Luận án Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh và tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc - xin phòng bệnh cho cá mú (Epinephelus spp.) - Nguyễn Thị Thanh

ở các độ phóng đại khác nhau để chẩn đoán biến đổi cấu trúc mô gan tuỵ và sự hiện diện của các loại mầm bệnh trong mô. 2.3.1.3. Phương pháp phân lập vi rút bằng kỹ thuật nuôi cấy trên tế bào Dùng phương pháp Q.W.Qin và cs (2006) [55]. Trước khi sử dụng, tế bào GS1 được hoạt hóa với môi trường Leibovitz’s (LB) có bổ sung 10% huyết thanh bào thai bê (FCS) cho tới khi tế bào mọc thành lớp ở đáy chai với độ bao phủ khoảng 90%. Loại bỏ môi trường trong chai nuôi cấy trước khi lây nhiễm dịch mẫu. Cố định mẫu Thẩm thấu Đúc khuôn Cắt mẫu Nhuộm mẫu Đọc tiêu bản mẫu Kết luận Mẫu bệnh 40 Mẫu bệnh phẩm được lây nhiễm trên tế bào GS1. Hút 1ml dịch mẫu để láng hết trên toàn bộ bề mặt tế bào của chai nuôi 75 cm2. Ủ chai nuôi từ 1 đến 2 giờ ở 27oC, bổ sung thêm môi trường LB chứa 10% FCS. Mẫu đối chứng chỉ có tế bào GS1 và môi trường LB chứa 10% FCS. Tế bào được nuôi ở nhiệt độ 27oC, 5% CO2 và bắt đầu theo dõi CPE mỗi ngày. Khi CPE đạt khoảng 90 - 95% thì thu dịch vi rút, ly tâm thu dịch nổi có chứa vi rút ở 10000 vòng/phút trong 30 phút. Dịch vi rút được bảo quản ở -18oC. 2.3.1.4 Phương pháp tách chiết RNA tổng số Tách chiết RNA tổng số từ mẫu tế bào nhiễm VNN bằng Kit RNeasy Qiagen của hãng Qiagen, Mỹ. 1. Cho 250 µl dịch tế bào + 100 µl RNase-free water + 350 µl RLT buffer (chứa guanidine thiocyanate) vào ống eppendorf 1,5 ml, vortex trong 5 phút. 2. Bổ sung 250 µl ethanol (96-100%), đảo trộn nhẹ bằng pipet. 3. Hút 700 µl sang cột tách silicagel, đậy nắp, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15 giây ở 4˚C, thu cột rồi đổ dịch. 4. Bổ sung 500 µl dung dịch RPE pha loãng với ethanol (tỉ lệ 1:4) vào cột tách, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15 giây ở 4 ºC (rửa cột để loại bỏ tạp chất), thu cột rồi đổ dịch. 5. Bổ sung 500 µl RPE buffer pha loãng với ethanol (tỉ lệ 1:4) vào cột tách, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 2 phút ở 4˚C. Thu cột bỏ tube dưới. 6. Chuyển cột sang tube mới, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 1 phút, thu cột tách và bỏ tube. 7. Chuyển cột sang eppendorf 1,5ml có nắp. Bổ sung 30µl RNase-free water, đóng nắp ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút, thu được RNA tinh sạch. 8. Điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. 41 2.3.1.5 Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) (Thực hiện theo kít RT-PCR one step của hãng Qiagen, Mỹ) Phản ứng RT-PCR là phản ứng khuếch đại một đoạn khuôn mẫu RNA theo nguyên lý của PCR. Đối với NNV, kỹ thuật RT-PCR bao gồm 2 giai đoạn: giai đoạn phiên mã ngược từ mạch khuôn RNA của NNV để tạo cDNA và giai đoạn khuếch đại đoạn cDNA tạo nên số bản sao cần thiết. 