Luận án Nghiên cứu một số dạng bất thường nhiễm sắc thể y ở nam giới khám vô sinh tại bệnh viện phụ sản thành phố Cần Thơ

n như ở nam giới bình thường. Qua đó, chúng tôi kết luận trường hợp này mắc hội chứng Klinefelter. Kết quả QF-PCR và lâm sàng của trường hợp này được trình bày ở Hình 4.7. 69 Hình 4.7. Kết quả QF-PCR và lâm sàng của nam giới mắc hội chứng Klinefelter mẫu 97. Kết quả kiểm định bằng phương pháp nuôi cấy bạch cầu lympho máu ngoại vi cũng cho thấy nam giới tăng 1 nhiễm sắc thể X, công thức nhiễm sắc thể là 47,XXY, giống với kết quả QF-PCR trong nghiên cứu (Hình 4.8, Phụ lục G). Hình 4.8. Nam giới mắc hội chứng Klinefelter có công thức nhiễm sắc thể 47,XXY được xác định bằng kỹ thuật nuôi cấy bạch cầu lympho máu ngoại vi. 70 Ngoài ra, luận án chọn ngẫu nhiên 3 mẫu ADN (1 mẫu ADN không có bất thường nhiễm sắc thể Y, 1 mẫu ADN bị mất đoạn hoàn toàn AZFbc và 1 mẫu ADN bị mất đoạn hoàn toàn AZFc) gửi đi kiểm định tại Phòng xét nghiệm kỹ thuật cao ISOLABO bằng kit của Devyser. Kit này sử dụng 8 chỉ dấu di truyền là sY14 (SRY), ZFXY, sY84, sY86, sY127, sY134, sY254 và sY255 để phát hiện đoạn AZFa, AZFb và AZFc trên nhiễm sắc thể Y. Kết quả xét nghiệm QF-PCR tại lab ISOLABO cũng ghi nhận 1 trường hợp không có bất thường nhiễm sắc thể Y, 1 trường hợp mất hoàn toàn đoạn AZFc và 1 trường hợp mất hoàn toàn đoạn AZFbc, hoàn toàn giống với kết quả nghiên cứu. Mẫu ADN nam giới bình thường có kết quả QF-PCR xác định bằng kit của Devyser như sau: sY255 xuất hiện peak ở 122 bp, sY127 (272 bp), sY134 (302 bp), sY86 (316 bp), sY84 (327), sY254 (375 bp), ZFYX (432 bp) và sY14 (464 bp) (Hình 4.9). Mẫu ADN mất hoàn toàn đoạn AZFc, kết quả không thấy xuất hiện peak tại sY254 và sY255. Tương tự, kết quả không có peak sY127, sY134, sY254 và sY255 ở trường hợp mẫu ADN mất hoàn toàn đoạn AZFbc. Kết quả kiểm định 3 mẫu ADN được trình bày ở Phụ lục G. Hình 4.9. Kết quả kiểm định mẫu ADN nam giới không có mất đoạn AZF bằng kỹ thuật QF-PCR theo kit của Devyser. Bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào bạch cầu lympho máu ngoại vi và xét nghiệm mất đoạn AZF bằng kit của Devyser cho kết quả giống với kết quả QF-PCR của luận án. Như vậy, quy trình xét nghiệm QF-PCR với 14 chỉ dấu di truyền áp dụng trong chẩn đoán một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y có độ tin cậy và độ chính xác rất cao. 4.1.2.4. Giải trình tự để xác định sự đa hình về chiều dài của sản phẩm PCR huỳnh quang được khuếch đại bằng chỉ dấu di truyền sY1291 Kết quả nghiên cứu ghi nhận các sản phẩm PCR huỳnh quang khuếch đại bằng cặp mồi của chỉ dấu di truyền sY1291 có kích thước 507 bp, 512 bp, 523 bp và 527 bp, khác biệt nhiều so với kích thước sản phẩm PCR công bố trên NCBI (Phiên bản GRCh38.p7) là 527 bp. Để khẳng định kết quả của kỹ thuật QF-PCR, nghiên cứu sử dụng kỹ thuật giải trình tự với trình tự cặp mồi của chỉ dấu di truyền sY1291. Cặp mồi này không đánh dấu huỳnh quang. 