Luận án Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng bò để tạo phôi trong ống nghiệm

ộ 38,5 0 C, trong điều kiện 5% CO2 và độ ẩm tối đa. 2.1.3.5. Nuôi hợp tử và phôi in vitro Sau khi ủ tinh trùng với tế bào trứng 5 h trong tủ nuôi CO2, các tế bào trứng (hay có thể gọi là các hợp tử, có sự xuất hiện của thể cực thứ 2) được tách khối tế bào cumulus, bằng cách hút nhiều lần qua đầu pipet thủy tinh vô trùng trong môi trường nuôi in vitro và nuôi 20, 25 hay 30 hợp tử giả định trên trong 7 ngày trong giọt môi trường nuôi CR1aa 100 µl, bổ sung thêm 20 µl axit amin không thay thế (MEM essential amino acid 100x, Sigma), 10 µl axit amin thay thế (MEM essential amino acid 100x, Sigma), 1mg/ml (L- glutamic (Sigma), 3mg/ml BSA (Sigma, No-730), 5% huyết thanh bê mới sinh (Wako Pure Chemical Industries Ltd., Osaka, Japan) và kháng sinh (100.000 iu penicilin/ml + 100l streptomycin/ml). Nếu số lượng tế bào trứng nuôi ít hơn 20 tế bào trứng thì thể tích mỗi giọt được tính theo tỉ lệ cứ một hợp tử giả định sử dụng 5µl môi trường CR1aa trên. Các giọt nuôi được phủ dầu khoáng (Paraffin oil, Wako Pure Chemical, Japan) và quá trình nuôi được duy trì ở được giữ trong tủ CO2 (CO2 Incubator, Sanyo, Japan) ở nhiệt độ 38,5 0 C, trong điều kiện 5% CO2 và độ ẩm tối đa. Sau khi nuôi nuôi in vitro 24 - 48 h tiến hành đánh giá sự phân chia của hợp tử. 2.1.3.6. Đánh giá chất lượng phôi dâu và phôi nang Ở bò, thu hoạch phôi in vitro hoặc phôi in vivo thường ở giai đoạn phôi dâu và phôi nang, tương ứng với ngày thứ 7 hoặc thứ 8 sau khi thụ tinh. Phương pháp đánh giá chất lượng đóng vai trò quan trọng trong việc lựa chọn những phôi có chất lượng tốt để cấy truyền hoặc đông lạnh để đạt được tối đa tỉ lệ có chửa. Đánh giá và phân loại phôi dâu, phôi nang được được đánh giá theo 4 mức độ khác nhau, dựa vào giai đoạn phát triển, vòng trong suốt và khối tế bào chất. - Loại A (rất tốt): Phôi có hình thái chuẩn đúng với giai đoạn phát triển. Vòng trong suốt tròn đẹp, khối tế bào đậm phân chia đều, rõ, không có tế bào rời hoặc mảnh vụn bên ngoài. - Loại B (tốt): Phôi có hình dáng kích thước tốt, phản ánh đúng giai đoạn phát triển, nhưng khối tế bào không đẹp, không đều, không rõ nét như loại A. Sự liên kết của các tế bào tương đối chặt chẽ, đôi khi có mảnh vụn tế bào hoặc tế bào rời. - Loại C (trung bình): Phôi có màu sắc phân bố không đều, các tế bào liên kết lỏng lẻo, nhiều tế bào rời nhiều mảnh vụn xen kẽ hoặc tụ thành đám nhỏ. Kích thước tế bào nhỏ hơn bình thường. Màng trong suốt có thể còn nguyên vẹn nhưng nhỏ hoặc không tròn. - Loại D (loại kém): Phôi phát triển chậm so với tuổi, các tế bào phôi bị vỡ, màng trong suốt bị khuyết tật, có hình dạng và kích thước không bình thường, hoặc phôi bị thoái hóa. Đây là loại phôi không đủ tiêu chuẩn cấy cũng như đông lạnh. 2.1.3.7. Bố trí thí nghiệm Gồm có 8 thí nghiệm được thực hiện độc lập với nhau, trong suốt thời gian từ năm 2006 – 2011, để xác định sự ảnh hưởng của một số yếu tố đến số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng, chất lượng tế bào trứng, hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được