2.3.1.6 Điện di axit nucleic trên gel agarose Dùng phương pháp của Sambrook J và Russel DW (2001) [61]. Lấy một thể tích mẫu (chứa khoảng 1-2 μg DNA), trộn với loading sau đó tra vào các giếng của gel. Chạy điện di ở hiệu điện thế 110 V, thời gian 20-30 phút. Lấy bản gel tráng rồi quan sát và chụp ảnh dưới ánh sáng tia tử ngoại có bước sóng λ=260 nm. 2.3.1.7 Phương pháp tách dòng gen: Dùng phương pháp của Sambrook J và Russel DW (2001) [61] * Phương pháp tinh sạch DNA không sử dụng gel agarose. - Trộn đều hỗn hợp: sản phẩm RT-PCR, Sodium acetate 3M (lượng 20% so với lượng sản phẩm RT-PCR), isopropanol (lượng bằng 80-100% so với lượng sản phẩm RT-PCR). Đặt tube chứa hỗn hợp trên ở -20oC trong 25 phút. Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 30 phút, thu cặn (sản phẩm RT-PCR kết tủa). Rửa với ethanol 70%, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút, thu cặn. Khi cồn khô hết thì hòa sản phẩm vào 50 µl H2O, bảo quản ở -20 o C. * Phương pháp tạo plasmid tái tổ hợp mang gen T4. - Phân cắt plasmid pGEM-T bằng enzyme giới hạn Thành phần phản ứng bao gồm: H2O (2 μl): đệm cho EcoRI hoạt động (1 μl): EcoRI (1 μl): pGEMT (6 μl). Ủ ở 37oC từ 2,5 đến 3 giờ. Điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra kết quả. - Ghép nối gen T4 vào pGEM-T: Hỗn hợp phản ứng bao gồm các thành phần: H2O (6 μl): T4 DNA (1 μl): pGEM-T Easy (1 μl): Ligate Buffer 42 (1 μl): T4 Ligase (1 μl). Thực hiện phản ứng trong tube đã thanh trùng, ủ tube ở 160C trong 14 giờ. Sau đó bảo quản ở 40C. * Phương pháp chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli Dùng phương pháp của Sambrook J và Russel DW (2001) [61] a) Chuẩn bị tế bào khả biến với tế bào chủ là E. coliJM109 . - Chủng vi khuẩn E. coliJM109 được cấy ria trên môi trường LB đặc và nuôi qua đêm ở 370C. Lấy một khuẩn lạc đơn vào 20ml môi trường LB lỏng, lắc qua đêm ở 370C, 200 lần/phút. - Chuyển 1ml dịch nuôi trên sang 50 ml môi trường LB lỏng, lắc tiếp khoảng 3h đến khi OD600nm đạt 0,4 - 0,6 thì chuyển dịch nuôi cấy sang ống ly tâm đã giữ lạnh trên đá 15 phút. Ly tâm 4000 vòng/phút, ở 40C trong 10 phút rồi bỏ dịch nổi và thu sinh khối vi khuẩn. - Hòa sinh khối tế bào với 20 ml nước cất đã vô trùng để lạnh (hòa tan thật nhẹ nhàng bằng pipette). Sau đó ly tâm 3500 vòng/phút trong 10 phút ở 4 0C. Loại bỏ dịch nổi thu sinh khối tế bào. - Hòa sinh khối tế bào với 15 ml CaCl2 0,1 M đã thanh trùng để lạnh, hòa nhẹ nhàng, để trên đá lạnh khoảng 2 đến 5 phút. Sau đó ly tâm 3000 vòng/ phút trong 10 phút ở 40C, loại bỏ dịch thu sinh khối tế bào. - Hòa tan tế bào vào 1 ml dung dịch CaCl2 0,1M có bổ sung 15% glycerol đã vô trùng để lạnh, để trên đá 30 phút. Sau đó đảo trộn nhẹ nhàng, chia ra các ống eppendorf mỗi ống 100 µl, bảo quản ở -80oC. b) Biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt. - Bổ sung 5 µl sản phẩm nối gen vào ống tế bào khả biến và để 30 phút trên đá lạnh. - Sốc nhiệt 420C trong 45 giây, giữ trên đá 3 phút. Sau đó bổ sung 500 µl môi trường LB lỏng và nuôi lắc ở 370C trong 1 giờ. c) Chọn lọc tế bào mang plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp sàng lọc xanh - trắng. 