71 Đoạn mồi xuôi do công ty Macrogen, Hàn Quốc cung cấp. Đoạn mồi ngược sử dụng trình tự đã đặt của Applied System, Mỹ (đã sử dụng trong quy trình QF- PCR). Khi blast cặp mồi của sY1291 trên NCBI (Phiên bản GRCh38.p7), bên cạnh đoạn gen 527 bp (23.358.932-23.359.449 bp) của nhiễm sắc thể Y được khuếch đại còn xuất hiện nhiều sản phẩm PCR của các nhiễm sắc thể khác với nhiều kích thước khác nhau. Theo lý thuyết, để giải trình tự phải sử dụng phương pháp cắt gel agarose (đoạn ADN có kích thước 527 bp). Trong điều kiện tiến hành giải trình tự ở Khoa Xét nghiệm – Di truyền học của Bệnh viện Phụ sản Thành phố Cần Thơ, nghiên cứu không có đủ phương tiện để tiến hành giải trình tự theo phương pháp này. Do đó, nghiên cứu đã tối ưu phản ứng với mong muốn là khi điện di sản phẩm PCR chỉ nhận được một đoạn gen duy nhất được khuếch đại. Trong quá trình thực nghiệm, nghiên cứu đã thành công quy trình tối ưu phản ứng PCR với cặp mồi của chỉ dấu di truyền sY1291, sản phẩm PCR cũng chỉ xuất hiện một băng khi điện di trên gel agarose. Kết quả điện di ở line 4-7 trên Hình 4.10 được thực hiện trên 2 mẫu ADN có ký hiệu 100 và 207; trong đó mẫu 100 và 207 có sản phẩm đoạn gen khuếch đại bằng cặp mồi của sY1291 tương ứng là 527 bp và 507 bp. Hình 4.10. Kết quả điện di gel agarose của 2 mẫu ADN 100 và 207 bằng cặp mồi của sY1291 và LAPT (M: thang chuẩn). Trong quá trình tối ưu phản ứng PCR cho chỉ dấu di truyền sY1291, nghiên cứu đã thiết kế thêm một cặp mồi nằm trong đoạn sY1291 và đặt tên là LAPT. Cặp mồi LAPT được thiết kế có ưu điểm khác với sY1291 là chỉ cho một sản phẩm PCR duy nhất khi blast trên ngân hàng cơ sở dữ liệu NCBI. Trình tự mồi LAPT được gửi cho Công ty Trách nhiệm hữu hạn Phù Sa, Việt Nam và Công ty Macrogen, Hàn Quốc tổng hợp. Đặc điểm của cặp mồi này là chỉ xuất hiện một sản phẩm PCR duy nhất có kích thước 288 bp (23.358.930- 23.359.217 bp) (NCBI, Phiên bản GRCh38.p7). Kết quả điện di gel agarose sản phẩm PCR khuếch đại bằng cặp mồi LAPT của 2 công ty cung cấp đều 72 xuất hiện 1 băng duy nhất, phù hợp với kết quả trên ngân hàng cơ sở dữ liệu NCBI (Hình 4.10 và Hình 4.11). Hình 4.11. Kết quả điện di gel agarose sản phẩm PCR 8 mẫu ADN được khuếch đại bằng cặp mồi LAPT từ line 1-9, trong đó line 7 là thang chuẩn. Như vậy, luận án giải trình tự sản phẩm PCR khuếch đại bằng 2 cặp mồi của chỉ dấu di truyền sY1291 và LAPT. Việc giải trình tự đoạn ADN bằng cặp mồi của chỉ dấu di truyền sY1291 để kiểm định kết quả trong quy trình kỹ thuật QF-PCR đã tối ưu. Chúng tôi đã thực hiện giải trình tự đoạn gen được khuếch đại bằng cặp mồi của sY1291 lặp đi lặp lại 10 lần trong 1 tháng, kết quả đều ghi nhận trình tự nucleotid của mẫu tương đồng khoảng 400 bp so với trình tự nucleotid tham khảo (tương đồng khoảng 77%) (Hình 4.12A, B). Hình 4.12A. Độ tương đồng giữa trình tự nucleotid tham khảo (REF) và trình tự nucleotid của mẫu (SA100) với kích thước đoạn gen khuếch đại là 527 bp (Bioedit). 73 Hình 4.12B. Độ tương đồng giữa trình tự nucleotid tham khảo (REF) và trình tự nucleotid của mẫu (SA207) với kích thước đoạn gen khuếch đại là 507 bp (Bioedit). Sự tương đồng trình tự nucleotid chỉ đạt được khoảng 77% là do tất cả các mẫu đều ghi nhận trên cả 2 đoạn ADN được khuếch đại bằng mồi xuôi hay mồi ngược đều bắt đầu xuất hiện trình tự nhiễu sau trình tự lặp đơn nucleotid T (Hình 4.13A, B, C, D). 