và từ đó xác định được yếu tố thích hợp cho kết quả tốt nhất khi siêu âm hút tế bào trứng bò để tạo phôi trong ống nghiệm. Để hạn chế tối đa sự tác động của các yếu tố ngoại cảnh làm ảnh hưởng đến các thí nghiệm. Bò cho tế bào trứng sử dụng trong từng thí nghiệm có điểm thể trạng, cân nặng tương đối đồng đều. Sử dụng máy siêu âm để xác định sự đồng đều về hoạt động và kích thước của hai buồng trứng. Được chăm sóc nuôi dưỡng trong cùng một điều kiện, cho ăn 4 kg thức ăn tinh và 50 kg cỏ tươi/ngày. Bò cho tế bào trứng ở các thí nghiệm không giống nhau. Trước khi tiến hành thí nghiệm 3 tuần, cứ hai ngày một lần các nang trứng có kích thước từ 5 mm trở lên được loại bỏ, để loại bỏ sự tồn tại của thể vàng trên buồng trứng, hạn chế sự tác động của nang trội và đưa hoạt động buồng trứng của nhóm bò thí nghiệm về pha nang trứng phát triển. Siêu âm hút tế bào trứng trong tất cả các thí nghiệm được thực hiện bởi một người kỹ thuật. Nhóm người thực hiện soi tìm tế bào trứng, đánh giá chất lượng tế bào trứng, nuôi thành thục, thụ tinh và tạo phôi trong từng thí nghiệm hầu như không có sự thay đổi. Hệ thống máy móc, thiết bị, môi trường,giống nhau. Các thí nghiệm được sắp xếp theo tính quan trọng và mức độ sử dụng liên tục trong quá trình nghiên cứu. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của áp lực hút. Mục đích của nghiên cứu là đánh giá sự ảnh hưởng của bốn mức độ áp lực hút 60 mmHg, 90 mmHg, 120 mm Hg và 150 mmHg, dựa vào một số tác giả đã công bố (Pawel và cs., 2007; Bols và cs., 1996) lên số lượng tế bào trứng, chất lượng tế bào trứng, hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được. Thí nghiệm được tiến hành trên ba bò sữa HF có cùng độ tuổi với nhau (8 tuổi). Siêu âm hút tế bào trứng được thực hiện với ở tần suất 2 lần/tuần (theo Viana 2004). Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của tần suất siêu âm hút tế bào trứng. Mục đích của nghiên cứu là đánh giá sự ảnh hưởng của ba tần suất hút: 2 tuần/lần, 1 tuần/lần và ½ tuần/lần lên số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng, chất lượng tế bào trứng, hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được. Thí nghiệm được tiến hành trên ba bò sữa HF có cùng độ tuổi (5 tuổi), sử dụng áp lực hút được nghiên cứu ở thí nghiệm 1 (120 mmHg). Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước nang trứng được thực hiện trên hai bò sữa HF (6 tuổi), để đánh giá sự ảnh hưởng của kích thước nang trứng lên số lượng nang trứng được hút, số lượng tế bào trứng, hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được. Siêu âm hút tế bào trứng được thực hiện ở áp lực hút 120 mmHg của thí nghiệm 1 và ở tần suất ½ tuần/lần được nghiên cứu ở thí nghiệm 2. Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của pha nang trứng phát triển và pha nang trứng trội. Mục đích của nghiên cứu là đánh giá sự ảnh hưởng của pha nang trứng phát triển và pha nang trứng trội lên số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng, chất lượng tế bào trứng, hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được khi siêu âm hút tế bào trứng không liên tục. Trước khi siêu âm hút tế bào trứng, tiến hành xác định pha nang trứng phát triển và pha nang trứng trội của đợt sóng nang. Mười bốn bò thí nghiệm HF ( 3 – 6 tuổi) được siêu âm và hút loại bỏ tất cả các nang trứng có kích thước từ 2 mm trở lên (ngày 0). Ngày 1 trở đi xuất hiện một đợt nang trứng mới, có kích thước từ 2 mm trở lên được huy động, phát triển cho đến khi một nang trứng phát triển nhanh hơn các nang trứng còn lại gọi là nang trội, nang trội tiếp tục tăng nhanh về mặt kích thước. Lúc này các nang trứng còn lại giảm phát triển và ngừng hẳn. Khi các nang trứng còn lại ngừng phát triển thì từ ngày 0 đến thời điểm này được gọi là pha nang trứng phát triển và từ thời điểm các nang trứng ngừng phát triển cho đến khi xuất hiện một đợt nang trứng mới gọi là pha nang trội. Siêu âm hút tế bào trứng được thực hiện ở áp lực hút 120 mmHg. Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của liều lượng FSH được tiến hành trên hai bò HF (3 tuổi), sáu liều lượng FSH (ANTLIN: Denka Phamaceutical Co., Kawasaki, Japan) được nghiên cứu, bao gồm một liều lượng đối chứng (không sử dụng FSH) và 5 liều lượng thí nghiệm: 2mg, 3mg, 4mg, 5mg và 6mg. Dựa vào kết quả nghiên cứu của Goodhand và cs. (1999); Reis và cs. (2002); Chaubal và cs. (2007); De Roover và cs. (2005). Mục đích của nghiên cứu là đánh giá sự ảnh hưởng của liều lượng FSH lên số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng, chất lượng tế bào trứng, hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được. Mỗi một liều lượng FSH được chia làm hai phần bằng nhau, một phần được tiêm vào buổi sáng và một phần được tiêm vào buổi chiều (sau ngày hút tế bào trứng). Sau khi tiêm FSH 2 ngày (Khoảng cách giữa các lần siêu âm hút tế bào trứng là 4 ngày) tiến hành siêu âm hút tế bào trứng. Siêu âm hút tế bào trứng được thực hiện ở áp lực hút 120 mmHg và tần suất ½ tuần/lần. Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của giống bò. Nghiên cứu được tiến hành trên hai bò HF và hai bò lai hướng sữa F3 (HF x lai Sind) ở áp lực hút 120 mmHg, tần suất 1/2 tuần/lần để đánh giá sự ảnh hưởng của hai giống bò này lên số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng, chất lượng tế bào trứng, hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được. Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi bò. Mục đích của nghiên cứu là đánh giá ảnh hưởng của tuổi bò cho tế bào trứng lên số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng, chất lượng tế bào trứng, hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được. Thí nghiệm được tiền hành trên bò sữa HF 3 tuổi và 6 tuổi, ở áp lực hút 120 mmHg, tần suất ½ tuần/lần. Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của mùa vụ. Mục đích của nghiên cứu là xác định sự ảnh hưởng của vụ đông - xuân và hè - thu lên số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng, chất lượng tế bào trứng, hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được. Thí nghiệm được tiến hành tên hai bò sữa HF (6 tuổi). Siêu âm hút tế bào trứng được thực hiện ở áp lực hút 120 mmHg và tần suất ½ tuần/lần. 2.1.3.8. Xử lý số liệu Kết quả nghiên cứu của các thí nghiệm về số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng, chất lượng tế bào trứng, hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang được phân tích, đánh giá sự khác nhau về thống kê giữa các yếu tố ở các thí nghiệm sử dụng chương trình Paired t-test trong phần mềm minitab, phiên bản 14. Các giá trị được trình bày dưới dạng X ± SE (X: Bình quân; SE: Sai số chuẩn). 