Khóa luận Xây dựng quy trình phát hiện Virus PMWaV-1 gây bệnh héo đỏ đầu lá (Mealybug wilt) trên cây dứa Cayenne bằng phương pháp RT-PCR

ện nay bệnh héo đỏ đầu lá đã xuất hiện ở nước ta với mật độ rộng và tỷ lệ cao, khi gặp điều kiện có thể lây lan thành dịch, gây thiệt hại lớn cho người trồng. Bên cạnh đó chúng ta vẫn chưa có biện pháp phòng trừ bệnh hữu hiệu mà chỉ có thể hạn chế bệnh bằng cách khống chế những nguồn trung gian gây bệnh. Tuy nhiên với những vùng chuyên canh quy mô lớn hàng trăm, hàng ngàn hecta thì các phương pháp như: trồng giãn cách xa giữa các luống, dùng thuốc trừ rệp, kiến không có tính khả thi cao. Vì vậy với những dự án đầu tư lớn cho cây dứa hiện nay (chương trình 3 cây, 3 con của thành phố Hồ Chí Minh) thì rất cần phải xây dựng một quy trình phòng trừ bệnh thật sự hiệu quả. Từ thành quả của những nghiên cứu đã được thực hiện trên thế giới, ta có thể đề ra một mô hình phòng trừ bệnh héo đỏ đầu lá như sau: 1. Xử lý nhiệt chồi dứa để khử PMWaV. 2. Test các chồi đã xử lý nhiệt để xác định những mẫu sạch PMWaV. 3. Nhân nhanh các mẫu sạch virus bằng phương pháp nuôi cấy mô để tạo nguồn chồi giống sạch bệnh, cung cấp cho người trồng. Với mô hình trên, các chồi giống sạch virus khi trồng sẽ không phát bệnh dù có xuất hiện rệp sáp. Vậy nếu xử lý nhiệt tốt và có một phương pháp phát hiện PMWaV thật chính xác thì ta sẽ phòng chống được bệnh héo đỏ đầu lá thật sự hữu hiệu, nâng cao năng suất của cây dứa, đem lại hiệu quả kinh tế cao cho xã hội 2.6 Các phương pháp chẩn đoán PMWaV Từ các nghiên cứu về bệnh héo đỏ đầu lá đã thực hiện trên thế giới cho thấy, hiện nay có 3 phương pháp chính để chẩn đoán PMWaV-1 trên cây dứa. - Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay): năm 1978, Clark và Adam đã lần đầu tiên áp dụng thành công phương pháp này để chẩn đoán bệnh virus hại khoai tây. Phương pháp này hoạt động dựa trên nguyên tắc kháng nguyên – kháng thể. Hiện nay đây là phương pháp huyết thanh hiện đại và nhanh chóng để chẩn đoán các bệnh virus. 25 - Phương pháp TBIA (Tissue Bloting Immuno Assay): phương pháp này được Lin và ctv sử dụng lần đầu tiên năm 1990 cũng hoạt động dựa trên nguyên tắc kháng nguyên – kháng thể. Phương pháp này có nhiều ưu điểm hơn ELISA vì nó không đòi hỏi phải chuẩn bị mẫu tỷ mỉ và có thể cung cấp thông tin về sự phân bố virus trong mẫu bệnh. - Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction): là phương pháp nhân nhanh mRNA, gồm 2 bước: mRNA của virus được phiên mã ngược thành cDNA, sau đó cDNA này sẽ được khuếch đại. Kỹ thuật cho phép phát hiện và phân biệt được nhiều dòng virus gần giống nhau. Các phương pháp trên đều có những ưu điểm riêng. Với ELISA, TBIA tuy giá thành cao, nhưng có thể thực hiện rất dễ dàng, nhanh chóng, rất thích hợp cho việc test cây đang trồng trên đồng ruộng với qui mô lớn. TBIA còn có thể cung cấp thông tin về sự phân bố của virus trong mẫu bệnh nên có thể ứng dụng tốt vào những nghiên cứu về đặc điểm của bệnh. Còn với phương pháp RT-PCR, tuy cần nhiều thời gian thực hiện nhưng giá thành thấp và chính xác hơn 