74 Hình 4.13A. Kết quả giải trình tự đoạn mồi xuôi của đoạn gen được khuếch đại bằng sY1291 có kích thước 527 bp (Sequencing software 6). Hình 4.13B. Kết quả giải trình tự đoạn mồi ngược của đoạn gen được khuếch đại bằng sY1291 có kích thước 527 bp (Sequencing software 6). Hình 4.13C. Kết quả giải trình tự đoạn mồi xuôi của đoạn gen được khuếch đại bằng sY1291 có kích thước 507 bp (Sequencing software 6). Hình 4.13D. Kết quả giải trình tự đoạn mồi ngược của đoạn gen được khuếch đại bằng sY1291 có kích thước 507 bp (Sequencing software 6). Blast cặp mồi của sY1291 trên NCBI (Phiên bản GRCh38.p7) cho thấy trình tự nucleotid của đoạn gen được khuếch đại được thể hiện ở Hình 4.14. 75 Hình 4.14. Trình tự nucleotid của đoạn gen dài 527 bp được khuếch đại bằng cặp mồi của sY1291 (NCBI, Phiên bản GRCh38.p7). Trên Hình 4.14 thể hiện đoạn gen này có đặc điểm là đoạn lặp đơn nucleotid T. Các trình lặp đơn nucleotid là đoạn trình tự lặp lại 1 loại nucleotid nào đó và chúng được tìm thấy rất nhiều ở động vật có xương sống, thường là lặp 6 nucleotid và ở đoạn gen được khuếch đại bằng cặp mồi của chỉ dấu di truyền sY1291 có trình tự lặp nucleotid T 39 lần (T39). Các đoạn trình tự lặp đơn nucleotid có đặc điểm là dễ bị đột biến, số lần lặp càng nhiều thì nguy cơ bất thường càng tăng và đa hình về trình tự nucleotid cũng có liên quan đến sự biểu hiện kiểu hình khác nhau (Montgomery et al., 2013; Sawaya et al., 2013; Kim et al., 2013; Ananda et al., 2014). Theo y văn cho thấy đoạn ADN có chứa trình tự lặp đơn nucleotid dài trong phản ứng PCR sẽ làm cho enzym polymerase khi tổng hợp sợi mới sẽ tự thêm vào hoặc làm mất đi loại nucleotid lặp ở đoạn đó và làm nhiễu trình tự ở sau đoạn lặp đơn nucleotid (Jinks-Robertson, 2002). Đoạn gen trong luận án chứa đoạn lặp đơn nucleotid T (T39); do đó, tín hiệu bị nhiễu và không thấy được trình tự các nucleotid ở sau đó và số lần lặp lại của nucleotid cũng khó mà xác định chính xác là phù hợp với y văn. Bên cạnh đó, kết quả bị nhiễu tín hiệu từ sau trình tự lặp nucleotid T trở về sau cũng phù hợp với nghiên cứu của Evguenia et al. (2016) và nhiều nghiên cứu khác. Cho đến nay, việc giải trình tự những đoạn gen chứa trình tự lặp đơn nucleotid trên máy giải trình tự thế hệ mới vẫn còn gặp nhiều khó khăn (Walker et al., 2016). Luận án giải trình tự 4 mẫu ADN có ký hiệu là 207, 122, 327 và 100 trên cả 2 mạch ADN. Kích thước đa hình về chiều dài của đoạn gen được khuếch đại bằng sY1291 của 4 mẫu trên tương ứng là 507 bp, 512 bp, 523 bp và 527 bp. Kết quả giải trình tự đoạn gen khuếch đại bằng cặp mồi của chỉ dấu di truyền LAPT cũng ghi nhận hiện tượng nhiễu sau trình tự lặp đơn nucleotid T ở 4 mẫu (Hình 4.15A, B, C, D). 