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm được tiến hành từ năm 2006 đến năm 2011, tại: - Bộ môn Sinh lý, Sinh sản và Tập tính vật nuôi - Viện Chăn nuôi. - Bộ môn Hóa sinh, Sinh lý động vật - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội - Khoa Thú y - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội - Trạm kiểm nghiệm và bảo tồn vật nuôi - Viện Chăn nuôi. - Các hộ nuôi bò huyện Ba Vì, Hà Nội và huyện Vĩnh Tường, Vĩnh Phúc CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Ảnh hưởng của áp lực hút * Ảnh hưởng của áp lực hút đến số lượng nang trứng được hút và tế bào trứng thu được Để đánh giá sự ảnh hưởng của áp lực hút, 72 lượt buồng trứng của bò sống được siêu âm hút tế bào trứng. Tổng số nang trứng được hút (Bảng 3.1) ở áp lực 60 mmHg, 90 mmHg, 120 mmHg và 150 mmHg, tương ứng: 167, 172, 170 và 178 nang. Tổng số tế bào trứng thu được từ các nang trứng ở áp lực 60 mmHg, 90 mmHg, 120 mmHg và 150 mmHg, tương ứng 54, 75, 138 và 155 tế bào trứng. Bảng 3.1. Số lượng nang trứng được hút và ảnh hưởng của áp lực hút đến số lượng tế bào trứng thu được Áp lực hút Nang trứng được hút Tế bào trứng thu được % n X ± SE n X ± SE 60 mmHg 167 9,28 a ± 0,52 54 3,00 a ± 0,27 32,34 90 mmHg 172 9,56 a ± 0,57 75 4,17 b ± 0,35 43,60 120 mmHg 170 9,44 a ± 0,39 138 7,67 c ± 0,31 81,18 150 mmHg 178 9,89 a ± 0,52 155 8,61 c ± 0,44 87,08 Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột không mang chữ cái giống nhau thì sai khác có ý nghĩa P < 0,05%; %: Tỉ lệ tế bào trứng thu được/nang trứng được hút; X: Bình quân/buồng trứng/lần Từ kết quả nang trứng được hút cho thấy, số lượng nang trứng được hút/buồng trứng/lần không có sự khác nhau (P < 0,05) vào thời điểm siêu âm hút tế bào trứng ở các mức độ áp lực 60 mmHg, 90 mmHg, 120 mmHg và 150 mmHg, tương ứng: 9,28; 9,56; 9,44 và 9,89 nang. Song lại có sự ảnh hưởng rõ rệt của áp lực hút đến kết quả tế bào trứng thu được (P < 0,05), có sự sai khác biệt giữa áp lực 120 và 150 mmHg so với áp lực 60 và 90 mmHg, tương ứng: 7,67 và 8,61 tế bào trứng/buồng trứng/lần so với 3,00 và 4,17 tế bào trứng/buồng trứng/lần (P < 0,05). Nhưng căn cứ vào số lượng tế bào trứng/buồng trứng/lần siêu âm hút tế bào trứng cho thấy ở áp lực hút 150 mmHg cao nhất. Qua số lượng tế bào trứng thu được/nang trứng được hút, có thể thấy rằng số lượng nang trứng được hút không có sự khác nhau (p < 0,05), tuy nhiên tỉ lệ tế bào trứng thu được/nang trứng được hút lại có sự chênh lệch giữa các mức độ áp lực hút, tương ứng: 32,34% ở 60 mmHg, 43,60% ở 90 mmHg, 81,18% ở 120 mmHg và 87,08% ở 150 mmHg. Như vậy có thể thấy rằng khi tăng áp lực hút thì số lượng tế bào trứng thu được cũng như tỉ lệ tế bào trứng thu được tăng lên. Tỉ lệ tế bào trứng thu được ở áp lực hút 60 và 90 mmHg của chúng tôi thấp hơn nhiều so với kết quả của Nguyễn Văn Lý và cs. (2006), song ở áp hút 120 và 150 mmHg lại tương đối phù hợp với tác giả, khi tác giả thu tế bào trứng bằng phương pháp hút dịch nang trứng và phương pháp phẫu thuật thu được tỉ lệ tế bào trứng thu được/nang trứng có kích thước ≤ 8 mm là 82,38%. Như vậy, có thể nói, quá trình siêu âm hút tế bào trứng là một quá trình phức tạp, bao gồm rất nhiều yếu tố và bị hạn chế bởi khả năng quan sát so với thu tế bào trứng từ buồng trứng lò mổ, tỉ lệ tế bào trứng thu được ở áp suất thích hợp cho kết quả tốt. Kết quả thu được cho thấy, ở áp lực hút thấp số lượng tế bào trứng thu được thấp. Nguyên nhân có thể do ở lực hút yếu nên dịch nang trứng cùng với các tế bào trong dịch nang trứng không được hút ra hết. Mặt khác ở những nang trứng lớn do lực hút chậm nên có thể đã có một số lượng dịch nang trứng bị thoát ra xung quanh vết kim đâm. Số lượng tế bào trứng tăng lên khi áp lực hút tăng cao là do lực hút mạnh đã hút được tối đa dịch nang trứng và lực tác động cơ học lên sự liên kết giữa tế bào trứng và các tế bào xung quanh. Nhưng số lượng tế bào trứng thu được tăng lên có làm ảnh hưởng đến chất lượng tế bào trứng, đặc biệt là màng cumulus cần được nghiên cứu để tìm ra áp lực hút đảm bảo cho quá trình tạo phôi in vitro vì khả năng phát triển cao nhất của tế bào trứng khi có hình thái tròn trịa, tế bào chất đồng nhất và phải có từ 3 lớp màng cumulus trở lên (Rita và cs., 2003). * Ảnh hưởng của áp lực hút đến chất lượng tế bào trứng Đánh giá chất lượng tế bào trứng là khâu quan trọng để đạt được kết quả cao trong quá trình nuôi thành thục, thụ tinh in vitro, liên quan mật thiết đến kết quả hợp tử phân chia, số lượng phôi dâu và phôi nang thu được. Đánh giá chất lượng tế bào trứng được thực hiện trên màn hình của kích hiển vi soi nổi, dựa vào đặc điểm hình thái, màu sắc, đặc biệt là đặc điểm và số lượng màng cumulus (Hình 3.1) để phân loại chất lượng tế bào trứng theo bốn mức độ từ tốt đến xấu A, B, C và D. Kết quả nghiên cứu và thực tiễn cho thấy, chỉ có tế bào trứng có chất lượng loại A và B mới có khả năng phát triển tốt. Kết quả thu được cho thấy, có sự ảnh hưởng của áp lực hút lên chất lượng tế bào trứng loại A (P < 0,05). Bình quân tế bào trứng loại A ở các mức độ áp lực 60, 90, 120 và 150 mmHg, tương ứng 1,44; 1,89; 3,78 và 2,44 tế bào trứng/buồng trứng/lần (Bảng 3.2). Như vậy, tế bào trứng loại A/buồng trứng/lần thấp nhất ở áp lực 60 mmHg và cao nhất ở áp lực hút 120 mmHg. Có sự khác biệt (P < 0,05) về số lượng tế bào trứng loại B/buồng trứng/lần ở áp lực 60 mmHg và 90 mmHg so với 120 mmHg và 150 mmHg, tương ứng: 1,06 và 1,33 tế bào trứng so với 3,00 và 3,17 tế bào trứng. Ở áp lực 150 mmHg cho kết quả tế bào trứng loại B/buồng trứng/lần cao nhất và thấp nhất ở áp lực hút 60 mmHg (P < 0,05). Có sự sai khác (P < 0,05) về số lượng tế bào trứng loại C/buồng trứng/lần ở áp lực 150 mmHg so với áp lực 60 mmHg, 90 mmHg và 120 mmHg, tương ứng: 1,44 tế bào trứng so với 0,33; 0,56 và 0,56 tế bào trứng. Tương tự, tế bào trứng loại D ở áp