2 phương pháp trên. RT-PCR đòi hỏi lượng mẫu bệnh cần thiết cho phản ứng ít hơn ELISA rất nhiều, nhưng lại có thể phát hiện được những mẫu có lượng virus ban đầu rất thấp. Như vậy, với mô hình cung cấp giống sạch bệnh tập trung mà đề tài hướng tới, một mô hình đòi hỏi một phương pháp chẩn đoán PMWaV-1 thật chính xác thì phương pháp RT-PCR là phương pháp phù hợp nhất. 2.7 Gene HSP 70 của PMWaV Heat shock protein 70 kD (HSP 70) là một nhóm protein đặc biệt của sinh vật. Chức năng ban đầu của chúng là giúp tái đóng xoắn các protein bị biến tính vì nhiệt, giúp sinh vật có thể tồn tại được ở những điều kiện khắc nghiệt bất thường. Cũng chính vì thế mà chúng được đặt tên là heat shock protein. Ngoài ra, chúng còn có một số chức năng khác như giúp các protein mới được tạo ra hình thành các cấu trúc bậc cao, vận chuyển protein xuyên qua các màng tế bào và riêng ở Closterovirus, HSP 70 là một thành phần của protein vỏ trong quá trình tạo virion của virus. (Dolja V.V. và ctv, 1999) 26 Gene mã hóa HSP 70 là một gene có tính bảo tồn cao ở nhiều loài. Đặc biệt với nhóm Closterovirus, đã có rất nhiều nghiên cứu dựa vào gene này để xây dựng cây phân loài. Vì vậy, đối với PMWaV, HSP 70 là một gene rất quan trọng. Đây là vùng gene chính cho các thí nghiệm khuếch đại gene để phát hiện PMWaV và cũng dựa vào HSP 70 mà PMWaV được phân ra thành 2 loài: PMWaV-1 và PMWaV-2 (Sether D.M. và ctv, 2001). 2.8 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là một công cụ khá mới trong sinh học phân tử, do Karl Mullis và cộng sự phát minh 1985 và đã liên tục được hoàn thiện và phát triển trong thời gian gần đây. Kỹ thuật PCR cho phép khuyếch đại một đoạn DNA mong muốn lên nhiều lần để có thể phục vụ cho nhiều mục đích khác nhau. Nguyên tắc cơ bản của phương pháp PCR chủ yếu dựa trên khả năng tự nhân đôi, biến tính, và hồi tính của DNA. 2.8.1 Nguyên tắc của phương pháp PCR Dựa trên khả năng biến tính và hồi tính của DNA cùng với sự tìm ra enzyme Taq-polymerase (1 loại DNA polymerase chịu nhiệt), người ta đã thiết lập được hàng loạt các chuỗi phản ứng nhân đôi DNA in vitro trong một thời gian ngắn. Khi ta làm biến tính (đun nóng) để đoạn DNA tách ra thành 2 mạch đơn và cung cấp 2 mồi (primer) chuyên biệt gồm mồi xuôi và mồi ngược bắt cặp bổ sung với 2 đầu của đoạn DNA cần nhân lên thì Taq-polymerase sẽ tổng hợp nên 2 sợi DNA mới. Như vậy nếu phản ứng nhân đôi DNA trên được lặp lại liên tục nhiều lần thì ta sẽ thu được 1 lượng khuyếch đại rất lớn của đoạn DNA cần nghiên cứu. Phản ứng PCR gồm có nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 giai đoạn: - Giai đoạn 1: là giai đoạn biến tính (denaturation), nhiệt độ được nâng lên 93 - 100 oC. Ở nhiệt độ này tất cả các mạch xoắn kép của DNA đều được tách ra. - Giai đoạn 2: là giai đoạn bắt cặp (hybridization), nhiệt độ phản ứng được hạ xuống thấp hơn nhiệt độ nóng chảy - Tm của các primer (là nhiệt độ mà tại đó 2 mạch của một sợi đôi DNA tách ra hoàn toàn) cho phép các primer bắt cặp với 27 DNA khuôn mẫu. Mức nhiệt độ dao động khoảng 40 - 70oC, tuỳ thuộc vào Tm của