-23, Ei-151, Ei-338 (Bảng 3.2). Mỗi loại vacxin gồm bốn nghiệm thức, ba nghiệm thức sử dụng vacxin ứng với ba nồng độ 108, 109, 3 x 109 tbvk/0,2 ml và một nghiệm thức đối chứng sử dụng nƣớc muối sinh lí. Mỗi nghiệm thức tƣơng ứng với hai bể, gồm 42 cá thí nghiệm. Tổng số là 24 bể, 504 cá, trọng lƣợng trung bình của cá là 43,39 g. - Thời gian thí nghiệm: Ngày thứ nhất tiêm ba loại vacxin lần lƣợt cho từng nghiệm thức sử dụng vacxin và tiêm nƣớc muối sinh lí cho các nghiệm thức đối 26 chứng; Ngày thứ 14 tiêm vacxin và nƣớc muối sinh lí nhắc lại. Ngày thứ 21 công vi khuẩn sống cho nghiệm thức sử dụng vacxin và nghiệm thức đối chứng (khi tiêm vacxin loại nào thì công vi khuẩn loại đó). Sau đó, tiếp tục theo dõi cá đến ngày thứ 42. Theo dõi và mô tả lại các dấu hiệu bệnh tích, thống kê số lƣợng cá sống và chết để tính tỉ lệ bảo hộ. Hình 3. 5. Hệ thống bố trí bể kính thí nghiệm Bảng 3. 2. Bố trí thí nghiệm xác định hiệu quả của vacxin dùng chất bổ trợ nhũ dầu Montanide ISA 70M-PG Nồng độ vacxin (tbvk/cá) Loại vacxin A B C 10 8 21 con x 2 21 con x 2 21 con x 2 10 9 21 con x 2 21 con x 2 21 con x 2 3x10 9 21 con x 2 21 con x 2 21 con x 2 Nƣớc SL 21 con x 2 21 con x 2 21 con x 2 Ghi chú: Các giống vi khuẩn: A: Ei-23; B: Ei-151; C: Ei-338 27 3.4.2 Thí nghiệm 2: Xác định lại độc lực ba chủng vi khuẩn Mục đích của thí nghiệm này nhằm kiểm tra lại độc lực của ba chủng vi khuẩn Ei-23, Ei-151, Ei-338 đã đƣợc sử dụng trong thí nghiệm 1. - Bố trí thí nghiệm: sử dụng ba chủng vi khuẩn nêu trên công cá với nồng độ công vi kuẩn (xem Bảng 3.3). Mỗi nghiệm thức gồm 18 cá, vậy tổng số cá sử dụng là 54 cá với trọng lƣợng trung bình là 64,90 g. - Thời gian thí nghiệm trong vòng bảy đến 10 ngày. Theo dõi cá trong suốt quá trình thí nghiệm, mô tả bệnh tích, tổng kết số cá chết. Bảng 3. 3. Bố trí thí nghiệm xác định lại độc lực của ba chủng vi khuẩn Loại vi khuẩn Nồng độ vi khuẩn (tbvk/cá) Số cá thí nghiệm A 2,5 x10 6 (110 LD50) 18 con B 2 x10 6 (90 LD50) 18 con C 5,6 x10 5 (25 LD50) 18 con Ghi chú: A: Ei-23, B: Ei-151, C: Ei-338 3.4.3 Thí nghiệm 3: Xác định hiệu quả vacxin với chất bổ trợ phèn chua Thí nghiệm đƣợc bố trí nhằm xác định hiệu quả của vacxin dùng chất bổ trợ phèn chua (Merck) đối với hai chủng vi khuẩn Ei-23 và Ei-151 tƣơng ứng với hai loại vacxin A và B. Riêng đối với chủng Ei-151, chúng tôi dùng thêm vacxin không có chất bổ trợ để so sánh với vacxin có sử dụng chất bổ trợ phèn chua. Mẫu huyết thanh của cá đƣợc thu để xác định hiệu giá kháng thể nhằm đánh giá hiệu quả của vacxin. - Thí nghiệm gồm hai nhóm vacxin thuộc hai chủng vi khuẩn Ed. ictaluri: vacxin B1 vacxin có chất bổ trợ, B2 vacxin không có chất bổ trợ, A1 vacxin không có chất bổ trợ (Bảng 3.4). Mỗi nghiệm thức vacxin đƣợc tiêm với ba nồng độ 108, 28 10 9 , 3 x 10 