lực hút 150 mmHg có sự khác biệt với áp lực hút 60 mmHg, 90 mmHg và 120 mmHg (P < 0,05). Bình quân số lượng tế bào trứng/buồng trứng/lần loại D ở áp lực 150 mmHg (1,56 tế bào), cao hơn so với áp lực 60 mmHg, 90 mmHg và 120 mmHg (tương ứng: 0,17; 0,39 và 0,33 tế bào trứng). Bảng 3.2. Ảnh hưởng của áp lực hút đến chất lượng tế bào trứng Áp lực Hút Chất lượng tế bào trứng A B C D X ± SE (n) X ± SE (n) X ± SE (n) X ± SE (n) 60 mmHg 1,44 a ± 0,17 (26) 1,06 a ± 0,17 (19) 0,33 a ± 0,14 (6) 0,17 a ± 0,09 (3) 90 mmHg 1,89 b ± 0,16 (34) 1,33 a ± 0,20 (24) 0,56 a ± 0,17 (10) 0,39 a ± 0,12 (7) 120 mmHg 3,78 c ± 0,27 (68) 3,00 b ± 0,26 (54) 0,56 a ± 0,15 (10) 0,33 a ± 0,11 (6) 150 mmHg 2,44 b ± 0,23 (44) 3,17 b ± 0,27 (57) 1,44 b ± 0,20 (26) 1,56 b ± 0,18 (28) Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột không mang chữ cái giống nhau thì sai khác có ý nghĩa P < 0,05; A, B, C và D: Chất lượng tế bào trứng theo thứ tự từ cao đến thấp; X: Bình quân/buồng trứng/lần Như vậy có thể nói rằng áp lực đã ảnh hưởng đến chất lượng tế bào trứng. Sự ảnh hưởng này liên quan mật thiết đến kết quả nuôi thành thục và tạo phôi in vitro. Nguyễn Văn Lý và cs. (2006); Nguyễn Hữu Đức và cs. (2003) đã tiến hành nghiên cứu và có kết luận rằng, chất lượng tế bào trứng trước khi nuôi ảnh hưởng đến tỉ lệ trứng thành thục. Số lượng tế bào trứng/buồng trứng/lần có chất lượng C và D cao là một kết quả không mong muốn khi siêu âm hút tế bào trứng bò để tạo phôi trong ống nghiệm. Tế bào trứng loại A, B thường được sử dụng, do có tỉ lệ thành thục, thụ tinh và tạo phôi trong ống nghiệm cao, còn chất lượng tế bào trứng loại C và D thường không được sử dụng để nuôi thành thục, thụ tinh và tạo phôi trong ống nghiệm do kết quả thu được rất kém (Shiora và cs., 1988). Nguyễn Văn lý và cs. (2006) cũng có kết luận tương tự khi ông nghiên cứu ảnh hưởng của chất lượng tế bào trứng đến khả năng thành thục từ tế bào trứng được thu từ buồng trứng của lò mổ thấy rằng, không có sự sai khác ý nghĩa về tỉ lệ thành thục giữa tế bào trứng loại A và tế bào trứng loại B (71,19% và 69,46%; P < 0,05), nhưng tỉ lệ thành thục của tế bào trứng loại C lại thấp hơn nhiều so với loại A và B, chỉ đạt (38,35%; P < 0,05). Tế bào trứng loại A Tế bào trứng loại B Tế bào trứng loại C Tế bào trứng loại D Hình 3.1.Tế bào trứng có chất lượng A, B, C và D Kết quả của chúng tôi thu được ở áp suất 60 mmHg tương đối phù hợp với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Văn Lý và cs. (2006) về tế bào trứng loại A và B/buồng trứng/lần, khi ông tiến hành nghiên cứu siêu âm hút tế bào trứng trên bò sống, số lượng tế bào trứng loại A và B thu được/buồng trứng/lần siêu âm, tương ứng 1,44 và 0,97 tế bào trứng. Tuy nhiên, ở áp lực hút 90, 120 và 150 mmHg của chúng tôi lại cao hơn. * Ảnh hưởng của áp lực hút đến hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được Tế bào trứng loại A và B được nuôi thành thục, thụ tinh, nuôi hợp tử và phôi in vitro đến giai đoạn phôi dâu và phôi nang. Kết quả thu được cho thấy, có sự sai khác về số lượng hợp tử phân chia (Bảng 3.3) ở áp lực hút 120 mmHg, 150 mmHg so với 60 và 