các primer và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút. - Giai đoạn 3: là giai đoạn kéo dài (extension), nhiệt độ được nâng lên 68 - 72oC. Ở nhiệt độ này Taq - polymerase hoạt động tốt nhất để kéo dài các mạch DNA. Đoạn DNA nằm giữa 2 primer được tổng hợp. Cứ sau 1 chu kỳ gồm 3 giai đoạn trên, từ 1 DNA khuôn mẫu sẽ tạo ra được 2 DNA mới. Và sau mỗi lần lặp lại sẽ làm tăng gấp đôi lượng DNA mẫu của lần trước (tăng theo cấp số nhân). Hình 2.7: Phản ứng PCR. Chú thích: (A): giai đoạn biến tính (B): giai đoạn bắt cặp (C): giai đoạn kéo dài Tổng số DNA khuếch đại sau phản ứng PCR được tính theo công thức: Tổng DNA khuếch đại = m * 2n Với m là số bản sao ban đầu của DNA mẫu, n là số chu kỳ 28 2.8.2 Các yếu tố quan trọng trong phản ứng PCR 2.8.2.1 Dung dịch đệm (Buffer) Dung dịch đệm có tác dụng cung cấp lực ion (ionic strength) cần thiết cho phản ứng xảy ra. Nồng độ các chất, pH của dung dịch đệm tùy thuộc vào nguồn enzyme DNA polymerase được dùng. Các thành phần của một dung dịch đệm điển hình gồm: KCl, MgCl2, gelatin và Tris – HCl (pH 8,5 ở nhiệt độ phòng). 2.8.2.2 Mg2+ Nồng độ Mg2+ là yếu tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR. Nó làm tăng hoạt động của DNA polymerase, tăng Tm của DNA và sự tương tác giữa primer - nhiệt độ. Nồng độ Mg2+ trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng thường biến thiên trong khoảng từ 0,5 đến 5 mM. Nồng độ MgCl2 từ 1,5 đến 2 mM thường được xem là tối ưu, nhưng nồng độ tối ưu phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). Nồng độ Mg2+ cao sẽ làm phân tử dây đôi ổn định hơn, kềm hãm sự biến tính hoàn toàn của các sợi đôi, làm cho kết quả PCR ít đi. Sự dư thừa Mg2+ còn làm cho hiện tượng bắt cặp giả xảy ra nhiều hơn. Hiện tượng này làm primer bắt cặp ở những vị trí không chuyên biệt trên DNA khuôn tạo ra những sản phẩm không mong muốn với số lượng khá lớn. Ngược lại nếu nồng độ Mg2+ quá thấp (< 0.5 mM), thì quá trình kéo dài sẽ xảy ra không hoàn toàn, tạo ra những sản phẩm DNA ngắn hơn bình thường. Đó là do trong phản ứng PCR, Mg2+ đóng vai trò Co – factor của Taq polymerase nên nếu lượng Mg2+ quá thấp thì Taq polymerase sẽ không thể hoạt động bình thường trong giai đoạn kéo dài (Bùi Chí Bửu, 1999). 2.8.2.3 Deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs) Là nguyên liệu cần thiết cho phản ứng tổng hợp DNA. Hỗn hợp dNTPs gồm 4 loại: dATP, dTTP, dCTP, dGTP và thường được sử dụng ở nồng độ 20 - 200 µM cho mỗi nucleotide. Điều quan trọng là chúng ta phải giữ cho nồng độ của cả 4 dNTPs bằng nhau vì sự mất cân bằng thành phần các nucleotide sẽ làm tăng lỗi sao chép của DNA polymerase. 