Luận án Đánh giá độc tính của 3 - Monocloro propan - 1, 2 - diol (3 - mcpd) trên gan, máu và thần kinh của chuột nhắt

ồ 3.2. Tác động của 3-MCPD trên các chỉ số hồng cầu ở các lô thử nghiệm độc tính mạn 6 tháng 59 c. Tác động của 3-MCPD sau 6 tháng phơi nhiễm trên tiểu cầu Bảng 3.3. Tác động của 3-MCPD trên các chỉ số tiểu cầu ở các lô thử nghiệm độc tính mạn 6 tháng Lô n (ban đầu) n (kết thúc) Số mẫu máu đạt PLT (x 103/mm3) MPV (fL) Chứng 20 18 15 746,6 ± 62,3 6,9 ± 0,1 3-MCPD 1 mg/kg 20 18 13 923,5 ± 61,6 6,9 ± 0,2 3-MCPD 10 mg/kg 20 11 11 1129,0 ± 59,9*** 5,7 ± 0,1*** 3-MCPD 20 mg/kg 20 14 14 1154,5 ± 55,5*** 5,6 ± 0,1*** ***P < 0,001 so với lô chứng (phép kiểm t-Student) Biểu đồ 3.3. Tác động của 3-MCPD trên các chỉ số tiểu cầu ở các lô thử nghiệm độc tính mạn 6 tháng So với lô chứng thì số lượng tiểu cầu ở các lô uống 3-MCPD đều tăng lên, trong đó 3-MCPD 10 mg/kg và 20 mg/kg gây tăng rõ rệt (tăng khoảng 50%) và đạt ý nghĩa thống kê (P < 0,001). Tuy nhiên thể tích trung bình của tiểu cầu lại giảm ở các lô sử dụng 3-MCPD. Tiểu cầu gia tăng trong một số trường hợp sau [3],[5-6]: - Thiếu máu (do thiếu sắt hoặc do tán huyết) - Ung thư 60 - Nhiễm trùng hay viêm mạn tính Kết quả trên hồng cầu không cho thấy 3-MCPD gây thiếu máu, do đó có thể độc tính của 3-MCPD có liên quan đến tiềm năng gây ung thư hoặc viêm nhiễm mạn tính. Nhiệm vụ chính của tiểu cầu là tham gia vào quá trình cầm máu và đông máu, nên những thay đổi này có thể làm thay đổi chất lượng và chức năng tiểu cầu, có thể làm tăng nguy cơ tăng đông. 3.1.1.2. Tác động của 3-MCPD trên công thức máu sau 12 tháng phơi nhiễm Thử nghiệm 6 tháng về tác động của 3-MCPD trên công thức máu thu được một số kết quả bất thường như sự tăng bạch cầu lympho, giảm thể tích trung bình hồng cầu, hay sự gia tăng số lượng tiểu cầu. Nhằm làm rõ hơn cũng như củng cố kết quả đã thu được, tác động của 3-MCPD trên công thức máu tiếp tục được khảo sát với thời gian dài hơn, 12 tháng. a. Tác động của 3-MCPD sau 12 tháng phơi nhiễm trên tổng lượng bạch cầu và các loại bạch cầu Bảng 3.4. Tác động của 3-MCPD trên các chỉ số bạch cầu ở các lô thử nghiệm độc tính mạn 12 tháng Lô thử nghiệm n ban đầu n kết thúc Mẫu máu đạt WBC (x103/mm3) NEU (x103/mm3) LYM (x103/mm3) MONO (x103/mm3) Chứng 20 10 8 6,04 ± 1,51 1,58 ± 0,81 3,99 ± 1,32 0,38 ± 0,60 3-MCPD 1 mg/kg 20 7 6 5,03 ± 2,51 0,22 ± 0,13** 3,72 ± 0,80 1,06 ± 0,28* 3-MCPD 10 mg/kg 20 11 9 2,93 ± 1,19*** 0,28 ± 0,33** 1,66 ± 0,82*** 0,61 ± 0,63 3-MCPD 40 mg/kg 20 0 0 Tử vong Tử vong Tử vong Tử vong *P < 0,05; ** P < 0,01; ***P < 0,001 so với lô chứng (phép kiểm t-Student) Kết quả thử nghiệm độc tính mạn của 3-MCPD trong 6 tháng chưa thấy được sự đáp ứng theo liều giữa 10 mg/kg và 20 mg/kg, vì thế trong thí nghiệm này liều 20 mg/kg được thay bằng lô sử dụng liều 40 mg/kg. Tuy nhiên, sau 12 tháng thử nghiệm, toàn bộ chuột trong lô sử dụng liều 3-MCPD 40 mg/kg bị tử vong. Ngoài ra, khi lấy máu để xét nghiệm công thức máu rất nhiều mẫu máu bị đông, vì thế kết 61 quả cuối cùng cho mỗi lô có sự khác biệt về số mẫu. Kết quả thử nghiệm độc tính mạn của 3-MCPD trong 12 tháng có một số điểm tương đồng và một số điểm khác biệt so với 6 tháng:  Tổng lượng bạch cầu ở lô sử dụng 3-MCPD có khuynh hướng giảm trong 6 tháng, ở thử nghiệm 12 tháng tổng lượng bạch cầu ở lô 3-MCPD giảm rõ rệt.  