9 tbvk/0,2 ml và một nghiệm thức cá đối chứng đƣợc tiêm nƣớc muối sinh lí (trong thí nghiệm này hai loại vacxin B1, B2 chỉ sử dụng một nghiệm thức đối chứng). Mỗi nghiệm thức tƣơng ứng gồm 42 cá cho hai bể; thí nhgiệm sử dụng 22 bể, 462 cá, trọng lƣợng cá trung bình là 63,39 g. - Thời gian thí nghiệm (28 ngày): Ngày thứ nhất tiêm ba loại vacxin lần lƣợt cho từng nghiệm thức sử dụng vacxin, tiêm nƣớc muối sinh lí cho các nghiệm thức đối chứng. Ngày thứ 14 tiêm vacxin và nƣớc muối sinh lí nhắc lại. Ngày thứ 21 công vi khuẩn sống cho nghiệm thức sử dụng vacxin và nghiệm thức đối chứng của từng loại vacxin (khi tiêm vacxin loại nào thì công vi khuẩn loại đó) với liều 0,2 ml/con và nồng độ công vi khuẩn (xem Bảng 4.5). Ngày thứ 28 kết thúc thí nghiệm. - Theo dõi cá trong suốt quá trình thí nghiệm, mô tả dấu hiệu bệnh tích, thống kê số lƣợng cá sống và chết để tính tỉ lệ bảo hộ. - Thu mẫu huyết thanh các thí nghiệm vào ngày thứ nhất trƣớc khi tiêm vacxin, vào ngày 21 trƣớc khi công vi khuẩn sống và ngày 28 khi kết thúc thí nghiệm. - Thu mẫu vi khuẩn: sau khi công vi khuẩn sống cho cá, thu mẫu vi khuẩn đối với những cá chết có dấu hiệu bệnh đốm trắng điển hình nhƣ bên ngoài xuất huyết các vây và gốc vây nặng, bên trong thận, gan, lách có nhiều đốm trắng. Bảng 3. 4. Bố trí thí nghiệm xác định hiệu quả của vacxin với chất bổ trợ phèn chua Nồng độ vacxin (tbvk/cá) Loại vacxin B1 B2 A1 10 8 21 con x 2 21 con x 2 21 con x 2 10 9 21 con x 2 21 con x 2 21 con x 2 3x10 9 21 con x 2 21 con x 2 21 con x 2 Nƣớc SL 21 con x 2 21 con x 2 Ghi chú: B1, B2: Ei-151; A1: Ei-23 29 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả thí nghiệm xác định hiệu quả của vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu Bảng 4. 1. Thí nghiệm 1: Tổng kết số lƣợng cá chết trong suốt thời gian thí nghiệm và tỉ lệ cá chết của từng nghiệm thức Loại vacxin Nồng độ vacxin (tbvk/cá) Số cá thí nghiệm (x 2 bể) Số cá chết qua các ngày Số cá chết Số cá còn lại Tỉ lệ cá chết (%) 1-14 14-21 21-38 A 10 8 42 4 3 9 16 26 38,1 10 9 42 7 7 14 28 33,33 3x10 9 42 1 1 41 2,38 ĐC 42 0 42 0 B 10 8 42 1 2 3 39 7,14 10 9 42 1 1 2 40 4,76 3x10 9 42 0 42 0 ĐC 42 0 42 0 C 10 8 42 1 1 41 2,38 10 9 42 6 1 2 9 33 21,43 3x10 9 42 1 1 41 2,38 ĐC 42 0 42 0 Ghi chú: A (Ei-23), B (Ei-151), C (Ei-338), ĐC: đối chứng ; LD50 = 2,25 x10 4 tbvk/cá 30 Bảng 4. 2. Kết quả theo dõi biểu hiện bệnh lý của cá thí nghiệm 1 Thời gian Biểu hiện bệnh lý Ngày 1- 14 Ngày thứ 1: tiêm vacxin, cá biểu hiện bình thƣờng. Ngày thứ 2 – 5: cá hoạt động bình thƣờng. Ngày thứ 6: cá bắt đầu chết ở nghiệm thức 108 lô A với biểu hiện bên ngoài toàn thân mất màu từng mảng, da có rất nhiều nhớt; bên trong thận sƣng mất màu, gan và lách teo nhỏ, xoang bụng chứa đầy dịch trắng. Ngày thứ 7 – 10: cá chết