29 2.8.2.4 Primer (đoạn mồi) Primer là một trong những yếu tố quan trọng nhất, ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả cũng như độ chuyên biệt của phản ứng PCR. Chọn primer là giai đoạn quyết định của phản ứng PCR và cần tuân theo một số nguyên tắc sau: - Primer cho 1 phản ứng PCR gồm có 1 primer xuôi (forward) và 1 primer ngược (reverse). Xuôi và ngược là so với chiều sao mã. Trong hầu hết các ứng dụng phản ứng PCR, 2 primer xuôi và ngược đều phải có nồng độ bằng nhau. - Trình tự của primer được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa 2 primer hay giữa 1 primer với chính nó (trình tự của chúng không được bổ sung nhau). - Tm của 2 primer không cách xa nhau. - Trình tự của primer phải đặc trưng cho trình tự của DNA được khuyếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên gen. Trình tự giữa 2 primer không nên quá lớn, phản ứng PCR thường tối ưu với những đoạn trình tự nhỏ hơn 1kb (Phan Cự Nhân, 2001). 2.8.2.5 Taq – polymerase Là một DNA polymerase chịu nhiệt, được tách chiết từ một vi khuẩn suối nước nóng có tên là Thermus aquaticus. Taq - polymerase không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính của phản ứng PCR và hoạt động tối ưu ở 68 – 72oC . Nồng độ enzyme Taq polymerase được sử dụng thông thường là 0.5 – 5 đơn vị trên 100µl dung dịch phản ứng. Nếu nồng độ Taq quá cao có thể tạo ra những sản phẩm không chuyên biệt làm sai lệch kết quả. Nếu nồng độ Taq quá thấp, phản ứng sẽ không có đủ lượng enzyme cần thiết để tạo ra sản phẩm PCR theo mong muốn (Bùi Chí Bửu, 1999). 30 2.8.2.6 Số lượng chu kỳ trong phản ứng PCR Số chu kỳ cho 1 phản ứng tùy thuộc vào số lượng bản sao ban đầu của mẫu. Ví dụ nếu lượng bản mẫu ban đầu là 105 thì cần 25 – 30 chu kỳ, nếu lượng bản mẫu là 102 – 103 thì số lượng chu kỳ là 35 – 40 . Trong thực tế không nên thiết lập số chu kỳ quá lớn cho 1 phản ứng PCR. Sở dĩ như vậy là vì phản ứng PCR diễn tiến qua 2 giai đoạn, ở giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân của lượng mẫu, sau đó hiệu quả khuyếch đại giảm hẳn vì những nguyên nhân sau: - Sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng - Sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng - Các bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau (Phan Cự Nhân, 2001). 2.9 Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcription PCR) RT-PCR là một kỹ thuật cho phép ta khuếch đại các đoạn mRNA (RNA thông tin) để làm cơ sở cho việc nghiên cứu về sự biểu hiện gene (sự sao mã tạo ra các mRNA của các gen) hay nghiên cứu các retrovirus (các loại virus mang thông tin di truyền là mRNA). RT-PCR hoạt động dựa trên cơ sở của kỹ thuật PCR nhưng trước khi thực hiện phản ứng khuếch đại, có thêm giai đoạn tổng hợp cDNA (complementary DNA) từ sợi mRNA khuôn. Giai đoạn này được thực hiện nhờ enzyme reverse transcriptase, enzyme phiên mã ngược được phân lập từ retrovirus. Nếu cung cấp một primer bắt cặp với mRNA, enzyme reverse transcriptase sẽ thực hiện phản ứng phiên mã ngược, tổng hợp nên một sợi DNA bổ sung với sợi mRNA khuôn, gọi là sợi cDNA. Sau khi được tạo ra, sợi cDNA sẽ được dùng làm khuôn mẫu cho phản ứng khuếch đại DNA thông thường. (Bùi Trang Việt, 2002) 31 Hình 2.8: Phản ứng RT-PCR Có 3 loại primer chính thường dùng trong giai đoạn tổng hợp cDNA * Primer là các oligo T Tất cả các loại mRNA đều có đuôi poly A ở đầu 3' nên với primer là một đoạn oligo T (ví dụ: TTTTTT) thì nó sẽ bắt cặp với sợi mRNA ở đoạn poly A và phản ứng tổng hợp sẽ tạo ra sợi cDNA có độ dài