Bạch cầu trung tính giảm ở các lô sử dụng 3-MCPD trong thử nghiệm 6 tháng, kết quả này lặp lại trong thử nghiệm 12 tháng.  Tuy nhiên có sự đảo nghịch kết quả giữa thử nghiệm 6 tháng và 12 tháng trên bạch cầu lympho và bạch cầu đơn nhân Biểu đồ 3.4. Tác động của 3-MCPD trên các chỉ số bạch cầu ở các lô thử nghiệm độc tính mạn 12 tháng 62 Nguyên nhân của sự đảo nghịch bất thường về số lượng bạch cầu lympho và bạch cầu đơn nhân chưa có cơ sở xác định chính xác. Tuy nhiên, từ những kết quả thực nghiệm, có thể giả thuyết rằng 3-MCPD gây độc tính trên hệ tạo máu, gây tăng đáp ứng của lympho nhưng sau đó gây suy giảm sự tạo lympho. Khi số lượng lympho giảm, có thể gây ra tình trạng tăng số lượng bạch cầu đơn nhân theo kiểu phản ứng (reactive monocytosis) [104]. b. Tác động của 3-MCPD sau 12 tháng phơi nhiễm trên tế bào hồng cầu Bảng 3.5. Tác động của 3-MCPD trên các chỉ số hồng cầu ở các lô thử nghiệm độc tính mạn 12 tháng Lô n (ban đầu) n (kết thúc) Mẫu máu đạt RBC (x 106/mm3) Hb (g/L) Hct (%) MCV (fL) MCH (pg) MCHC (g/dL) Chứng 20 10 8 9,4 ± 0,8 147,6 ± 14,7 49,6 ± 3,3 52,6 ± 2,6 15,6 ± 0,7 297,6 ± 16,3 3-MCPD 1 mg/kg 20 7 6 8,3 ± 1,3 120,8 ± 14,8** 45,4 ± 5,2 55,2 ± 3,6 14,6 ± 0,9 265,3 ± 8,1 3-MCPD 10 mg/kg 20 11 9 7,3 ± 1,7** 114,3 ± 11,7*** 38,8 ± 8,5** 53,4 ± 2,5 16,5 ± 4,7 307,4 ± 79,9 **p < 0,01 so với chứng; ***p < 0,001 so với chứng (phép kiểm t-Student) - Trên số lượng hồng cầu, hematocrit và hemoglobin, 3-MCPD 1 mg/kg và 10 mg/kg gây giảm các chỉ số này so với lô chứng. Mặc dù mức độ giảm có thể chưa thể hiện tình trạng thiếu máu, tuy nhiên phơi nhiễm kéo dài 3-MCPD có thể tác động đến các thành phần và hình thái của hồng cầu và đây có thể là do độc tính của hóa chất này. - Trên các thông số MCH, MCHC và MCV, tất cả đều không cho thấy có sự thay đổi rõ rệt. Ngoại trừ ở lô phơi nhiễm 3-MCPD 10 mg/kg có 2 chỉ số MCH và MCHC có khuynh hướng gia tăng so với lô chứng. Tuy nhiên do độ dao động lớn nên chưa đạt ý nghĩa thống kê. 63 Biểu đồ 3.5. Tác động của 3-MCPD trên các chỉ số hồng cầu ở các lô thử nghiệm độc tính mạn 12 tháng Như vậy, so với tác động sau khi phơi nhiễm 6 tháng, với khuynh hướng gây giảm thể tích trung bình hồng cầu và gây tăng nồng độ huyết sắc tố trung bình hồng cầu, thì sau 12 tháng phơi nhiễm, 3-MCPD có tác động làm giảm số lượng hồng cầu, 64 giảm hemoglobin và hematocrit. Vì thế có thể cho rằng 3-MCPD có nguy cơ gây ra thiếu máu. c. Tác động của 3-MCPD sau 12 tháng phơi nhiễm trên tiểu cầu. Bảng 3.6. Tác động của 3-MCPD trên tiểu cầu ở các lô thử nghiệm độc tính mạn 12 tháng Chứng (n = 8) 3-MCPD 1 mg/kg (n = 6) 3-MCPD 10 mg/kg (n = 9) Số lượng tiểu cầu (PLT – x 103/mm3) 882,29 ± 120,53 1372,43 ± 258,17** 1071,89 ± 197,94* *P < 0,05; **P < 0,01 so với chứng (phép kiểm t-Student) Số lượng tiểu cầu Biểu đồ 3.6. Tác động của 3-MCPD trên tiểu cầu ở các lô thử nghiệm độc tính mạn 12 tháng Kết quả cho thấy số lượng tiểu cầu ở các lô phơi nhiễm 3-MCPD 1 mg/kg, 10 mg/kg đều tăng có ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Kết quả thu được trong thực nghiệm 12 tháng này đã củng cố cho kết quả thu được sau 6 tháng. Như vậy, 3-MCPD gây tác động bất lợi trên tiểu cầu và có thể làm thay đổi chức năng của tiểu cầu trong hệ thống đông-cầm máu. Như vậy, với thiết kế thử nghiệm đánh giá độc tính của 3-MCPD trên công thức máu và kết quả thu được, các bất thường được tổng kết lại như sau: 65 Sơ đồ 3.1. Tổng kết độc tính của 3-MCPD trên công thức máu Phơi nhiễm 3-MCPD (1 mg/kg – 10 mg/kg – 20 mg/kg) Đánh giá độc tính của 3-MCPD trên công thức máu Phơi nhiễm 6 tháng Phơi nhiễm 12 tháng Hồng cầu - Tăng MCHC - Có khuynh hướng giảm Hct và MCV Hồng cầu - Giảm số lượng hồng cầu - Giảm hemoglobin - Giảm Hct - Có khuynh hướng tăng MCH và MCHC 3-MCPD gây thiếu máu, gây tăng sắc tố Tiểu cầu - Tăng số lượng tiểu cầu - Giảm MPV Tiểu cầu - Tăng số lượng tiểu cầu 3-MCPD gây tăng tiểu cầu Bạch cầu - Giảm bạch cầu trung tính - Tăng bạch cầu lympho Bạch cầu - Giảm tổng lượng bạch cầu - Giảm bạch cầu trung tính - Giảm bạch cầu lympho - Tăng bạch cầu đơn nhân - Lympho đa hình 3-MCPD gây: - Suy giảm số lượng bạch cầu trung tính - Rối loạn sản xuất bạch cầu lympho - Tăng bạch cầu đơn nhân theo dạng phản ứng 66 Từ kết quả trên, có thể thấy rằng: phơi nhiễm mạn tính 3-MCPD ở những liều từ 1 mg/kg – 20 mg/kg gây độc tính trên hệ tạo máu. Độc tính này thể hiện khác nhau trên từng dòng tế bào máu. Rối loạn sản xuất bạch cầu lympho và gia tăng số lượng tiểu cầu có thể là dấu hiệu của nguy cơ gây ung thư máu của 3-MCPD. 3.1.2. Đánh giá độc tính của 3-MCPD trên hình thái hồng cầu và bạch cầu 3.1.2.1. Thẩm định kỹ thuật phết máu ngoại vi để quan sát hình thái hồng cầu Kỹ thuật phết máu được thẩm định theo các tiêu chuẩn sau: - Thực hiện 6 mẫu phết máu theo quy trình mô tả trong phần phương pháp - Kết quả thẩm định kỹ thuật phết máu được trình bày dưới đây: Tiêu chuẩn Kết quả (cả 6 mẫu) Làn máu phải mỏng đều, không có vết sọc ngang, dọc, không loang lổ Đạt Xem kính hiển vi thấy hồng cầu xếp cạnh nhau chứ không chồng lên nhau Đạt Màu nhuộm cho thấy rõ hình dạng đĩa của hồng cầu, phân biệt rõ sự bắt màu của hồng cầu Đạt 3.1.2.2. Đánh giá tác động của 3-MCPD trên hình thái hồng cầu Một trong những chỉ tiêu quan trọng của xét nghiệm huyết học là theo dõi hình thái các loại tế bào máu, đặc biệt là hồng cầu và điều này thì xét nghiệm sinh hóa thường quy không thể đánh giá được. Vì thế, bên cạnh việc khảo sát công thức máu, hình thái hồng cầu cũng được quan sát và so sánh với lô chứng để tìm những khác biệt có ý nghĩa. Thiết kế đánh giá tác động của 3-MCPD trên hình thái hồng cầu được thực hiện ở 3 pha: pha cấp tính, bán cấp tính và mạn tính. a. Đánh giá tác động của 3-MCPD trên hình thái hồng cầu ở pha cấp tính Trong quá trình thử nghiệm, chỉ có chuột của lô chứng, lô 1 mg/kg và lô 10 mg/kg là còn sống trong suốt thời gian thử nghiệm. Ðối với lô uống 3-MCPD 100 mg/kg, chuột bắt đầu chết vào ngày thứ ba và sau 5 ngày thì không còn chuột nào sống sót. Nguyên nhân gây chết có thể là do độc tính của 3-MCPD và trước khi chết chuột đều có dấu hiệu liệt chi sau. Trên 6 mẫu nhuộm màu của mỗi lô thí nghiệm, chúng 67 tôi tiến hành quan sát hình thái hồng cầu và so sánh với nhóm chứng để đánh giá sự khác biệt. Kết quả được minh họa ở các hình 3.1, 3.2, 3.3, 3.4. Hình 3.1. Hình thái hồng cầu sau khi phơi nhiễm 3-MCPD trong 24 giờ Nhìn chung, sau 24 giờ phơi nhiễm, chúng tôi vẫn chưa nhận thấy biểu hiện bất thường trên hình thái hồng cầu ở các lô thử nghiệm với các liều 3-MCPD 1 mg/kg, 10 mg/kg và 100 mg/kg. Hình 3.2. Hình thái hồng cầu sau khi phơi nhiễm 3-MCPD trong 48 giờ Chứng 3-MCPD 10 mg/kg 3-MCPD 1 mg/kg 3-MCPD 100 mg/kg Chứng 3-MCPD 1 mg/kg 3-MCPD 10 mg/kg 3-MCPD 100 mg/kg 68 Hình 3.3. Hình thái hồng cầu sau khi phơi nhiễm 3-MCPD trong 72 giờ Sau 48 giờ và 72 giờ, hình thái hồng cầu của lô 1 mg/kg và 10 mg/kg vẫn không có sự thay đổi so với lô chứng. Tuy nhiên, hồng cầu ở lô 100 mg/kg có màng tế bào không còn tròn đều, xuất hiện những chỗ lồi và xuất hiện một số tế bào hồng cầu có gai nhọn. Như vậy, 3-MCPD ở liều 100 mg/kg chỉ trong thời gian ngắn có thể đã tác động đến màng tế bào hồng cầu dẫn đến thay đổi đến cấu trúc màng tế bào, từ đó dẫn đến thay đổi hình thái hồng cầu. Tương tự, sau 2 tuần, vẫn không quan sát thấy có biểu hiện bất thường về hình thái hồng cầu được ghi nhận ở hai lô 1 mg/kg và lô 10 mg/kg so với lô chứng. Điều này cho thấy 3-MCPD liều 1 mg/kg và 10 mg/kg trong thời gian ngắn không có ảnh hưởng đến cấu trúc màng tế bào hồng cầu (hình 3.4). 3-MCPD 100 mg/kg Chứng 3-MCPD 1 mg/kg 3-MCPD 10 mg/kg 3-MCPD 100mg/kg 69 Hình 3.4. Hình thái hồng cầu sau khi phơi nhiễm 3-MCPD trong 2 tuần. b. Đánh giá tác động của 3-MCPD trên hình thái hồng cầu ở pha bán cấp tính Thử nghiệm được tiến hành trên 2 liều lượng 3-MCPD: 1 mg/kg và 10 mg/kg với thời gian gây phơi nhiễm là 3 tháng. Kết quả được minh họa ở hình 3.5. Hình 3.5. Hình thái hồng cầu sau khi phơi nhiễm 3-MCPD trong 3 tháng Chứng 3-MCPD 10 mg/kg 3-MCPD 1 mg/kg Chứng 3-MCPD 10 mg/kg 3-MCPD 1 mg/kg 70 - Sau 3 tháng hình thái hồng cầu ở lô 1 mg/kg vẫn không có sự thay đổi so với lô chứng. Tuy nhiên, ở lô 10 mg/kg, màng hồng cầu đã bắt đầu thay đổi, những chỗ lồi trên màng hồng cầu rõ hơn, hình thành những gai nhọn hay tròn. Tế bào hồng cầu có hình dạng như thế này được gọi là hồng cầu hình gai (echinocytes hay crenated/ burr cells), có hình dạng với nhiều thể hình kim đồng nhất đâm xuyên ra ngoài màng tế bào. c. Đánh giá tác động của 3-MCPD trên hình thái hồng cầu ở pha mạn tính Thử nghiệm được tiến hành trên 3 liều