rải rác ở các nghiệm thức 108 lô A, 10 9 lô C với những biểu hiện tƣơng tự nhƣ ngày thứ sáu. Ngày thứ 10, lúc 16h30 kiểm tra cá ở nghiệm thức 108 lô A và nghiệm thức 10 9 lô C chúng tôi quan sát thấy bề ngoài của các cá đƣợc kiểm tra toàn thân phủ nhiều vết chấm trắng nhỏ, lấy mẫu quan sát dƣới kính hiển vi thấy có nhiều trùng bánh xe. Chúng tôi tiến hành tắm formol cho toàn bộ cá thí nghiệm với nồng độ 20 ppm, thời gian khử 5 phút, sau đó tháo cạn nƣớc còn 5 cm đóng van và cấp nƣớc mới vào. Ngày thứ 12: lúc 8h30 tắm formol cho toàn bộ cá thí nghiệm lần 2, nồng độ 20 ppm trong 5 phút. Ngày thứ 11 - 13: cá hoạt động bình thƣờng. Ngày 14 - 21 Ngày thứ 14: lúc 10h tiêm nhắc lại vacxin, sau khi tiêm nhắc lại có ba cá chết do thao tác tiêm. Ngày thứ 15: cá hoạt động bình thƣờng. Ngày thứ 16: nghiệm thức 109 lô C có một cá chết biểu hiện bên ngoài phồng ngay vùng bụng và ứ động máu (Hình 4.1); bên trong thận sƣng, gan và lách thâm đen, xoang bụng chứa đầy dung dịch màu trắng (Hình 4.2). Ngày thứ 17: các nghiệm thức 108 lô A, 3 x109 lô C cá chết 31 có biểu hiện bên ngoài cá gầy ốm, tƣa vây, hoại tử điểm tiêm; bên trong gan teo sậm màu, thận sƣng và nhũn, tụy teo, mạch máu vón cục, xoang bụng chứa đầy dịch trắng. Ngày thứ 18 - 20: cá chết ở nghiệm thức 109 lô A có biểu hiện tƣơng tự nhƣ ngày thứ 17. Ngày 21 - 38 Ngày thứ 21: công vi khuẩn cho tất cả lô thí nghiệm. Trong quá trình cảm nhiễm, ở các nghiệm thức 108, 109 lô A có một số cá do quá nhỏ, gầy yếu, hoại tử vùng tiêm nên sẽ bị loại ra và không công vi khuẩn. Ngày thứ 22: nghiệm thức 108 lô A có hai cá chết biểu hiện giống nhau bên ngoài tƣa vây, thân gầy teo, viêm loét vùng tiêm; bên trong gan, thận và lách bị teo nhỏ, xoang bụng chứa đầy dịch trắng. Ngày thứ 23: nghiệm thức 108 lô A có một cá chết với biểu hiện nhƣ ngày thứ 22; nghiệm thức 109 lô A có một cá chết bên ngoài biểu hiện nhƣ trên bên trong đã xuất hiện đốm trắng nhẹ. Ngày thứ 24 – 38: cá chết ở các nghiệm thức tiêm vacxin có biểu hiện tƣơng tự nhƣ ngày thứ 22, cho đến thời điểm này cá ở các nghiệm thức đối chứng không chết. Ngày thứ 38: Chúng tôi kết thúc thí nghiệm. 32 Hình 4. 1. Cá bị lở loét ngay vùng bụng Hình 4. 2. Xoang bụng cá chứa đầy dịch trắng Ở thí nghiệm 1, trƣớc khi tiêm vacxin cá khỏe và biểu hiện bình thƣờng. Nhƣng sau khi tiêm vacxin trong khoảng thời gian từ ngày thứ 6 – 10 các nghiệm thức tiêm vacxin cá chết do ký sinh trùng ngoài biểu hiện bệnh tích của ký sinh, cá còn có những biểu hiện khác nhƣ bên ngoài lở loét vùng bụng; bên trong xoang bụng có chứa đầy dịch trắng, trong khi các nghiệm thức đối chứng thì cá hoạt động bình thƣờng. Trong thí nghiệm này điều kiện môi trƣờng, nguồn nƣớc là nhƣ nhau ở tất cả các nghiệm thức, cá đối chứng hoạt động bình thƣờng, chỉ ở các nghiệm thức tiêm vacxin có cá chết với những triệu chứng nhƣ trên. Điều này chứng tỏ chất bổ trợ nhũ dầu làm vacxin đã gây tác dụng phụ, tạo cơ hội cho ký sinh trùng phát triển. Sau đó chúng tôi xử lí formol cho tất cả các nghiệm thức sau một ngày thì cá không còn dấu hiệu của ký sinh trùng và cá hoạt động bình thƣờng từ ngày thứ 10 – 13. 