ứng với toàn bộ sợi mRNA khuôn. Phương pháp này rất thuận lợi cho những nghiên cứu tổng quát về mRNA. * Primer random hexamer Là những đoạn oligo nucleotide gồm 6 nucleotide với trình tự ngẫu nhiên. Chúng bám lên nhiều điểm khác nhau dọc theo suốt sợi mRNA và tổng hợp nên những đoạn cDNA ngắn phủ khắp sợi mRNA khuôn mẫu. Random hexamer thích hợp cho những sợi mRNA đích quá dài hoặc có nhiều cấu trúc thứ cấp gây cản trở cho oligo T hoạt động hiệu quả. 32 * Primer chuyên biệt Primer được thiết kế với một trình tự chuyên biệt cho một đoạn trình tự nhất định trên sợi mRNA. Primer sẽ bắt cặp ở trước đầu 3' của đoạn gene mong muốn và phản ứng tổng hợp sẽ tạo ra sợi cDNA có độ dài từ điểm bắt cặp kéo dài đến hết sợi mRNA khuôn. Do primer chỉ bắt cặp tại một điểm chuyên biệt nên cDNA tạo ra sẽ chứa đoạn trình tự mong muốn với xác suất rất cao, vì vậy, loại primer này đặc biệt hữu hiệu trong việc khuếch đại các mRNA có số lượng bản sao thấp. (O'Connell J., 2002). Phản ứng RT-PCR có thể được thực hiện theo 2 bước (two steps) hay diễn ra liên tục (one step). * Phản ứng qua 2 bước Trước tiên, thực hiện phản ứng tổng hợp cDNA với mRNA khuôn, primer và enzyme reverse transcriptase trong khoảng 45 phút ở 42 - 45oC (là nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme reverse transcriptase). Sau đó, bổ sung primer cho PCR, Taq - polymerase để thực hiện tiếp phản ứng khuếch đại. Phương pháp này thường được sử dụng với các primer tổng hợp cDNA là oligo T hay hexamer, giúp người thực hiện có thể khống chế được từng qui trình. Tuy nhiên dễ xảy ra nhiễm các DNA lạ khi bổ sung hóa chất giữa 2 giai đoạn. * Phản ứng liên tục Cho tất cả các yếu tố cần thiết cho cả phản ứng tổng hợp cDNA và phản ứng khuếch đại vào một lần rồi thực hiện cả 2 qui trình liên tục. Phương pháp này thường được thực hiện với các primer được thiết kế chuyên biệt chung cho cả phản ứng tạo cDNA lẫn phản ứng khuếch đại và ít gây nhiễm DNA lạ trong quá trình thao tác. 33 2.10 Kỹ thuật giải trình tự DNA (Sequencing) Để xác định trình tự của một đoạn DNA mong muốn, phương pháp Sanger là phương pháp thường được sử dụng nhất hiện nay. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc: thực hiện sự tổng hợp sợi DNA bổ sung với sợi cần xác định trình tự (thực hiện phản ứng PCR), nhưng ngoài 4 loại dNTP thông thường còn bổ sung thêm các dideoxynucleotide triphosphate (ddNTP). Các ddNTP này không có nhóm -OH ở đầu 3' nên khi chúng gia nhập vào chuỗi sẽ làm cho sự kéo dài chuỗi bị dừng lại (do không thể tạo được liên kết giữa nhóm -OH 3' của nucleotide trước với nhóm phosphate 5' của nucleotide sau). Sự gia nhập của các ddNTP vào chuỗi là hoàn toàn ngẫu nhiên nên phản ứng kéo dài sẽ ngừng lại ở một vị trí bất kỳ. Do đó, nếu cung cấp một lượng DNA mẫu đủ lớn thì các phản ứng tổng hợp sẽ cho hàng loạt các sản phẩm có độ dài tăng dần: 1, 2, 3, 4… nucleotide. Như vậy, chỉ cần biết được ở mỗi đoạn kết thúc bằng loại ddNTP nào thì sẽ có thể tìm ra được trình tự của đoạn DNA mong muốn. Để làm được điều đó, người ta thực hiện 4 phản ứng PCR cho mẫu DNA