90 mmHg (P < 0,05), tương ứng 3,61; 2,50 so với 1,50 và 1,72 hợp tử/buồng trứng/lần. Số lượng hợp tử/tế bào trứng nuôi thành thục cao nhất ở áp lực 60 mmHg (60%) so với áp lực 90 (53,45%), 120 mmHg (53,28%) và 150 mmHg (44,55%). Như vậy, tỉ lệ hợp tử thu được ở áp lực 60 mmHg tốt nhất. Kết quả này cho thấy rằng, ở áp lực này sự ảnh hưởng đến chất lượng tế bào trứng ít hơn so với các mức độ áp lực khác. Tuy nhiên ở áp lực này số lượng tế bào trứng thu được là rất thấp, do vậy số lượng hợp tử thu được/buồng trứng/lần rất thấp, chỉ đạt 1,50 hợp tử. Trong khi đó tỉ lệ hợp tử phân chia ở áp lực hút 120 mmHg có phần thấp hơn áp lực 60 mmHg, nhưng số lượng hợp tử thu được/buồng trứng/lần lại cao nhất (3,61 hợp tử; P < 0,05). Hợp tử sau khi phân chia được tiếp tục nuôi đến giai đoạn phôi nang và phôi dâu. Qua số lượng phôi dâu và phôi nang thu được cho thấy, (Bảng 3.3) không có sự ảnh hưởng của áp lực hút đến số lượng phôi dâu và phôi nang thu được (P < 0,05). Song căn cứ vào số lượng phôi thu được/buồng trứng/lần thì ở áp lực hút 120 mmHg (1,11 phôi) cao hơn so với áp lực 60 mmHg, 90 mmHg và 150 mmHg (tương ứng: 0,56; 0,61 và 0,67 phôi/buồng trứng/lần). Tỉ lệ phôi dâu và phôi nang thu được ở các mức độ áp lực 60. 90, 120 và 150 mmHg tương ứng: 22,22; 18,97; 16,39 và 11,88 %. Từ kết quả thu được cho thấy, ở áp lực hút càng cao khả năng thu được tế bào trứng càng lớn, song tỉ lệ hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được đã bị giảm xuống. Dựa vào mục tiêu của nghiên cứu này là tìm ra áp lực hút thích hợp cho số lượng phôi dâu và phôi nang thu được cao nhất ta thấy ở áp lực hút 120 mmHg đáp ứng được điều đó, với 1,11 phôi/buồng trứng/lần siêu âm, cao hơn các mức độ áp suất còn lại (P < 0,05). Bảng 3.3. Ảnh hưởng của áp lực hút đến sự phân chia của hợp tử, phôi dâu và phôi nang Áp lực hút Tế bào trứng nuôi in vitro (n) Hợp tử phân chia Phôi dâu và phôi nang X ± SE (n) % X ± SE (n) % 60 mmHg 45 1,50 a ± 0,23 (27) 60,00 0,56 a ± 0,17 (10) 22,22 90 mmHg 58 1,72 a ± 0,21 (31) 53,45 0,61 a ± 0,14 (11) 18,97 120 mmHg 122 3,61 b ± 0,31 (65) 53,28 1,11 a ± 0,20 (20) 16,39 150 mmHg 101 2,50 c ± 0,23 (45) 44,55 0,67 a ± 0,14 (12) 11,88 Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột không mang chữ cái giống nhau thì sai khác có ý nghĩa P < 0,05; %: Tỉ lệ hợp tử, phôi dâu và phôi nang thu được/tế bào trứng nuôi in vitro; X: Bình quân/buồng trứng/lần * Kết luận Qua kết quả nghiên cứu ta thấy có sự biến động rất lớn về số lượng tế bào trứng, chất lượng tế bào trứng, hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được (P < 0,05). Số lượng tế bào trứng ở áp lực hút 150 mmHg cao nhất (8,61 tế bào trứng/buồng trứng/lần). Chất lượng tế bào trứng loại A, B ở áp lực hút 120 mmHg cao nhất (3,78 và 3,00 tế bào trứng/buồng trứng/lần). Số lượng hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được cao nhất ở tần suất 120 mmHG (1,11 phôi/buồng trứng/lần). Từ kết quả nghiên cứu này có thể đưa ra kết luận rằng, áp lực hút 120 mmHg là tốt nhất. Hình 3.2. Biểu đồ đánh giá số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng, hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được