33 Vào ngày thứ 14 chúng tôi tiêm nhắc lại vacxin, sau một ngày cá có những triệu chứng bất thƣờng, cá chết rải rác ở các nghiệm thức tiêm vacxin với những biểu hiện bên ngoài cá gầy yếu, bỏ ăn, lở loét ngay vùng bụng; bên trong thận, gan và lách teo, thận sƣng mất màu, gan thâm đen, xoang bụng chứa đầy dịch trắng và cá tiếp tục chết ở các ngày sau đó với những triệu chứng đã nêu, một điều cần chú ý là tất cả các cá chết khi giải phẫu bên trong xoang bụng đều chứa dịch trắng; trong khi đó cá ở các nghiệm thức đối chứng hoạt động bình thƣờng và không có con nào chết. Nhƣ vậy trong điều kiện thí nghiệm nhƣ nhau đối với các nghiệm thức có sự khác biệt lớn giữa nghiệm thức tiêm vacxin và đối chứng: nghiệm thức đối chứng cá hoạt động bình thƣờng, nghiệm thức tiêm vacxin cá chết sau khi tiêm vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu, nhƣ thế có thể nói vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu đã tác động không tốt tới hoạt động sống bình thƣờng của cá. Tuy nhiên, chúng tôi vẫn tiến hành công vi khuẩn sống cho cá đối chứng và cá tiêm vacxin để đánh giá thêm tác động của chất bổ trợ nhũ dầu lên tính mẫn cảm của cá đối với Ed. ictaluri. Khi công vi khuẩn sống cho tất cả các nghiệm thức vào ngày thứ 21, sau đó một ngày đã có cá chết ở các nghiệm thức tiêm vacxin với những biểu hiện tƣơng tự nhƣ lúc đầu và tiếp tục có cá chết vào những ngày tiếp theo với những bệnh tích tƣơng tự nhƣng thêm vào đó là những dấu hiệu của bệnh đốm trắng nhẹ; một điều cần lƣu ý là tới lúc này, cá ở các nghiệm thức đối chứng vẫn hoạt động bình thƣờng. Trong khi ở các nghiệm thức tiêm vacxin lại tiếp tục có cá chết, nhƣ thế ta có thể thấy rõ là vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu Montanide ISA 70M-PG ngoài việc gây chết cá khi nuôi bình thƣờng trong điều kiện thí nghiệm còn gây chết cá nhiều hơn (Bảng 4.1 và Biểu đồ 4.1) khi có sự xuất hiện của Ed. ictaluri. Nhƣng sau khi công cƣờng độc vi khuẩn, cá đối chứng vẫn không chết nên chúng tôi nghi ngờ về độc lực của vi khuẩn hoặc nồng độ vi khuẩn chƣa đạt mức cho cá chết nên chúng tôi tiến hành thí nghiệm 2 để khẳng định lại vấn đề này. 34 Tỉ lệ cá chết thí nghiệm xác định hiệu quả vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu 38,1 7,14 21,43 2,38 33,33 4,762,38 2,38 0 000 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 A B C Loại vacxin Tỉ lệ (% ) 10^8 10^9 3x10^9 ĐC Biểu đồ 4. 