muốn giải trình tự cùng lúc, ở mỗi phản ứng chỉ cho thêm một loại ddNTP (A, T, G hoặc C). Sau phản ứng, kết quả điện di sản phẩm của cả 4 trên cùng một gel acrylamide sẽ giúp xác định được trình tự của đoạn DNA (Bùi Trang Việt, 2002). Hiện nay, với các thế hệ máy đọc trình tự mới, các ddNTP được gắn thêm các chất phát màu huỳnh quang, mỗi loại ddNTP gắn với 1 màu khác nhau thay vì gắn với đồng vị phóng xạ như phương pháp kinh điển. Kết thúc phản ứng, các đoạn DNA sẽ được phân tích bằng phương pháp điện di mao quản (capillary electrophoresis). Cuối cùng, từ kết quả điện di, máy sẽ đọc các màu huỳnh quang phát ra trên capillary và phân tích với các phần mềm chuyên dụng để cho ra trình tự các nucleotide của đoạn DNA quan tâm. 34 Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu 3.1.1 Mẫu Mẫu nghiên cứu gồm chồi giống thương phẩm và các mẫu lá bệnh được lấy ngẫu nhiên từ 3 giống dứa Cayenne: - Giống Thái Lan và giống Lâm Đồng do nông trường Phạm Văn Hai cung cấp. - Giống Trung Quốc do nông trường Thọ Vực cung cấp. Hình 3.1: Mẫu chồi giống dứa Cayenne thương phẩm 3.1.2 Dụng cụ và thiết bị - Máy ly tâm Mikro 22R - Máy vortex - Máy luân nhiệt iCycle (BioRad) - Bộ nguồn và bồn điện di (BioRad) - Bình đựng Nitơ lỏng - Pipetman, đầu tube và eppendorf các loại. 35 3.1.3 Hóa chất 3.1.3.1 Hóa chất dùng cho tách chiết RNA Sử dụng kit ly trích AurumTM Total RNA Mini Kit (Catalog #732-6820) do Bio Rad cung cấp: - Lysis solution. - Low stringency wash solution (X5). - High stringency wash solution. - DNase I (ở dạng bột rắn, cần pha buffer trước khi sử dụng). - DNase dilution solution. - Elution solution. Ngoài ra, còn có các hóa chất khác cần cung cấp riêng: - β- mercaptoethanol, 14.2 M. - Polyvinylpyrolidone - 40 (PVP), 2%. - Ethanol 100% và 70%. - Tris-base (pH 7.5, 10 mM). - Nitơ lỏng. - NaOH 0.1M. - EDTA 1mM. - DEPC (Diethyl pyrocarbonate). 3.1.3.2 Hóa chất dùng cho phản ứng RT-PCR - Primer cho phản ứng RT-PCR: Primer 225: 5'-ACAGGAAGGACAACACTCAC-3' Primer 226: 5'-CGCACAAACTTCAAGCAATC-3' (Theo thiết kế của Sether D.M và ctv, 2001) Cặp primer này sẽ khuếch đại từ vị trí nucleotide thứ 118 đến nucleotide 707 trên gene mã hóa cho HSP 70 của PMWaV-1 cho ra sản phẩm có kích thước 589bp. 36 118 707 Đoạn khuếch đại 589bp Gene mã hóa HSP70 Primer 226 Primer 225 5’3’ Hình 3.2: Sơ đồ phản ứng RT-PCR khuếch đại đoạn gene HSP 70 của PMWaV-1 bằng cặp primer 225, 226. Các hóa chất khác thuộc bộ kit Access RT-PCR System (Promega) gồm: - AMV / Tfl Buffer (5X) - dNTP (10mM) - MgSO4 (25 mM) - Enzyme reverse transcriptase AMV (5 Unit/µl) - Enzyme Taq polymerase Tfl (5 Unit/µl) 3.1.3.3 Hóa chất dùng cho điện di DNA - Agarose (BioRad). - Ethidium bromide. - Loading dye 6X (Promega). - Nước cất 2 lần. - Dung dịch TAE 1X (Tris acetat 40mM, EDTA 0,1mM, pH 8). - Thang DNA (100bp DNA ladder – Promega). 37 Hình 3.3: Thang DNA 3.1.3.4 Hóa chất dùng cho điện di RNA - MOPS buffer 5X (MOPS 10 mM, sodium acetat 2,5 mM, EDTA 0,5 mM, pH 7,0). - Formaldehyde 37%. - Formamide. - Nước cất khử ion, khử RNase. - Dung dịch đặt mẫu biến tính (loading dye biến tính). 