ở 4 mức độ áp suất khác nhau Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với tác giả Hashimito và cs. (1998); Jaskowski. (2001); Kruip và cs. (1994); Pawel và cs. (2007) khi các tác giả nghiên cứu ảnh hưởng của áp lực hút khi siêu âm hút tế bào trứng trên bò sống kết luận rằng, áp lực hút ảnh hưởng đến số lượng và chất lượng tế bào trứng. Tương tự Pawel và cs. (2007) đã nghiên cứu ảnh hưởng của áp lực hút lên số lượng và chất lượng tế bào trứng ở lợn và bò đi đến kết luận rằng, áp lực hút tế bào trứng ảnh hưởng đến chất lượng tế bào trứng (P < 0,05). Nghiên cứu của Bols và cs. (1996) về sự ảnh hưởng của áp lực hút lên số lượng tế bào trứng thu được cũng cho thấy, số lượng tế bào trứng thu được tăng lên khi sử dụng áp lực hút > 130 mmHg so với 50 mmHg, 70 mmHg, 90 mmHg và 110 mmHg. Nghiên cứu ảnh hưởng của áp lực hút được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu thấy rằng, mức độ áp lực hút sử dụng trong quá trình siêu âm hút tế bào trứng có sự liên quan mật thiết với số lượng tế bào trứng được hút ra cũng như chất lượng tế bào trứng (Bols và cs., 1996; Jaskowski, 2001; Kruip và cs., 1994; Pawel và cs., 2007). Theo các lập luận của các nhà khoa học trong quá trình siêu âm hút tế bào trứng, các tế bào trứng có thể bị ảnh hưởng của áp lực hút, tốc độ, dòng xoáy, khi tăng áp suất lên cao làm giảm khả chất lượng tế bào trứng và làm tăng tỉ lệ tế bào trứng bị lột trần (không có màng cumulus). Lập luận của các tác giả cũng phù hợp với giả thuyết và kết quả nghiên cứu của chúng tôi. Bols và cs. (1996) cũng cho rằng, độ chính xác của áp lực hút phụ thuộc vào cấu tạo của thiết bị siêu âm hút tế bào trứng, đường kính của kim hút tế bào trứng, độ dài và kích thước của ống dẫn dịch. Rõ ràng áp lực hút đóng một vai trò quan trọng khi siêu âm hút tế bào trứng và thụ tinh ống nghiệm, kết quả sau cũng cho thấy các tác giả có kết quả khác nhau khi sử dụng áp lực hút khác nhau: Moreno (1993) sử dụng áp suất 120 mmHg (kim 18 G), Gibbons. (1994) sử dụng 75 mmHg (kim 17 G), Manjunatha (2008) sử dụng 110 mmHg (kim 18 G). Khi siêu âm hút tế bào trứng, số lượng tế bào trứng thu được cao hay thấp còn phụ thuộc vào kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng. Để xác định chính xác số lượng, kích thước nang trứng, thu được hết số lượng tế bào trứng, việc cố định và di chuyển buồng trứng là một trong những yếu tố rất quan trọng để có hình ảnh sắc nét của các nang trứng trên màn hình máy siêu âm. Kỹ thuật thường cố định và di chuyển buồng trứng thường được thực hiện bằng bốn ngón tay (trừ ngón tay cái). Ở Phương pháp sử dụng bốn ngón tay, cho phép xoay chuyển buồng trứng theo nhiều góc độ khác nhau để đạt được khả năng quan sát mong muốn. Vị trí của buồng trứng nằm ngang so với đầu dò siêu âm và hình ảnh thu được có hình tròn. Khi đếm và đo kích thước của nang trứng, buồng trứng được đưa về phía bên phải và phía bên trái. Để hút được tối đa số lượng tế bào trứng chúng ta đưa buồng trứng từ dưới lên trên và từ trên xuống dưới (Hình 3.3). Hình 3.3. Phương pháp cố định buồng trứng bằng bố