1. Tỉ lệ cá chết của thí nghiệm xác định hiệu quả vacxin với chất bổ trợ nhũ dầu Nhƣ vậy, bằng thực nghiệm ta có thể khẳng định chất bổ trợ nhũ dầu dùng trong thí nghiệm này không có độ an toàn, đem lại tác dụng không tốt cho cá mà theo hai tác giả Tyler và Klesius (1994), chất bổ trợ nhũ dầu tiêm vào xoang bụng của cá nheo Ictalurus punctatus làm giảm khả năng đề kháng với vi khuẩn Ed. ictaluri. Kết luận đƣợc rút ra từ thí nghiệm 1 là:  Chất bổ trợ nhũ dầu Montanide 70M-PG của Seppic không hoạt động, không an toàn.  Có thể độc lực của các chủng vi khuẩn có vấn đề: một là vi khuẩn đã hoàn toàn mất độc lực, hai là trong quá trình bảo quản làm vi khuẩn yếu độc lực. 35 4.2 Kết quả thí nghiệm xác định lại độc lực của ba chủng vi khuẩn Bảng 4. 3. Kết quả thí nghiệm xác định lại độc lực ba chủng vi khuẩn Loại vi khuẩn Nồng độ vi khuẩn (tbvk/cá) Số cá thí nghiệm Số cá chết Số cá còn lại Tỉ lệ cá chết (%) A 2,5 x10 6 (110 LD50) 18 con 10 8 55,6 B 2 x10 6 (90 LD50) 18 con 9 9 50 C 5,6 x10 5 (25 LD50) 18 con 4 14 22,2 Ghi chú: A (Ei-23), B (Ei-151), C (Ei-338); LD50 = 2,25 x10 4 tbvk/cá Bảng 4. 4. Kết quả theo dõi biểu hiện của cá thí nghiệm 2 Thời gian Biểu hiện bệnh lý Ngày 1 - 8 Ngày thứ 1: công vi khuẩn sống với liều lƣợng, nồng độ, cách thức đƣợc nêu trên, cá sau khi công biểu hiện bình thƣờng. Ngày thứ 2 – 3: cá hoạt động bình thƣờng. Ngày thứ 4: cá bắt đầu có triệu chứng của bệnh và cá chết rải rác ở các nghiệm thức, cá chết ở các nghiệm thức có biểu hiện giống nhau với các triệu chứng nhƣ bên ngoài xuất huyết các vây và gốc vây, mắt đỏ; bên trong gan, thận, lách đều có đốm trắng. Từ ngày thứ 4 trở đi: cá ở các nghiệm thức chết rất nhiều và có những dấu hiệu bệnh tích điển hình của bệnh đốm trắng. Ngày thứ 8: Chúng tôi kết thúc thí nghiệm. Thí nghiệm 2 cho kết quả chủng vi khuẩn Ei-23 và Ei-151 gây ra tỉ lệ cá chết trên 50% trừ chủng vi khuẩn Ei-338 do công với liều thấp (25LD50) nên tỉ lệ chết chỉ chiếm 22,2% (Bảng 4.3). Cá chết đều có những dấu hiệu bệnh tích điển hình của bệnh đốm trắng (Bảng 4.4). Tất cả điều này chứng tỏ các chủng vi khuẩn trên vẫn 36 còn độc độc lực và có khả năng gây chết cá. Nhƣ vậy, nghi vấn về vi khuẩn đã mất độc lực bị bác bỏ, nguyên nhân còn lại chúng tôi nghi ngờ là trong quá trình chuẩn bị vi khuẩn để công cƣờng độc, có thể nồng độ quá thấp nên cá đối chứng không chết hoặc quá trình bảo quản vi khuẩn sống trƣớc khi công đã làm vi khuẩn chết bớt trƣớc khi tiêm vào cá. Điều này đƣợc chúng tôi khắc phục ở thí nghiệm tiếp theo. 4.3 Kết quả thí nghiệm xác định hiệu quả vacxin với chất bổ trợ phèn chua Bảng 4. 5. Kết quả thí nghiệm 3 - Tổng kết số lƣợng cá chết trong suốt thời gian thí nghiệm và tỉ lệ cá chết của từng nghiệm thức Loại vacxin Nồng độ vacxin (tbvk/cá) Nồng độ vi khuẩn công (ngày 21) Số cá thí nghiệm (x 2 bể) Số c