lượng 3-MCPD: 1 mg/kg, 10 mg/kg và 40 mg/kg với thời gian gây phơi nhiễm là 6 tháng và 12 tháng. Kết quả được minh họa ở hình 3.6 và 3.7. Hình 3.6. Hình thái hồng cầu sau khi phơi nhiễm 3-MCPD trong 6 tháng - Sau 6 tháng và 12 tháng, 3-MCPD liều 1 mg/kg vẫn chưa gây những thay đổi về hình thái hồng cầu so với lô chứng. - Ở lô 10 mg/kg, sau 6 tháng và 12 tháng, và ở lô 40 mg/kg, sau 6 tháng, kết quả tương tự như khi phơi nhiễm 3-MCPD ở liều 10 mg/kg trong 3 tháng nhưng số lượng hồng cầu gai nhọn xuất hiện nhiều hơn. Như vậy, sau 12 tháng sử dụng liên tục, 3-MCPD ở 2 liều 10 mg/kg và 40 mg/kg gây biến đổi hình thái hồng cầu rõ rệt. Kích thước hồng cầu nhỏ lại, sắc tố gia tăng Chứng 3-MCPD 1 mg/kg 3-MCPD 10 mg/kg 3-MCPD 40 mg/kg 71 và hồng cầu có dạng gai. Hình 3.7. Hình thái hồng cầu sau khi phơi nhiễm 3-MCPD trong 12 tháng Tóm tắt kết quả quan sát tác động của 3-MCPD trên sự thay đổi hình thái hồng cầu được trình bày trong bảng 3.7. Bảng 3.7. Tổng kết sự thay đổi hình thái hồng cầu khảo sát bằng phương pháp phết máu ngoại vi Thời gian thử nghiệm Chứng (n = 6) 3-MCPD 1 mg/kg (n = 6) 3-MCPD 10 mg/kg (n = 6) 3-MCPD 40 mg/kg (n = 6) 3-MCPD 100 mg/kg (n = 6) 24 giờ (-) (-) (-) (-) 48 giờ (-) (-) (-) (+) 72 giờ (-) (-) (-) (+) 2 tuần (-) (-) (-) 3 tháng (-) (-) (+) 6 tháng (-) (-) (+) (+) 12 tháng (-) (-) (+) (-): không quan sát được sự thay đổi hình thái (+): quan sát được sự thay đổi hình thái, hồng cầu có dạng gai 72  Khảo sát các chỉ số bất thường của hồng cầu trên xét nghiệm huyết học sau khi phơi nhiễm 12 tháng Sau khi ghi nhận được 3-MCPD gây ra sự biến đổi hình thái hồng cầu ở các thí nghiệm trước, kết quả này tiếp tục được kiểm chứng sau 12 tháng phơi nhiễm bằng cách sử dụng xét nghiệm huyết học trên máy ADVIA 2120i của hãng SIEMENS, Hoa Kỳ. Kết quả xét nghiệm này được thống kê và trình bày trong bảng 3.8. Bảng 3.8. Kết quả xét nghiệm bất thường hồng cầu bằng máy huyết đồ ADVIA 2120i Chứng (n = 8) 3-MCPD 1 mg/kg (n = 6) 3-MCPD 10mg/kg (n = 9) RBC MORPH (Biến đổi hình thái hồng cầu) Âm tính Âm tính 55,55%* (5/9 mẫu dương tính) NucRBC (Hồng cầu có vi nhân) Âm tính Âm tính 55,55%* (5/9 mẫu dương tính) NRBC (Hồng cầu có nhân kết đặc) Âm tính 16,66% (1/6 mẫu dương tính) 22,22%* (2/9 mẫu dương tính) RBC Fragment (Hồng cầu phân mảnh) Âm tính 100 %** (6/6 mẫu dương tính) 55,56%** (5/9 mẫu dương tính) MICRO (Hồng cầu nhỏ) Âm tính 100 %** (6/6 mẫu dương tính) 55,56%** (5/9 mẫu dương tính) *P < 0,05; **P < 0,01 so với lô chứng (phép kiểm Chi bình phương)  Nhận xét: Ở các thí nghiệm trước, có sự thay đổi hình thái hồng cầu ở lô sử dụng 3-MCPD 10 mg/kg liên tục 6 tháng, với việc xuất hiện những gai nhọn hay tròn trên bề mặt màng hồng cầu. Trong thử nghiệm lần này, có 5/9 mẫu 3-MCPD 10 mg/kg có biến đổi về hình thái hồng cầu. Kết quả này khá tương đồng với kết quả được quan sát và chụp bằng kính hiển vi quang học (Hình 3.6). Ở lô 3-MCPD 1 mg/kg, mặc dù máy xét nghiệm không phát có sự biến đổi hình thái, tuy nhiên