43 - Cấy trang 100 μl hỗn hợp biến nạp trên môi trường LB rắn có bổ sung Ampicillin (100 µg/ml), X-gal, IPTG. Nuôi trong tủ ấm 370C thời gian từ 14 đến 16 giờ. - Toàn bộ khuẩn lạc phát triển trên môi trường có ampicillin đều là khuẩn lạc mang vector plasmid. Những khuẩn lạc xanh không có đoạn gen được xen vào. Lựa chọn khuẩn lạc trắng mang plasmid tái tổ hợp trên vi khuẩn E. coli * Phương pháp tách plasmid từ vi khuẩn E. coli Dùng phương pháp của Sambrook J và Russel DW (2001) [61] Vi khuẩn được nuôi trong môi trường LB đặc và nhân lên đến cuối giai đoạn log. Tế bào được phá vỡ bằng kiềm và các chất tẩy mạnh, plasmid được thu lại bằng cách tủa với ethanol. - Nuôi E. coli ở điều kiện 370C, lắc 200 vòng/phút qua đêm. - Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 6 phút, 4 oC. Loại bỏ dịch thu sinh khối tế bào. - Hòa tan tế bào trong 200 µl Solution I, hòa tan nhẹ nhàng bằng pipette. - Bổ sung 400 µl Solution II, đảo thật nhẹ nhàng. - Bổ sung 200 µl Solution III đảo nhẹ nhàng đến khi xuất hiện kết tủa, để yên khoảng 2 đến 3 phút. Sau đó ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút, 4 o C, hút 500 µL dịch nổi vào eppendorf mới. - Bổ sung 500 µl isopropanol vào eppendort chứa dịch, ly tâm 10.000 vòng/phút, 4 oC. Loại bỏ dịch thu cặn chính là DNA kết tủa. - Bổ sung 1ml ethanol 70% vào eppendort chứa cặn, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút, 4 oC, bỏ dịch thu cặn, thực hiện 2 lần liên tục như thế. - Khi cồn khô hết, bổ sung H2O để hòa tan DNA và bảo quản ở -20 0 C. Sản phẩm tách được kiểm tra trên gel agarose 0,8%. 44 * Phương pháp kiểm tra plasmid tái tổ hợp. Các dòng mang vector tái tổ hợp sau khi được xác định sẽ được kiểm tra bằng enzyme giới hạn và phản ứng PCR. a) Phản ứng PCR master mix. - Thành phần: Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (µl) Master mix 2X 25 H2O - 22 Primer 1 0,5 Primer 2 0,5 Plasmid tái tổ hợp 2 Tổng số 50 - Chu kỳ nhiệt của phản ứng: 94oC trong 7 phút, 94oC trong 45 giây, 60 o C trong 45 giây, 72 oC trong 50 giây; lặp lại chu kỳ trên 30 lần; 72oC trong 5 phút cho kết thúc ở vòng cuối cùng. b) Cắt plasmid bằng enzyme giới hạn.  Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme EcoRI Phản ứng cắt bằng EcoRI để kiểm tra sự có mặt của T4. Thành phần phản ứng gồm: H2O (2 μl): đệm cho EcoRI hoạt động (1 μl): EcoRI (1 μl): pGEM-T (6 μl). Ủ ở 37oC từ 2,5 đến 3 giờ. Điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra kết quả. * Phương pháp tinh sạch DNA bằng gel agarose. Plasmid tái tổ hợp sau phản ứng cắt bởi enzym giới hạn được tiến hành tinh sạch theo PureLink® Quick Gel Extraction Kit có trong bộ TOPO® TA Cloning Kit của hãng Invitrogen: 1. Cắt phần gel agarose có chứa đoạn DNA mong muốn. 2. Cân lát gel rồi hòa tan với dịch đệm (GS1) có trong bộ kit với tỉ lệ 10: 60 (mg/ µl) trong ống vô trùng 5ml. 45 3. Ủ ở 50°C trong 15 phút, cứ 3 phút lại lắc đều để gel agarose tan chảy hết. 4. Làm tan gel với dung dịch đệm TE ở 65°C- 75°C. 5. Hút 400 µl hỗn hợp dịch agarose vào cột lọc. 6. Bổ sung 500 µl Gel Solubilization Buffer vào cột, trộn đều rồi ủ ở nhiệt độ phòng, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch phía dưới. 7. Bổ sung 700 µl washing buffer vào cột và ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. 8. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong vòng 1 phút, đổ bỏ dịch, chuyển cột tinh sạch sang eppendorf 1,5 ml. 9. Bổ sung 50 µl TE buffer vào cột, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. 10. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 2 phút, loại bỏ cột tinh sạch, thu các eppendorf chứa DNA tinh sạch, bảo quản ở -20°C * Phương pháp giải trình tự gen bằng máy tự động Gen T4 trên gel được tinh sạch và xác định trình tự bằng máy giải trình tự gen tự động ABI 3100 (Applied Biosystems). Quy trình được thực hiện theo bộ Kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing. Sử dụng phần mềm Blast để xác định mức độ tương đồng của trình tự gen T4 thu được với các trình tự của GenBank. 2.3.2. Phương pháp xác định đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh (NNV) 2.3.2.1. Phương pháp xác định độc lực của vi rút trên tế bào GS1 - Độc lực của vi rút được xác định bằng phương pháp chuẩn độ trên đĩa nhựa 96 giếng. Trước khi chuẩn độ 1 ngày, đĩa nhựa 96 giếng được cấy mỗi giếng khoảng 7x104 tế bào GS1. Dịch vi rút được tiến hành pha loãng từ 10-1 đến 10 -9 với môi trường Leibovitz’s 15 (10% FCS). - Mỗi độ pha loãng cấy vào 4 giếng, mỗi giếng cấy 0,1 ml dịch vi rút. Giữ khay đã cấy ở nhiệt độ 28oC để vi rút hấp phụ lên tế bào. Sau 2 giờ, hút 46 hết dịch trong các giếng và chuyển vào mỗi giếng 0.5 ml môi trường Leibovitz’s 15 (10% FCS). Bọc khay lại và để ở nhiệt độ 28oC trong tủ ấm CO2 0,5%. - Quan sát và đếm số giếng có CPE trong 5 ngày. Khả năng gây bệnh của vi rút trên tế bào GS1 được đánh giá qua chỉ số TCID50 (nồng độ gây chết 50% tế bào). Áp dụng phương pháp chuẩn độ của Reed và Muench (1938) [57] để xác định TCID50 LgTCID50= lgA+ x1lgf LgTCID50= lgA+ x2lgf Trong đó: f là hệ số pha loãng A1: tỷ lệ cận trên có bệnh tích A: độ pha loãng với tỷ lệ cận trên có bệnh tích B1: tỷ lệ cận dưới có bệnh tích B: độ pha loãng với tỷ lệ cận dưới có bệnh tích 2.3.2.2. Phương pháp xác định độc lực của vi rút trên cá mú - Bố trí thí nghiệm: Từ kết quả thí nghiệm xác định độc lực của vi rút trên tế bào, tiến hành lựa chọn một số chủng NNV có độc lực cao và độc lực thấp trên tế bào để thí nghiệm xác định độc lực của các chủng NNV trên cá mú. Dịch vi rút được pha loãng từ 10-1 đến 10-9, mỗi độ pha loãng vi rút tiêm 30 cá mú con có kích thước 1,5-2 cm, mỗi độ pha loãng lặp lại 3 lần. Liều tiêm dịch vi rút: 0,1 ml/con và tiêm vào dưới gốc vây đuôi. Lô đối chứng cá được tiêm nước muối sinh lý. Sau tiêm truyền, theo dõi cá sau 6 giờ đến 5 ngày để quan sát các biểu hiện lâm sàng, tỷ lệ chết, kiểm tra gen mã hóa kháng nguyên T4 của NNV. Khả năng gây bệnh của vi rút trên cá mú được đánh giá bằng liều gây chết 50% cá thí nghiệm: LD50 (Lethal Dose). LD50 được tính dựa theo phương pháp của Reed và Muench (1938) [57]. 47 LgLD50 = αlgb + lgc Trong đó: b = Độ pha loãng của vi rút, trong thí nghiệm này b = 1/10 (10-1); c = Độ pha loãng vi rút gây tỉ lệ chết cận trên 50%. 2.3.2.3 Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm của vi rút trên tế bào GS1 Lựa chọn 1 chủng vi rút (QN4) có chỉ số TCID50 cao để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm của NNV trên tế bào GS1. Chủng NNV được gây nhiễm vào tế bào GS1 với mật độ tế bào ban đầu là 22x10 2 tế bào/mm2. Tế bào gây nhiễm NNV được nuôi cấy ở 4 ngưỡng nhiệt độ: 17, 22, 27 và 32oC, liều gây nhiễm là liều TCID50 = 10 -6,8 . Sau 5 ngày nuôi cấy tiến hành đánh giá CPE và xác định mật độ tế bào còn sống sót. Thí nghiệm được bố trí theo hình 2.2. Hình 2.2. Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm của vi rút trên tế bào 48 2.3.2.4. Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm của vi rút trên cá mú Thí nghiệm được trình bày ở hình 2.3. Hình 2.3. Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm của vi rút trên cá mú NNV chủng QN4 có liều LD50 cao (10 -7,5) được chọn để gây nhiễm vào cá mú con bằng phương pháp tiêm dưới gốc vây đuôi. Bố trí 3 bể nuôi cá thí nghiệm, mỗi bể tiêm 30 cá mú. Lô đối chứng cá được tiêm môi trường Leibovit’z 15. Cá được nuôi trong 2 điều kiện nhiệt độ là: 280C (cả ngày đêm) và 28 0 C (ban ngày)/24 0C (ban đêm). Theo dõi cá, xác định tỷ lệ chết và sự có mặt của gen T4 sau 15 ngày. 2.3.3. Nhóm các phương pháp biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên và đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp 2.3.3.1 Chuẩn bị vector pET32a+ để thực hiện phản ứng nối gen Vector pET32a + sẽ được cắt mở vòng bởi enzyme BamHI và EcoRI để có thể nhận đoạn gen T4. Phản ứng cắt được thực hiện với thành phần: H2O (7,6 μl): Buffer (1μl): EcoRI (0,4 μl): pET32a+ (1 μl). Ủ ống phản ứng ở 37oC trong 3 giờ. 49 2.3.3.2 Nối gen T4 vào vector pET32a+ Phản ứng được thực hiện với thành phần như sau: H2O (6 μl): T4 DNA (1 μl): vector pET32a+(1 μl): Ligate Buffer (1 μl): T4 Ligate (1 μl). Ủ ống phản ứng ở 4oC từ 14 đến 16 giờ. 2.3.3.3 Chuyển gen vào E. coliJM109 Sử dụng phương pháp sốc nhiệt để đưa vector tái tổ hợp mang gen T4 (pET32a + -T4) vào tế bào vi khuẩn E. coli. Các bước thực hiện như sau: Lấy 1 khuẩn lạc E. coliJM109 nuôi trong 20 ml LB lỏng ở điều kiện 37 0C, lắc 200 vòng/phút, qua đêm. Lấy 0,5 ml canh trường E. coli chuyển sang bình 50 ml LB, nuôi ở điều kiện 370C, lắc 200 vòng/phút, từ 1 đến 3 giờ đến khi đạt OD từ 0.4 đến 0.6. Chuyển sang ống ly tâm 50 ml để trên đá 30 phút. Sau đó ly tâm 4.000 vòng/phút/4 0C trong 10 phút. Bỏ dịch nổi và thu sinh khối vi khuẩn. Hòa sinh khối tế bào với 20 ml nước cất đã vô trùng để lạnh. Sau đó ly tâm 3500 vòng/phút/4 0C trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi thu sinh khối tế bào. Hòa sinh khối tế bào với 15 ml CaCl2 0.1 M đã thanh trùng để trên đá khoảng 2 đến 5 phút. Sau đó ly tâm 3000 vòng/phút/40C trong 10 phút, loại bỏ dịch thu sinh khối tế bào. Hòa tan tế bào trong 1 ml dung dịch (CaCl2 0,1 M có bổ sung 15% glycerol) đã vô trùng để lạnh trên đá 30 phút. Sau đó đảo trộn, chia ra các ống eppendorf, mỗi ống 100 µl, bảo quản ở -200C. - Thực hiện chuyển gen: Trộn 4 µl sản phẩm nối gen vào ống tế bào E. coliJM109 khả biến, đảo trộn bằng pipette, ủ trên đá 30 phút, sốc nhiệt ở 42oC trong thời gian 1 phút. Lập tức chuyển sang ủ trên đá 10 phút. Bổ sung 600 µl LB lỏng, nuôi lắc 200 vòng/ phút ở 37oC trong thời gian 1 giờ. Sau đó cấy trang dịch tế bào lên môi trường LB rắn có bổ sung kháng sinh Ampicillin với nồng độ 100 µg/ml, nuôi ở 37oC trong thời gian từ 14 đến 16 giờ. 50 2.3.3.4. Tách chiết plasmid từ các khuẩn lạc sau biến nạp chuẩn bị cho kiểm tra bằng PCR và enzyme giới hạn. a, Tách chiết plasmid - Nuôi E. coli ở điều kiện 370C, lắc 200 vòng/phút với thời gian từ 14 đến 16 giờ. Sau đó ly tâm 10.000 vòng/phút/4oC trong 6 phút. Loại bỏ dịch thu sinh khối tế bào. - Hòa tan tế bào trong 200 µl Solution I, hòa tan nhẹ. - Bổ sung 400 µl Solution II, đảo nhẹ. - Bổ sung 200 µl Solution III đảo nhẹ đến khi xuất hiện kết tủa, để yên khoảng 2 đến 3 phút. Sau đó ly tâm 10.000 vòng/phút/4oC trong 10 phút, hút 500 µL dịch nổi vào eppendorf mới. - Bổ sung 500 µl isopropanol lạnh vào eppendort chứa dịch, đảo đều, để yên từ 1 đến 2 phút, ly tâm 10.000 vòng/phút/4oC. Loại bỏ dịch nổi, thu cặn (DNA kết tủa). - Bổ sung 1 ml ethanol 70% lạnh vào eppendort chứa cặn, ly tâm 10.000 vòng/phút/4 o C trong 10 phút, bỏ dịch nổi, thu cặn. Thực hiện 2 lần liên tục. - Đợi cồn bay hơi đến khô, bổ sung H2O de-ion để hòa tan DNA . - Bảo quản ở -200C. b, Kiểm tra bằng PCR và enzyme giới hạn - Kiểm tra bằng PCR: Phản ứng PCR sẽ khuếch đại đoạn gen T4 (nếu có) trong plasmid tách chiết được. Thành phần phản ứng được thực hiện như sau: STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Master mix 2x 25 2 H2O 22 3 Primer 1 0,5 4 Primer 2 0,5 5 DNA template 2 Tổng số 50 51 Chu trình nhiệt của phản ứng: 94oC trong 5 phút, 94 oC trong 30 giây, 60 o C trong 30 giây, 72 o C trong 30 giây; lặp lại chu kỳ trên 30 lần; 72 oC trong 5 phút và giữ ở 4 oC. Sản phẩm của phản ứng sẽ được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%.  Kiểm tra bằng enzyme giới hạn: Plasmid sau tách chiết được sử sụng làm nguyên liệu cho phản ứng cắt bằng các enzyme giới hạn BamHI và EcoRI để kiểm tra sự có mặt của đoạn gen T4 trong các plasmid. Phản ứng cắt được thực hiện với thành phần: H2O (7,6 μl): Buffer (1 μl): EcoRI (0,4 μl): DNA plasmid (1 μl). 2.3.3.5 Nuôi cấy E. coliBL21 mang plasmid tái tổ hợp pET32a+-T4 E. coliBL21 mang plasmid tái tổ hợp pET32a+-T4 được nuôi cấy hoạt hóa trong môi trường LB lỏng qua đêm ở 37oC, nuôi lắc 200 lần/phút. Theo hướng dẫn của hãng Novagen, điều kiện biểu hiện ban đầu được đưa ra là hoạt hóa vi khuẩn để OD đạt khoảng 0,6 – 0,8 thì cảm ứng bằng IPTG ở nồng độ 0,6 - 1 mM, nuôi lắc 37oC, sau 3 đến 4 giờ protein sẽ được biểu hiện. Protein tái tổ hợp sẽ được kiểm tra điện di SDS-PAGE và Western blot. 2.3.3.6 Phương pháp điện di SDS-PAGE Pha lớp Separating gel 10% (5 ml) với tỷ lệ như bảng sau Acrylamide stock solution 30% 1,67 ml Tris-HCl 1 M, pH 8.8 1,9 ml H2O 1,33 ml Trộn đều dung dịch của lớp gel separating sau đó hút và bơm dịch vào buồng gel tới khi mức gel cách mép trên bản thuỷ tinh 1,5 cm. - Phủ 1 lớp nước hoặc n-propanol lên trên bề mặt lớp gel vừa đổ, quá trình polymer hoá sẽ hoàn thành khoảng 1 giờ, đổ bỏ lớp nước phía trên. 52 - Tiếp tục pha gel Stacking 5% (2 ml) theo tỷ lệ như sau: Acrylamide stock solution 30% 330 µl Tris-HCl 1 M, pH 6.8 250 µl H2O 1,38 ml SDS 10% 20 µl AP 10% 20 µl TEMED 2 µl - Đổ tiếp lớp gel stacking