76 Hình 4.15A. Kết quả giải trình tự đoạn mồi ngược của đoạn gen được khuếch đại bằng LAPT mẫu 207 (Bioedit). Hình 4.15B. Kết quả giải trình tự đoạn mồi ngược của đoạn gen được khuếch đại bằng LAPT mẫu 122 (Bioedit). Hình 4.15C. Kết quả giải trình tự đoạn mồi ngược của đoạn gen được khuếch đại bằng LAPT mẫu 327 (Bioedit). Hình 4.15D. Kết quả giải trình tự đoạn mồi ngược của đoạn gen được khuếch đại bằng LAPT mẫu 100 (Bioedit). Bên cạnh đó, trên Hình 4.15 cũng cho thấy sau đoạn lặp đơn nucleotid có hiện tượng bị nhiễu các nucleotid. Kết quả nghiên cứu phù hợp với việc giải trình tự chứa đoạn trình tự lặp đơn nucleotid hiện nay. Cho đến nay, đây là một trong những khó khăn còn gặp phải khi giải trình tự đoạn gen chứa đoạn lặp đơn nucleotid. Qua đó thấy rằng trên đoạn ADN chứa trình tự lặp đơn nucleotid sẽ khó xác định chính xác số lần lặp nucleotid và trình tự nucleotid sau đoạn lặp là phù hợp với y văn. Cần có nhiều nghiên cứu hơn để có thể khắc phục hiện tượng này. 77 Qua kết quả giải trình tự cho thấy kết quả QF-PCR thể hiện sự đa hình về chiều dài sản phẩm PCR huỳnh quang được khuếch đại bằng cặp mồi của chỉ dấu di truyền sY1291 với kích thước 507 bp, 512 bp, 523 bp và 527 bp là chính xác. Như vậy, sự khác nhau về số lần lặp đơn nucleotid T sẽ làm cho kích thước sản phẩm PCR huỳnh quang của sY1291 có sự đa hình về kích thước sản phẩm PCR. Sự đa hình đoạn gen này có thể thay đổi tùy theo địa lý và chủng tộc. Trên những cơ sở đó, cho thấy kit với 14 chỉ dấu di truyền và quy trình kỹ thuật QF-PCR đã xây dựng và tối ưu dùng để phát hiện một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y có độ chính xác cao và đáng tin cậy. 4.2. Xác định tỷ lệ một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch bằng quy trình kỹ thuật QF-PCR đã được xây dựng và kiểm định. Kết quả nghiên cứu ghi nhận tỷ lệ bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch là 35,1% (113/322 trường hợp) (Hình 4.16). Hình 4.16. Tỷ lệ bất thường nhiễm sắc thể Y của đối tượng nghiên cứu Kết quả tỷ lệ bất thường nhiễm sắc thể Y trong nghiên cứu cao hơn so với một số nghiên cứu trong và ngoài nước. Nghiên cứu của Kosar et al. (2010) trên 115 nam giới khám vô sinh có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch ở Thổ Nhĩ Kỳ cho thấy tỷ lệ vô sinh do di truyền là 4,34% (Bảng 4.6). 78 Bảng 4.6. Tỷ lệ nam giới khám vô sinh có bất thường nhiễm sắc thể Y ở nhóm nam giới vô tinh và thiểu tinh nặng Tác giả Vùng/Nước Số lượng mẫu Tần số Tỷ lệ (%) Vô tinh Thiểu tinh nặng Tần số Tỷ lệ (%) Tần số Tỷ lệ (%) Ng et al. (2009) Hong Kong 295 44/295 14,9 21/71 29,57 23/224 10,26 Kosar et al. (2010) Thổ Nhĩ Kỳ 115 5/115 4,34 5/92 5,43 0/23 0 Mafra et al. (2011) Brazil 143 27/143 18,8 11/43 25,4 16/100 16 Cavkaytar et al. (2012) Thổ Nhĩ Kỳ 332 48/332 14,4 43/196 21,93 5/136 3,67 Fu et al. (2012) Chengdu, Trung Quốc 1333 298/1333 22,35 250/945 26,45 48/388 12,37 Zhang et al. (2012) Đông bắc Trung Quốc 135 19/135 14,07 14/81 17,28 5/54 9,26 Ambulkar et al. (2013) Ấn Độ 58 8/58 13,8 5/26 19,23 3/32 9,37 Choi et al. (2013) Hàn Quốc 289 110/289 38 83/213 38,96 27/76 35,52 Naasse et al. (2015) Morocco 573 60/573 10,47 58/444 13,06 2/129 1,55 Nguyễn Đức Nhự (2015) Miền Bắc Việt Nam 469 106/469 23,1 83/354 23,44 23/115 20 Nghiên cứu này Tây Nam Bộ Việt Nam 322 113/322 35,1 34/93 36,6 79/229 34,5 79 Một nghiên