khi quan sát trên kính hiển vi, các dạng hình cầu gai nhỏ vẫn quan sát được. Ngoài tác dụng gây biến đổi hình thái hồng cầu, kết quả xét nghiệm bất thường hồng cầu còn cho thấy 3-MCPD gây hiện tượng hồng cầu có vi nhân (NucRBC), hồng cầu có nhân kết đặc (NRBC) và đặc biệt là gây phân mảnh hồng cầu, cùng với 73 tình trạng hồng cầu có kích thước thu nhỏ. 3.1.2.3. Đánh giá tác động của 3-MCPD trên hình thái bạch cầu Để tìm hiểu thêm các vấn đề liên quan đến chỉ số bạch cầu, đặc biệt là bạch cầu lympho khi kết quả thu được sau 12 tháng có sự thay đổi khác với kết quả thu được sau 6 tháng, xét nghiệm bất thường bạch cầu lympho được thực hiện trên máy huyết đồ ADVIA 2120i. Kết quả được trình bày trong bảng 3.9. Bảng 3.9. Kết quả lympho bất thường sau khi phơi nhiễm 3-MCPD mạn tính trong 12 tháng Chứng (n = 8) 3-MCPD 1 mg/kg (n = 6) 3-MCPD 10 mg/kg (n = 9) Variant Lympho (Lympho đa hình) Âm tính Âm tính 44,44%* (4/9 mẫu dương tính) Atypical lymphocyte (Lympho bất thường) Âm tính 100% %** (6/6 mẫu dương tính) 44,44%* (4/9 mẫu dương tính) *p < 0,05; **p < 0,01 (phép kiểm Chi bình phương) Tần số xuất hiện các lympho đa hình (variant lympho) ở lô 3-MCPD 10 mg/kg là 44,44%, tuy nhiên kết quả này là âm tính ở lô sử dụng 3-MCPD 1 mg/kg. Trong khi đó ở cả 2 lô phơi nhiễm 3-MCPD đều có lympho bất thường. Hiện tượng xuất hiện lympho đa hình chủ yếu là do sự thay đổi về hình thái của lympho trong quá trình biệt hóa, trong khi đó lympho bất thường là dạng lympho xuất hiện trong đáp ứng miễn dịch. Kết quả này cần phải được biện giải cẩn thận, trước khi có bất kỳ kết luận nào về tác động của 3-MCPD trên bạch cầu lympho. Một giả thuyết cho rằng việc xuất hiện các lympho bất thường này phản ánh sự rối loạn tăng sinh lympho hay khả nghi về chứng tăng bạch cầu đơn nhân [104]. 3.1.3. Đánh giá độc tính của 3-MCPD trên thời gian đông máu – chảy máu Trong nghiên cứu về công thức máu, 3-MCPD làm tăng số lượng tiểu cầu sau 6 tháng và 12 tháng ở các liều khác nhau (1 mg/kg, 10 mg/kg và 20 mg/kg). Sự gia tăng tiểu cầu có thể ảnh hưởng đến quá trình đông máu và ảnh hưởng đến huyết động học ở chuột thí nghiệm. Vì thế, để tiếp tục làm rõ ý nghĩa sinh lý bệnh của sự gia tăng tiểu cầu, thời gian chảy máu và đông máu được khảo sát ở các lô chuột được cho uống 3-MCPD trong 3 tháng, 6 tháng và 12 tháng. 74 3.1.3.1. Thẩm định phương pháp xét nghiệm đông-cầm máu Thẩm định phương pháp xét nghiệm đông-cầm máu được thực hiện trên 6 mẫu máu toàn phần của cùng 1 chuột khỏe mạnh để đánh giá độ lập lại của phương pháp.  