lên trên cho tới khi đầy buồng gel, đặt lược tạo giếng. Quá trình polymer hoá gel khoảng 30 phút. Khi bản gel đã hoàn thành, toàn bộ bản gel được đặt trong buồng điện di có chứa dung dịch điện di và rút lược tạo giếng. - Nhỏ mẫu: Kháng nguyên sau khi đã pha loãng ở các nồng độ khác nhau, mỗi giếng nhỏ 15-20 µl kháng nguyên và 10 µl marker chuẩn. Mẫu trước khi nhỏ cần được biến tính ở 100oC trong 5 phút. - Chạy điện di ở hiệu điện thế 120 -180 V (thường là ở 150 V), đến khi màu thuốc nhuộm chạy đến chân bản gel tách. - Nhuộm bản gel bằng Coomassie blue R–250 0,1% (Methanol: glacial acetic acid: nước = 4:1:5) ở nhiệt độ phòng trong 30 phút và lắc. - Tẩy màu bằng dung dịch tẩy (Methanol: glacial acetic acid: nước = 1:1:8) lắc, thay dịch tẩy khoảng 2 – 3 lần đến khi thấy các vạch xuất hiện. Dựa vào kích thước kháng nguyên trên bản gel để bước đầu kiểm tra kháng nguyên tạo ra có phải là kháng nguyên T4 mong muốn hay không. 2.3.3.7. Phương pháp Western blot Phức hợp protein T4 đã có được sau tinh sạch, được phân tách bằng điện di gel SDS-PAGE, ủ gel trong transfer buffer trong 10 phút. - Cắt các mảnh giấy lọc và màng PVDF theo kích thước bản gel. Ủ các mảnh giấy lọc và miếng xốp trong dung dịch đệm 10 phút. Ủ màng PVDF trong methanol trong 1 phút. 53 - Xếp xen kẽ bản gel và màng PVDF giữa xốp và giấy theo thứ tự (cao su/giấy/gel/màng/giấy/cao su) và kẹp chặt lại cùng với nhau đảm bảo không có bọt khí lọt vào giữa gel và màng. - Chuyển protein từ gel SDS-PAGE lên màng PVDF bằng dòng điện 200 mA, ở 40oC trong 2 giờ. - Rửa màng PVDF 3 lần, mỗi lần khoảng 5 phút với TBS và cố định với 3% BSA trong 2 giờ - Ủ màng với T4 Antibody trong 3% BSA ở 40oC từ 14 đến 16 giờ. - Rửa màng PVDF 3 lần, mỗi lần khoảng 10 phút với TBST. - Ủ màng với HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG trong 3% BSA trong 2h. - Rửa màng PVDF 3 lần mỗi lần rửa khoảng 10 phút với TBST. - Sử dụng kit DAB để hiện màu. 2.3.3.8. Phương pháp đánh giá khả năng tạo kháng thể trung hòa của kháng nguyên tái tổ hợp a, Đánh giá khả năng tạo kháng thể trung hoà của kháng nguyên tái tổ hợp trên thỏ. Thí nghiệm được bố trí như sau: Thỏ thí nghiệm có khối lượng từ 1,8- 2 kg, thỏ khỏe sạch bệnh và được nuôi ổn định trong 1 tuần thì tiến hành gây miễn dịch bằng phương pháp tiêm. + Đối chứng dương: huyết thanh thỏ khỏe, sạch bệnh, không có kháng thể đặc hiệu với NNV được ủ với chủng NNV cường độc QN2 (hiệu giá vi rút là 10 4 TCID50) rồi hấp phụ vào tế bào GS1 hoặc gây nhiễm vào cá mú con (≤ 5 g) bằng phương pháp tiêm (liều 0,05 ml dịch NNV cường độc QN2 liều 103 LD50 ) + Đối chứng âm: huyết thanh thỏ khỏe, sạch bệnh được gây miễn dịch với vi khuẩn E.coliBL21- pET32a+- T4 và kháng nguyên tái tổ hợp được pha loãng theo hệ số 10 rồi hấp phụ vào tế bào GS1 (in vitro) hoặc gây nhiễm vào cá mú con khối lượng ≤ 5 g (in vivo) bằng phương pháp tiêm. 54 + Lô thí nghiệm: huyết thanh thỏ được gây miễn dịch với vi khuẩn E. coli BL21- pET32a + - T4 và kháng nguyên tái tổ hợp pha loãng theo hệ số 10 được ủ với chủng NNV cường độc QN2 (hiệu giá vi rút 104 TCID50 rồi hấp phụ vào tế bào GS1 hoặc gây