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Tách chiết RNA Mẫu chồi dứa được lột hết các lá ngoài, lấy phần lõi trắng bên trong cắt thành từng mảnh nhỏ (<5mm), nghiền thành bột mịn trong Nitơ lỏng rồi đem ly trích RNA với bộ kit Aurum Total RNA Mini Kit theo các bước: 1. Cho 60 mg mẫu vào tube ly tâm 2 ml có nắp đậy. Hòa tan mẫu bằngvới 700 µl dung dịch ly giải (lysis solution). 2. Ly tâm dịch ly giải ở 14 000 vòng trong 3 phút, chuyển dịch nổi vào tube ly tâm 2 ml mới. 1500 bp 1000 bp 500 bp 100 bp 38 3. Thêm 700 µl ethanol 70% vào mỗi tube, hòa tan bằng pipet cho đến khi dung dịch không còn phân lớp. 4. Ủ ấm dịch hòa tan trong water bath 700C (chuẩn bị cho bước 12). Đặt RNA binding column vào tube ly tâm 2 ml không nắp. 5. Cho 700 µl dung dịch ở bước 3 vào RNA binding column, ly tâm 60 giây, loại bỏ dịch lọc. Thực hiện tương tự cho hết phần dịch còn lại. 6. Cho 700 µl dịch rửa low stringency vào RNA binding column, ly tâm 30 giây, loại bỏ dịch lọc. 7. Trộn 5 µl DNase với 75 µl dung dịch DNase delution (trong tube 1.5 ml), cho vào RNA binding column. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, ly tâm 30 giây, loại bỏ dịch lọc. 8. Cho 700 µl dung dịch high stringency vào RNA binding column, ly tâm 30 giây, loại bỏ dịch lọc 9. Thực hiện tương tự bước 12 với dung dịch low stringency 10. Ly tâm thêm 1 phút để loại bỏ hoàn toàn dịch rửa. 11. Chuyển RNA binding column vào tube 1.5 ml có nắp đậy, cho 80 µl dịch hòa tan (elution solution) đã ủ ở 70oC ở bước 5 vào, ủ 1 phút, ly tâm 2 phút để thu RNA tổng số. Dung dịch RNA được bảo quản ở 40C. 3.2.2 Điện di sản phẩm ly trích RNA Nấu 16 ml gel 1,8%, chờ nguội đến khoảng 65oC, cho thêm 4 ml MOPS 5X và 400 µl formaldehyde. Khi gel nguội, ngâm trong dung dịch MOPS 1X khoảng 30 phút trước khi điện di. Mẫu sản phẩm RNA trước khi điện di được làm biến tính ở 65oC trong 30 phút rồi làm lạnh nhanh trong nước đá khoảng 1 phút. Sau đó, trộn với dung dịch nạp mẫu biến tính rồi đem điện di ở 30V trong 150 phút. Sản phẩm điện di được quan sát dưới đèn cực tím. 39 3.2.3 Xây dựng quy trình RT-PCR 3.2.3.1 Kiểm tra độ đặc hiệu của primer Trước khi được dùng làm mồi đặc hiệu cho phản ứng RT-PCR phát hiện PMWaV-1, cặp primer 225, 226 được kiểm tra các cấu trúc thứ cấp bằng phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer của hãng IDT ( và được kiểm tra độ đặc hiệu cho PMWaV-1 bằng công cụ BLAST của NCBI ( 3.2.3.2 Xác định chu trình nhiệt tối ưu Quy trình RT-PCR được thực hiện theo theo kiểu one step. Primer 226 sẽ thực hiện phản ứng reverse với tác động của enzyme reverse transcriptase, tổng hợp sợi cDNA từ RNA của PMWaV-1. Sau đó dưới tác động của Taq – polymerase, cả hai primer 225 và 226 sẽ hoạt động, khuếch đại các cDNA vừa tạo. Với nguyên tắc trên, phản ứng RT-PCR tối ưu sẽ được khảo sát dựa trên 5 chu trình sau Bảng 3.1: Các chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR được khảo sát Chu trình nhiệt Giai đoạn 1 2 3 4 5 Tạo cDNA 45oC/45’ 94oC/2’ 45oC/45’ 94oC/2’ 45oC/45’ 94oC/2’ 45oC/45’ 94oC/2’ 45oC/45’ 