cứu khác cũng được tiến hành ở Thổ Nhĩ Kỳ của Cavkaytar et al. (2012) trên 332 nam giới cho thấy tỷ lệ nam giới vô sinh do di truyền là 14,4%, cao hơn so với nghiên cứu của Kosar et al. (2010). Năm 2012, nghiên cứu tại Trung Quốc của Fu et al. trên 1333 nam giới vô sinh (945 nam giới vô tinh và 388 nam giới thiểu tinh nặng) cho thấy tỷ lệ nam giới vô sinh có bất thường nhiễm sắc thể Y là 22,35% (298/1333 trường hợp) cao hơn so với nghiên cứu của Zhang et al. (2014) với tỷ lệ là 14,07%. Năm 2015, nghiên cứu tại Morocco của Naasse et al. (2015) trên 573 nam giới (444 nam giới vô tinh và 129 nam giới thiểu tinh nặng) ghi nhận tỷ lệ này là 10,47% (60/573 trường hợp). Tại Việt Nam, nghiên cứu của Nguyễn Đức Nhự (2015) cho thấy 106/469 trường hợp (23,1%) nam giới vô sinh do di truyền. Sự khác biệt có lẽ do phương pháp nghiên cứu khác nhau. Đa số các nghiên cứu sử dụng phương pháp nuôi cấy bạch cầu lympho máu ngoại vi để xác định công thức nhiễm sắc thể và chọn những mẫu nam giới có công thức nhiễm sắc thể 46,XY để thực hiện kỹ thuật PCR đa mồi với số lượng chỉ dấu di truyền ít hơn so với nghiên cứu của chúng tôi. Hầu hết các nghiên cứu sử dụng 6 chỉ dấu di truyền theo hướng dẫn của EAA/EMQN (2014) là sY84 và sY86, sY127 và sY134, sY254 và sY255 để phát hiện mất đoạn AZF. Tuy nhiên, khi so sánh với nghiên cứu của Choi et al. (2013) cho thấy tỷ lệ bất thường ở nam giới khám vô sinh của luận án thấp hơn. Tác giả ghi nhận tỷ lệ này là 38% (110/289 trường hợp). Sự khác biệt này có lẽ do tác giả nghiên cứu trên 2 nhóm là nam giới vô tinh và nhóm nam giới có tinh trùng ít, yếu và dị dạng. Kết quả nghiên cứu ghi nhận các nguyên nhân di truyền do bất thường nhiễm sắc thể Y ở 113 nam giới khám vô sinh gồm có mất đoạn AZF, nhân đoạn gen DAZ, hội chứng Klinefelter có bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể Y; trong đó mất đoạn AZF chiếm tỷ lệ cao nhất (83,18%), thấp hơn là nhân đoạn gen DAZ (13,27%) và hội chứng Klinefelter có bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể Y chiếm 3,55% (Bảng 4.7). Bảng. 4.7. Một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y của đối tượng nghiên cứu Nguyên nhân di truyền Tần số Tỷ lệ (%) Mất đoạn AZF 94 83,18 Nhân đoạn gen DAZ 15 13,27 Hội chứng Klinefelter có bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể Y 4 3,55 Tổng 113 100 Không giống nghiên cứu của chúng tôi, đa số các nghiên cứu sử dụng phương pháp nuôi cấy bạch cầu lympho và PCR đa mồi với 6 chỉ dấu di truyền theo hướng dẫn của EAA/EMQN (2014). Bằng 2 phương pháp trên, kết quả ghi nhận bất thường về công thức nhiễm sắc thể chiếm tỷ lệ cao hơn so với mất đoạn AZF. 80 Cụ thể, theo nghiên cứu của Cavkaytar et al. (2012) ở Thổ Nhĩ Kỳ ghi nhận có 24/48 trường hợp (50%) nam có bất thường về công thức nhiễm sắc thể, 20/48 trường hợp (41,67%) nam có mất đoạn AZF và 4/48 trường hợp (8,33%) vừa có bất thường về công thức nhiễm sắc thể vừa có bất thường về mất đoạn AZF. Tương tự, nghiên cứu tại Trung Quốc của Fu et al. (2012) thấy rằng 154/298 (51,67%) nam giới vô sinh có bất thường công thức nhiễm sắc