nhiễm vào cá mú con (≤ 5 g) bằng phương pháp tiêm (liều 0,05 ml dịch NNV cường độc QN2 liều 103 LD50). Phản ứng trung hòa NNV được thực hiện trên tế bào GS1 theo hướng dẫn của Virology methods manual (Brian và cộng sự, 1996) [22]: Bước 1: Chuẩn bị tế bào Bước 2 : Chuẩn bị vi rút Bước 3: Trung hòa NNV cường độc với các loại huyết thanh ở 280C sau 12h. Bước 4 : Gây nhiễm trở lại dịch trung hòa vi rút lên tế bào GS1 Bước 5: Đánh giá kết quả - Âm tính: Nếu các giếng phản ứng không có biểu hiện bệnh tích tế bào; các bể nuôi cá thí nghiệm không có cá chết hoặc tỷ lệ chết nhỏ hơn 5%. - Dương tính: toàn bộ các giếng phản ứng có bệnh tích tế bào ở tất cả các độ pha loãng huyết thanh; các bể nuôi cá thí nghiệm có cá chết, tỷ lệ chết ≥ 50%. - Lô thí nghiệm: ở các giếng có độ pha loãng huyết thanh cao, tế bào phát triển tốt, không có tế bào chết. Ở các giếng có độ pha loãng huyết thanh thấp, có dấu hiệu bệnh tích tế bào đến hiện tượng tan bào. + Các mẫu cá thí nghiệm có thể có các kết quả như sau: Nếu cá thí nghiệm không chết hoặc tỷ lệ chết nhỏ hơn 5% có nghĩa dịch vi rút không gây chết cá, trong huyết thanh thỏ được gây miễn dịch với kháng nguyên E. coliBL21-pET32a + -T4 và protein T4 tái tổ hợp nên đã sinh kháng thể đặc hiệu để trung hòa được NNV cường độc. Nếu các mẫu cá thí nghiệm bị chết, tỷ lệ chết ≥ 50% có nghĩa dịch vi rút gây chết cá, trong huyết thanh thỏ được gây miễn dịch với kháng nguyên E. 55 coli BL21- pET32a + - T4 và protein T4 tái tổ hợp nhưng không sinh kháng thể đặc hiệu với NNV, vì vậy không trung hòa được NNV cường độc. Nếu các mẫu cá thí nghiệm có cá chết nhưng tỷ lệ chết nhỏ hơn 50% có nghĩa trong huyết thanh thỏ được gây miễn dịch với E. coliBL21-pET32a+-T4 và protein T4 tái tổ hợp nên đã sinh kháng thể đặc hiệu với NNV nhưng lượng kháng thể tạo ra chưa đủ để trung hòa được NNV cường độc. b, Đánh giá khả năng tạo kháng thể trung hoà của kháng nguyên tái tổ hợp trên cá mú. Thí nghiệm được bố trí như sau: Cá mú bột sạch bệnh được ấp nở tại Trung tâm giống Hải sản miền Bắc. Để kiểm tra đàn cá mú không bị nhiễm NNV, chúng tôi bắt ngẫu nhiên 5% đàn và kiểm tra cá bằng phản ứng RT-PCR. + Đối chứng dương: cá mú bột sạch bệnh được nghiền, đồng nhất cá, xử lý kháng sinh, lọc và pha loãng theo hệ số 10 rồi ủ với chủng NNV QN2 với hiệu giá vi rút 104 TCID50 và gây nhiễm vào tế bào GS1. + Đối chứng âm: cá mú bột sạch bệnh được gây miễn dịch với kháng nguyên E. coli BL21-pET32a + - T4 và protein T4 tái tổ hợp với 2 liều, mỗi liều 0,2 mg, liều nhắc lại sau 15 ngày. Tiếp tục nuôi, theo dõi cá trong 90 ngày. Định kỳ 15 ngày tiến hành thu mẫu, nghiền, đồng nhất cá, xử lý kháng sinh, lọc, pha loãng theo hệ số 10 rồi gây nhiễm vào tế bào GS1. + Lô thí nghiệm: cá mú bột sạch bệnh được gây miễn dịch với kháng nguyên E. coliBL21-pET32a + -T4 và protein T4 tái tổ hợp với 2 liều, mỗi liều 0,2 mg, liều nhắc lại sau 15 ngày. Tiếp tục nuôi, theo dõi cá trong 90 ngày. Định kỳ thu mẫu, nghiền, đồng nhất cá, xử lý kháng sinh, lọc, pha loãng theo hệ số 10 rồi ủ với chủng cường độc NNV QN2 hiệu giá vi rút 104 TCID50 và gây nhiễm vào tế bào GS1. CPE được đánh