Độ lặp lại của phương pháp xác định thời gian chảy máu Thực hiện xác định thời gian chảy máu trên cùng 1 chuột khỏe mạnh trong các ngày khác nhau thu được kết quả như sau: Lần Thời gian chảy máu (giây) 1 156 2 168 3 148 4 162 5 150 6 149 Trung bình 155,5 SD 8,09 RSD 5,2 % Kết quả: đạt  Độ lặp lại của phương pháp xác định thời gian đông máu Thực hiện xác định thời gian đông máu trên cùng 1 chuột khỏe mạnh 6 lần khác nhau thu được kết quả như sau: Lần Thời gian đông máu (phút) 1 11,76 2 11,67 3 11,53 4 11,58 5 11,75 6 11,36 Trung bình 11,6 SD 0,15 RSD 1,3 % Kết quả: đạt 75 3.1.3.2. Tác động của 3-MCPD lên thời gian chảy máu Bảng 3.10. Tác động của 3-MCPD lên thời gian chảy máu sau khi phơi nhiễm 3 tháng, 6 tháng và 12 tháng Thời gian chảy máu trung bình sau 3 tháng (giây) Thời gian chảy máu trung bình sau 6 tháng (giây) Thời gian chảy máu trung bình sau 12 tháng (giây) Chứng 151,38 ± 9,2 165,45 ± 12,48 182,33 ± 31,46 1 mg/kg 144,75 ± 11,36 147,08 ± 12,03 170,88 ± 21,12 10 mg/kg 106,84 ± 8,56** 112,07 ± 8,29** 122,80 ± 33.23** 40 mg/kg 99,14 ± 6,42*** 97,14 ± 7,28*** Tử vong **P < 0,01; ***P < 0,001 so với lô chứng (phép kiểm t-Student) Biểu đồ 3.7. Thời gian chảy máu ở các lô thử nghiệm sau 3 tháng, 6 tháng, 12 tháng phơi nhiễm 3-MCPD Nhìn chung, sau 3 tháng, thời gian chảy máu ở lô 10 mg/kg và lô 40 mg/kg giảm rõ rệt và đều có ý nghĩa thống kê so với lô chứng và kết quả cũng lặp lại với hai lô này sau 6 tháng và với lô 10 mg/kg sau 12 tháng. Như vậy 3-MCPD đã tác động đến 76 quá trình cầm máu sơ khởi sau 3 tháng ở liều 10 mg/kg và 40 mg/kg. Thời gian chảy máu ở lô 1 mg/kg sau 3 tháng, 6 tháng và 12 tháng có giảm nhẹ so với lô chứng nhưng không có ý nghĩa thống kê. 3.1.3.3. Tác động 3-MCPD lên thời gian đông máu Bảng 3.11. Tác động của 3-MCPD lên thời gian đông máu sau khi phơi nhiễm 3 tháng, 6 tháng và 12 tháng **P < 0,01; ***P < 0,001 so với lô chứng (phép kiểm t-Student) Biểu đồ 3.8. Thời gian đông máu ở các lô thí nghiệm sau 3 tháng, 6 tháng, 12 tháng phơi nhiễm 3-MCPD Thời gian đông máu trung bình 3 tháng (phút) Thời gian đông máu trung bình 6 tháng (phút) Thời gian đông máu trung bình 12 tháng (phút) Chứng 11,61 ± 0,16 11,54 ± 0,21 12,30 ± 0,81 1 mg/kg 9,37 ± 0,16*** 8,25 ± 0,14*** 10,03 ± 1,37** 10 mg/kg 9,3 ± 0,09*** 7,86 ± 0,22*** 9,53 ± 1,44*** 40 mg/kg 5,93 ± 0,3*** 4,15 ± 0,27*** Tử vong 77 So với lô chứng, cả ba liều 3-MCPD 1 mg/kg, 10 mg/kg và 40 mg/kg đều làm giảm thời gian đông máu sau 3 tháng và 6 tháng dùng 3-MCPD liên tục và có ý nghĩa thống kê (p < 0,001). Sau 12 tháng, kết quả cũng lặp lại với sự giảm thời gian đông máu ở lô 1 mg/kg (p < 0,01) và lô 10 mg/kg (p < 0,001). Như vậy, từ kết quả của thí nghiệm về số lượng tiểu cầu, thời gian chảy máu và thời gian đông máu, có thể nhận định rằng 3-MCPD gây tác động bất lợi trên chức năng tiểu cầu và có ảnh hưởng nhất định đến chức năng của tiểu cầu trong hệ thống đông-cầm máu.  Tóm tắt lại các bất thường trên huyết học tác động bởi 3-MCPD Kết quả đánh giá độc tính của 3-MCPD trên huyết học  Hồng cầu: - giảm số lượng hồng cầu - giảm hemoglobin - giảm hematocrit  Bạch cầu: - giảm tổng lượng bạch cầu - giảm bạch cầu trung tính - tăng bạch cầu lympho nhưng sau đó giảm  Tiểu cầu: - Tăng số lượng tiểu cầu - Giảm thể tích trung bình tiểu cầu  Hồng cầu: - dạng hình gai - kích thước nhỏ - bị phân mảnh - nhân kết đặc  Bạch cầu lympho: - lympho đa hình - lympho bất thường  Rút