thể và 144/298 (48,33%) nam giới vô sinh bị mất đoạn AZF. Một nghiên cứu khác tại Trung Quốc của Zhang et al. (2014) cũng ghi nhận 23/34 (67,6%) nam giới vô sinh có bất thường công thức nhiễm sắc thể và 11/34 nam giới bị mất đoạn AZF (32,4%). Tại Việt Nam, nghiên cứu của Nguyễn Đức Nhự (2015) thấy rằng 65/114 trường hợp (57%) nam giới có công thức nhiễm sắc thể bất thường và 49/114 trường hợp nam giới bị mất đoạn AZF chiếm 43%. Sự khác biệt có lẽ do phương pháp nghiên cứu, cỡ mẫu và số lượng chỉ dấu di truyền khác nhau. Hầu hết các nghiên cứu trong và ngoài nước sử dụng phương pháp nuôi cấy bạch cầu lympho và PCR đa mồi với 6 chỉ dấu di truyền để phát hiện đoạn AZF của nhiễm sắc thể Y. Ở đây, luận án tập trung vào nghiên cứu một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y với 11/14 chỉ dấu di truyền phát hiện các gen ở đoạn AZF nhiễm sắc thể Y nên có lẽ đây là nguyên nhân làm cho tỷ lệ mất đoạn AZF chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các bất thường nhiễm sắc thể Y. 4.2.1. Các dạng mất đoạn AZF trên nhiễm sắc thể Y Nghiên cứu ghi nhận có 4 dạng mất đoạn trên đoạn AZF là mất một phần đoạn AZFb, mất một phần đoạn AZFc, mất hoàn toàn đoạn AZFc và mất hoàn toàn đoạn AZFbc; trong đó mất một phần đoạn AZFc chiếm tỷ lệ cao nhất (80,9%), thấp hơn là mất hoàn toàn đoạn AZFc chiếm 9,5%; mất hoàn toàn đoạn AZFbc chiếm 6,4%; và thấp nhất là mất một phần đoạn AZFb chiếm 3,2% (Bảng 4.8). Bảng 4.8. Các dạng mất đoạn AZF của đối tượng nghiên cứu Các dạng mất đoạn AZF Tần số Tỷ lệ (%) Mất một phần đoạn AZFb 3 3,2 Mất một phần đoạn AZFc 76 80,9 Mất hoàn toàn đoạn AZFc 9 9,5 Mất hoàn toàn đoạn AZFbc 6 6,4 Tổng 94 100 Kết quả nghiên cứu tương tự với nhiều nghiên cứu khác trên thế giới về sự lưu hành phổ biến của mất đoạn AZFc ở nhóm nam giới khám vô sinh có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch. Tỷ lệ mất đoạn này dao động từ 45-98% (Choi et al., 2013; Zhang et al., 2013b; Fadlalla et al., 2014; Gallego et al., 2014; Bichile et al., 2016; Zhu et al., 2016; Asadi et al., 2017). Nghiên cứu của Choi et al. (2013) ghi nhận mất đoạn AZFc chiếm 80,9% (89/110) và mất hoàn toàn đoạn AZFbc chiếm 19,1% (21/110 trường hợp). Một 81 nghiên cứu khác cũng được công bố năm 2013 cho thấy tỷ lệ mất đoạn AZFc lưu hành nhiều nhất (64,2%), thấp hơn là AZFbc (20%), AZFb (12,5%) và thấp nhất là AZFa và AZFabc (1,7%) (Zhang et al., 2013b). Nghiên cứu của Fadlalla et al. (2014) thấy rằng mất đoạn AZFc chiếm 97,36% (37/38 trường hợp) và mất đoạn AZFb chiếm 2,64% (1/38 trường hợp). Nghiên cứu của Gallego et al. (2014) đưa ra kết luận tương tự là mất đoạn AZFc chiếm 45,45% (5/11 trường hợp), AZFa chiếm 27,27% (3/11 trường hợp), AZFabc chiếm 18,18% (2/11 trường hợp) và AZFbc chiếm 9,1% (1/11 trường hợp). Nghiên cứu của Bichile et al. (2016) cũng thấy rằng mất đoạn AZFc chiếm tỷ lệ cao nhất là 61,53% (8/13 trường hợp), thấp hơn là AZFb 30,76% (3/13 trường hợp) và thấp nhất là AZFa chiếm 15,38% (2/13 trường hợp). Nghiên cứu của Zhu et al. (2016) mất đoạn AZFc chiếm 73,33% (110/150 trường hợp), AZFbc chiếm 11,33% (17/150 