94oC/2’ Khuếch đại cDNA 92oC/30’’ 52oC/1’ 68oC/1’30’’ (45 chu kỳ) 92oC/30’’ 54oC/1’ 68oC/1’30’’ (45 chu kỳ) 92oC/30’’ 56oC/1’ 68oC/1’30’’ (45 chu kỳ) 92oC/30’’ 58oC/1’ 68oC/1’30’’ (45 chu kỳ) 92oC/30’’ 58oC/1’ 68oC/1’30’’ (10 chu kỳ) 92oC/30’’ 54oC/1’ 68oC/1’30’’ (35 chu kỳ) Kéo dài 68oC/8’ 68oC/8’ 68oC/8’ 68oC/8’ 68oC/8’ Trong đó chu trình 2 được thực hiện theo Sether (2001), các chu trình 1, 3, 4 chỉ thay đổi nhiệt độ bắt cặp ở giai đoạn khuếch đại cDNA của chu trình 2. 40 3.2.3.3 Xác định nồng độ primer thích hợp Hỗn hợp hóa chất cần thiết cho một sản phẩm PCR (50 µl) được pha như sau: Hóa chất Thể tích Nồng độ cuối AMV / Tfl Buffer (5X) 10 µl 1X dNTP (10mM) 1 µl 0.2 mM MgSO4 (25 mM) 2 µl 1 mM Enzyme reverse AMV (5 Unit/µl) 1 µl 0.1 Unit/µl Enzyme Taq polymerase Tfl (5 Unit/µl) 1 µl 0.1 Unit/µl Primer 225 (25 mM) --- --- Primer 226 (25 mM) --- --- RNA khuôn mẫu 2 µl Nước cất 2 lần 29 µl Trong đó, nồng độ primer cho phản ứng được khảo sát ở 3 mức nồng độ cuối là 1 mM, 0,8 mM và 0,6 mM. 3.2.3.4 Xác định số chu kỳ phản ứng tối ưu. Phản ứng RT-PCR được thực hiện ở 5 mức 41, 42, 43, 44, 45 chu kỳ để xác định số chu kỳ cho hiệu quả khuếch đại tối ưu. 3.3.4 Điện di sản phẩm RT-PCR Sản phẩm PCR được đem điện di trên gel agarose 1.5% với hiệu điện thế 50V trong 90 phút. Quan sát kết quả điện di dưới đèn cực tím. Kích thước các sản phẩm PCR được ghi nhận thông qua sự so sánh với thang chuẩn 100 bp DNA ladder (Promega). Những mẫu khuếch đại có chứa band với kích thước 600 bp, tương đương với đoạn 589 bp trên lý thuyết, sẽ là những mẫu dương tính - bị nhiễm PMWaV-1. 41 3.3.5 Giải trình tự sản phẩm RT-PCR Để kiểm tra độ đặc hiệu của sản phẩm RT-PCR, có 2 mẫu sản phẩm RT-PCR dương tính trên điện di, 1 của cây bệnh, 1 của chồi dứa thương phẩm (không có triệu chứng bệnh) được đem giải trình tự. Do hạn hẹp về thời gian thực hiện đề tài, chúng tôi không thể trực tiếp tiến hành giải trình tự nên gửi mẫu sản phẩm RT-PCR sang công ty Macrogene – Hàn Quốc để thực hiện. Sau đó, trình tự sẽ được so sánh với dữ liệu của đoạn gene mã hóa cho HSP 70 của PMWaV-1 trên GenBank bằng các phần mềm Clustal X 1.83 và BLAST. 3.3.6 Giám định chồi giống dứa Áp dụng quy trình đã xây dựng được, tiến hành giám định trên 3 giống dứa Thái Lan, Trung Quốc, Lâm Đồng, mỗi giống gồm 30 mẫu chồi giống dứa thương phẩm được lấy ngẫu nhiên từ các nông trường. Tất cả được thực hiện phản ứng RT-PCR và điện di. 42 Phần 4 KẾT QUẢ – THẢO LUẬN 4.1 Kết quả ly trích RNA Sau khi tiến hành ly trích RNA tổng số của mẫu dứa, sản phẩm ly trích được điện di trong MOPS buffer 1X để kiểm chứng xem có thu được RNA hay không. Kết quả kiểm tra sản phẩm RNA sau ly trích được thể hiện qua hình sau: Hình 4.1: Kết quả điện di sản phẩm ly trích RNA Chú thích: Giếng 1: Mẫu RNA không biến tính Giếng 2: Mẫu RNA biến tính Khi ly trích RNA thực vật, sản phẩm chiếm đại đa số là 2 tiểu phần ribosome 18S và 28S. Các loại RNA khác như mRNA, RNA virus có rất ít nên khi điện di, hầu như không thể thấy được các sản phẩm này, chỉ có thể thấy được 2 vạch 28S và 18S. Vì vậy