ngắn thời gian chảy máu  Rút ngắn thời gian đông máu Công thức máu Hình thái Đông – cầm máu 78 3.2. Đánh giá độc tính của 3-MCPD trên nhiễm sắc thể 3.2.1. Khảo sát tác động gây sự hình thành vi nhân của 3-MCPD ở pha cấp tính Sau thời gian phơi nhiễm 3-MCPD trong 24 - 48 - 72 giờ và 2 tuần, chuột thí nghiệm được lấy máu đuôi để phết máu nhằm theo dõi sự xuất hiện vi nhân trong hồng cầu. Trong quá trình thử nghiệm, chỉ có chuột của lô chứng, lô 1 mg/kg và lô 10 mg/kg là còn sống trong suốt thời gian thử nghiệm. Đối với lô uống 3-MCPD 100 mg/kg, chuột bắt đầu chết vào ngày thứ ba và sau 5 ngày thì không còn chuột nào sống sót. Nguyên nhân gây chết có thể là do độc tính của 3-MCPD và trước khi chết chuột đều có dấu hiệu liệt chi sau. Trên 6 mẫu nhuộm màu của mỗi lô thí nghiệm, tiến hành đếm số lượng hồng cầu có vi nhân trên tổng số hồng cầu trong một thị trường quan sát, từ đó tính tỷ lệ phần trăm sự hình thành vi nhân trong mỗi lô thí nhiệm. Kết quả được trình bày ở các bảng 3.12, 3.13, 3.14 và 3.15. Bảng 3.12. Số lượng vi nhân quan sát trong một thị trường ở các lô thí nghiệm sau khi phơi nhiễm 3-MCPD trong 24 giờ **P < 0,01 so với lô chứng (phép kiểm Chi bình phương) Lô Chứng (n = 6) 3-MCPD 1 mg/kg (n = 6) 3-MCPD 10 mg/kg (n = 6) 3-MCPD 100 mg/kg (n = 6) Số hồng cầu có vi nhân/tổng số hồng cầu trên thị trường 0/247 1/329 0/272 0/421 0/283 0/398 0/240 0/289 0/217 0/238 0/351 0/312 0/430 0/242 0/339 0/415 0/382 0/361 4/366 8/342 6/350 4/398 5/326 4/411 % hồng cầu có chứa vi nhân 0,05 ± 0,05 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 1,44 ± 0,22** 79 Hình 3.8. Vi nhân ở tế bào hồng cầu của các lô thí nghiệm sau 24 giờ phơi nhiễm 3- MCPD (x 1000) Bảng 3.13. Số lượng vi nhân quan sát trong một thị trường ở các lô thí nghiệm sau khi phơi nhiễm 3-MCPD trong 48 giờ **P < 0,01 so với lô chứng (phép kiểm Chi bình phương) Lô Chứng (n = 6) 3-MCPD 1 mg/kg (n = 6) 3-MCPD 10 mg/kg (n = 6) 3-MCPD 100 mg/kg (n = 6) Số hồng cầu có vi nhân/tổng số hồng cầu trên thị trường 0/257 0/411 0/267 0/389 0/324 0/298 0/298 0/357 0/258 0/397 0/411 0/335 1/393 0/248 0/421 0/336 0/264 0/315 9/454 9/352 11/506 15/333 11/425 10/499 % hồng cầu có chứa vi nhân 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,04 ± 0,04 2,63± 0,39** Chứng 3-MCPD 10 mg/kg 3-MCPD 100 mg/kg 3-MCPD 1 mg/kg 80 Hình 3.9. Vi nhân ở tế bào hồng cầu của các lô thí nghiệm sau 48 giờ phơi nhiễm 3- MCPD (x 1000) Bảng 3.14. Số lượng vi nhân quan sát trong một thị trường ở các lô thí nghiệm sau khi phơi nhiễm 3-MCPD trong 72 giờ Lô Chứng (n = 6) 3-MCPD 1 mg/kg (n = 6) 3-MCPD 10 mg/kg (n = 6) 3-MCPD 100 mg/kg (n = 6) Số hồng cầu có vi nhân/tổng số hồng cầu trên thị trường 0/384 1/426 0/351 0/405 1/374 0/398 1/369 0/384 0/306 0/260 1/405 0/358 0/319 2/496 2/475 0/325 3/337 0/511 13/220 17/512 62/500 31/517 10/460 Tử vong % hồng cầu có chứa vi nhân 0,08 ± 0,05 0,09 ± 0,05 0,29 ± 0,15 5,96 ± 1,77* *P < 0,05 so với lô chứng (phép kiểm Chi bình phương) 3-MCPD