trường hợp), AZFabc chiếm 6,67% (10/150 trường hợp); AZFb chiếm 4,67% (7/150 trường hợp) và AZFa chiếm 4% (6/150 trường hợp). Nghiên cứu mới nhất được công bố năm 2017 của Asadi et al. cũng kết luận về sự lưu hành phổ biến của mất đoạn AZFc chiếm 70,7% (70/99 trường hợp); AZFbc chiếm 18,2% (18/99 trường hợp); AZFb chiếm 5,05% (5/99 trường hợp); AZFa và AZFabc đều chiếm 3,03% (3/99 trường hợp). So sánh với các nghiên cứu trong nước cũng cho thấy tỷ lệ mất đoạn AZFc chiếm cao nhất (Nguyễn Minh Hà, 2011; Nguyễn Thị Việt Hà, 2012; Nguyễn Đức Nhự, 2015). Kết quả nghiên cứu công bố năm 2011-2012 trên 70 nam giới khám vô sinh tại Bệnh viện Từ Dũ cho thấy mất đoạn AZFc chiếm tỷ lệ cao nhất 11,4% và mất đoạn AZFb là 1,43% (Nguyễn Minh Hà, 2011). Một nghiên cứu khác của Nguyễn Thị Việt Hà (2012) cho thấy mất đoạn AZFc chiếm tỷ lệ cao nhất 4,4%, thấp hơn là AZFa chiếm 2,4%, AZFb và AZFabc chiếm tỷ lệ thấp nhất là 0,4%. Năm 2015, nghiên cứu của Nguyễn Đức Nhự phát hiện mất đoạn AZFc và AZFcd chiếm tỷ lệ cao nhất là 26,53% (13/49 trường hợp), thấp hơn là AZFbcd chiếm 8/49 trường hợp (16,33%), AZFd chiếm 7/49 trường hợp (14,29%), AZFabcd và AZFbc chiếm 3/49 trường hợp (6,12%), AZFb chiếm 2/49 trường hợp (4,08%). Kết quả nghiên cứu ghi nhận có 85 trường hợp mất đoạn AZFc, trong đó có đến 76/85 mẫu bị mất một phần đoạn AZFc chiếm 89,4% và mất hoàn toàn đoạn AZFc chiếm 10,6% (9/85 trường hợp). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Olesen et al. (2017). Tác giả thấy rằng mất một phần đoạn AZFc chiếm 95% (57/60 trường hợp), thấp hơn là mất hoàn toàn đoạn AZFc chiếm 5% (3/60 trường hợp). Trong các kiểu mất một phần đoạn AZFc, kết quả ghi nhận có 7 kiểu mất đoạn gồm: gr/gr, b2/b3, mất 2 gen DAZ, mất 1 gen CDY1, mất 2 gen DAZ và 1 gen CDY1, mất đoạn sY1191-sY1192 và mất đoạn sY1291 (Bảng 4.9). 82 Kết quả ở Bảng 4.9 cho thấy mất một phần đoạn AZFc kiểu gr/gr chiếm tỷ lệ cao nhất (31,6%), thấp hơn là mất 2 gen DAZ (21,1%), mất đoạn sY1191- sY1192 (14,5%), mất đoạn sY1291 (10,5%), mất 2 gen DAZ và 1 gen CDY1 (9,2%), mất đoạn kiểu b2/b3 (7,9%) và thấp nhất là mất 1 gen CDY1 (5,2%). Kết quả nghiên cứu phù hợp với nhiều nghiên cứu trên thế giới về sự lưu hành mất đoạn AZFc kiểu gr/gr. Bảng 4.9. Các kiểu mất một phần đoạn AZFc của đối tượng nghiên cứu Các kiểu mất một phần đoạn AZFc Tần số Tỷ lệ (%) gr/gr 24 31,6 b2/b3 6 7,9 Mất 2 gen DAZ 16 21,1 Mất 1 gen CDY1 4 5,2 Mất 2 gen DAZ và 1 gen CDY1 7 9,2 Mất đoạn sY1191-sY1192 11 14,5 Mất đoạn sY1291 8 10,5 Tổng 76 100 Cho đến nay, các nghiên cứu trên thế giới thấy có 3 kiểu mất một phần đoạn AZFc là gr/gr, b2/b3 và b1/b3; trong đó mất đoạn kiểu gr/gr chiếm tỷ lệ cao nhất (Rozen et al., 2012; Sen et al., 2015; Olesen et al., 2017). Cụ thể, nghiên cứu của Rozen et al. (2012) thấy có 2 loại mất một phần đoạn AZFc ở người Việt Nam là mất đoạn kiểu gr/gr (16/17 trường hợp) chiếm 94,11% và b2/b3 (1/17 trường hợp) chiếm 5,89%. Olesen et al. (2017) thấy mất một phần AZFc kiểu gr/gr chiếm tỷ lệ cao nhất 57,89% (33/57 trường hợp); thấp hơn là kiểu b2/b3 chiếm 36,84% (21/57 trường hợp) và thấp nhất là kiểu b1/b3 chiếm 5,27% (3/57 trường hợp). Tương tự, nghiên cứu của Sen et al. (2015) cũng ghi nhận mất đoạn kiểu gr/gr chiếm tỷ lệ cao nhất 81,9% (59/72 trường hợp), thấp hơn là mất đoạn kiểu b2/b3 chiếm 11,1% (8/72 trường hợp) và thấp nhất là mất đoạn kiểu b1/b3 chiếm 6,9% (5/72 trường hợp). Nghiên cứu này ghi nhận một số đột biến mất một phần đoạn AZFc mới so với các nghiên cứu trên thế giới là mất đoạn sY1291, mất đoạn sY1191-1192, mất 2 gen DAZ, mất 2 gen DAZ và 1 gen CDY1. Sỡ dĩ, kết quả nghiên cứu khác biệt với nhiều nghiên cứu trên thế giới là do hầu hết các nghiên cứu chỉ dựa vào sự vắng mặt sản phẩm PCR được khuếch đại bằng các cặp mồi của các chỉ dấu di truyền sY1291, sY1191, sY1192 để xác định mất đoạn kiểu gr/gr, b2/b3 và b1/b3. Các nghiên cứu chỉ dựa vào sự không xuất hiện sản phẩm PCR được khuếch đại bằng cặp mồi của chỉ dấu di truyền sY1291 để xác định mất đoạn kiểu gr/gr. Trong khi theo y văn cho thấy, mất đoạn kiểu gr/gr làm mất đi 2 gen DAZ1 và DAZ2, 1 gen CDY1a, 2 gen BPY2. Do đó, trong nghiên cứu của chúng tôi sử dụng các chỉ dấu di truyền DAZ, CDY. Bên cạnh đó, hầu hết các nghiên cứu sử dụng kỹ thuật điện di gel agarose nên không thể phân biệt được những sản phẩm PCR có kích thước gần 83 nhau và theo tỷ lệ. Có lẽ đây là nguyên nhân mà trong nghiên cứu này có những kiểu mất một phần mất đoạn AZFc khác so với nhiều nghiên cứu khác. Hiện nay, mất đoạn kiểu gr/gr có 4 loại sau DAZ1-DAZ2-CDY1a (loại 1, hay còn gọi là g1/g2); DAZ3-DAZ4-CDY1a (loại 2); DAZ1-DAZ2-CDY1b (loại 3); DAZ3-DAZ4-CDY1b (loại 4) (Ghorbel et al., 2016; Krausz et al., 2017). Nghiên cứu của Ghorbel et al. (2016) ghi nhận mất đoạn sY1291-DAZ2-DAZ4-CDY1b (loại bất thường mới) có nguy cơ gây vô sinh nam ở quần thể người Tunisia. Nghiên cứu, Ghorbel et al. 2016 thấy chỉ có hai loại mất đoạn kiểu gr/gr là loại 1 và loại 3. Tần số các mất đoạn kiểu gr/gr phân bố khác nhau ở từng nước và từng dân tộc. Thật vậy, năm 2009 Krausz et al đã thấy rằng tần số của mất đoạn kiểu gr/gr loại 2 và loại 3 có sự khác biệt đáng kể giữa các nước; trong khi đó mất đoạn kiểu gr/gr loại 1 và loại 4 gần như không có sự khác biệt giữa các nước. Hơn nữa, tác giả ghi nhận tỷ lệ mất đoạn kiểu gr/gr loại 1 ở Úc chiếm cao nhất (50%), trong khi thấp nhất là ở Pháp (30%). Mất đoạn kiểu gr/gr loại 4 gặp nhiều ở Pháp, Tây Ban Nha và Italia (13-20%) và thấp hơn ở Úc, Đức và Đan Mạch (3,3-5%). Nghiên cứu này chỉ xác định là mất đoạn kiểu gr/gr và chưa phân biệt được là mất đoạn kiểu gr/gr loại 1, 2, 3 hay 4. Mất 2 gen DAZ là bất thường phố biến thứ 2 trong các kiểu mất một phần đoạn AZFc của đối tượng nghiên cứu, chiếm 16/76 trường hợp (21,1%). Bình thường trên đoạn AZFc của nhiễm sắc thể Y có 4 gen DAZ. Với trình tự mồi sử dụng trong luận án của chỉ dấu di truyền DAZ sẽ khuếch đại 4 gen DAZ và 1 gen DAZL trên nhiễm sắc thể 3 vì gen DAZ có đoạn tương đồng với gen DAZL. Do đó, tỷ lệ peak xuất hiện của chỉ dấu di truyền DAZ/DAZL là 4:2 ở nam giới bình thường. Ở những trường hợp mất 2 gen DAZ, luận án thấy tỷ lệ peak của sản phẩm PCR huỳnh quan