Luận án Nghiên cứu tạo oligochitosan - Silica nano và khảo sát tính kích kháng bệnh thán thư do nấm colletotrichum spp. gây hại cây ớt (capsicum frutescens l.)

ố liệu xử lý được chuyển đổi theo công thức: (1) chuyển đổi arsin√x; (2) chuyển đổi √x Thời điểm 7 NSLN, tỷ lệ bệnh có giá trị cao nhất ở các mẫu phân lập TN-L3 (68,5%), TN-Tr2 (63,8%), TN-L1 và TN-Th1 (63,5%) khác biệt rất có ý nghĩa thống kê khi so với các mẫu phân lập HCM-Tr3 (26,6%), ĐT-Tr2 (26,6%), TN-Tr4 (1,3%), HCM-Tr5 (1,3%), ĐT-Tr1 (1,3%), và ĐT-Tr3 (1,3%). Đối với chỉ số bệnh có giá trị 66 cao nhất ở các mẫu phân lập TN-L3 (4,8%), HCM-Tr2 (4,7%), TN-Th2 (4,6%) và khác biệt rất có ý nghĩa thống kê khi so với các mẫu phân lập TN-Tr1 (2,2%), TN-Tr3 (2,0%), TN-Tr4 (0,7%), HCM-Tr3 (2,0%), HCM-Tr5 (0,7%), HCM-L1 (2,3%), HCM- L2 (2,5%), ĐT-Tr1 (0,7%), ĐT-Tr2 (2,0%), ĐT-Tr3 (0,7%). Trong cùng điều kiện không gây vết thương không có hiện tượng lây nhiễm của nấm bệnh. Bảng 3.2. Tình hình bệnh trên trái trong điều kiện gây vết thương (%) Mã Mẫu Tỷ lệ bệnh (%) Chỉ số bệnh(2) (%) 3 NSLN 5 NSLN 7 NSLN 3 NSLN 5 NSLN 7 NSLN TN-Tr1 22,4 g 72,3 a 88,8 a 1,5 f 3,0 ghi 5,0 cde TN-Tr2 59,2 ab 63,5 c 80,3 b 2,9 b 3,5 efg 4,9 c-f TN-Tr3 42,7 ef 55,0 e 59,2 d 2,3 de 3,5 efg 4,3 e-h TN-Tr4 38,9 f 46,9 g 59,2 d 2,8 b 3,2 f-i 4,2 fgh TN-L1 55,0 bc 67,7 b 67,7 c 2,8 b 3,9 cde 5,6 bc TN-L2 18,1 g 51,2 f 55,0 de 1,3 f 2,9 i 4,5 e-h TN-L3 59,2 ab 71,9 a 80,3 b 3,3 a 4,9 a 6,1 ab TN-Th1 51,2 abc 59,2 d 80,3 b 2,7 bcd 4,1 cd 7,0 a TN-Th2 51,2 cd 67,7 a 88,8 a 2,7 bc 3,7 def 5,5 bc HCM-Tr1 38,9 f 46,9 g 59,2 d 2,2 e 3,5 efg 4,8 c-f HCM-Tr2 55,0 bc 63,5 c 80,3 b 2,8 b 4,3 bc 5,1 cd HCM-Tr3 38,9 f 50,8 f 50,8 ef 2,2 e 3,2 fghi 3,8 h HCM-Tr4 22,4 g 43,1 h 46,9 f 1,5 f 2,9 i 3,9 gh HCM-Tr5 63,8 a 72,3 a 59,2 d 2,9 b 3,9 cde 4,7 def HCM-L1 42,7 ef 50,8 f 59,2 d 2,3 de 3,4 e-h 4,6 d-g HCM-L2 59,2 ab 59,2 d 80,3 b 2,9 b 4,7 ab 6,1 ab ĐT-Tr1 42,7 ef 50,8 f 50,8 ef 2,3 de 3,8 cde 4,7 def ĐT-Tr2 46,9 de 55,0 e 71,9 c 2,8 b 4,1 cd 6,1 ab ĐT-Tr3 38,9 f 51,2 f 67,7 c 2,4 cde 3,6 def 4,8 c-f ĐT-Th1 43,1 de 55,0 e 71,9 c 2,6 bc 4,3 bc 5,6 bc CV (%) 4,5 2,3 5,0 5,7 5,9 6,2 Ft 129,6** 156,3** 44,7** 43,7** 21,4** 20,3** * Ghi chú: Trong cùng một cột hoặc hàng, các trị số có cùng ký tự đi kèm khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê; ** khác biệt rất có ý nghĩa thống kê; số liệu xử lý được chuyển đổi theo công thức: (2) chuyển đổi √x Kết quả lây nhiễm của các mẫu nấm Colletotrichum spp. đã được phân lập trong điều kiện có gây vết thương trên mẫu lá, cho thấy tất cả các nấm đều lây nhiễm với các cấp độ khác nhau trong đó một số mẫu nấm có mức độ gây nhiễm mạnh, trong điều 67 kiện có gây vết thương các mẫu nấm gây bệnh nhưng không gây bệnh ở điều kiện không gây vết thương. * Kết quả gây bệnh trên trái ớt: Kết quả đánh giá khả năng lây nhiễm của các mẫu phân lập nấm Colletotrichum spp. trên trái ớt trong điều kiện gây vết thương và không gây vết thương phòng thí nghiệm được thể hiện ở Bảng 3.2 và Bảng 3.3. Trong Bảng 3.2 ở điều kiện gây vết thương, tỷ lệ bệnh của các mẫu nấm tại thời điểm 3 ngày sau lây nhiễm (NSLN), 5 NSLN và 7 NSLN có sự khác biệt rất có ý nghĩa trong thống kê; chỉ tiêu chỉ số bệnh của các mẫu nấm cũng có khác biệt rất có ý nghĩa trong thống kê ở thời điểm 3, 5 và 7 NSLN. Trong đó, ở 3 NSLN có tỷ lệ bệnh cao nhất (63,8 và 59,2%) ở các mẫu phân lập HCM-Tr5, TN-Tr2, TN- L3 và HCM-L2 và khác biệt này rất có ý nghĩa so với các mẫu phân lập TN-Tr1 (22,4%), TN-L2 (18,1%) và HCM-Tr4 (22,4%). Chỉ tiêu chỉ số bệnh tại thời điểm 3 NSLN, mẫu phân lập TN-L3 có giá trị cao nhất (3,3%) khác biệt rất có ý nghĩa với các mẫu phân lập TN-L2 (1,3 %), TN-Tr1 (1,5%) và HCM-Tr4 (1,5%). Tại thời điểm 5 NSLN, tỷ lệ bệnh giữa các mẫu phân lập rất có ý nghĩa trong thống kê, cao nhất vẫn ở mẫu phân lập TN-Tr1 (72,3%), TN-L3 (71,9%), TN-Th2 (67,7%), HCM-Tr5 (72,3%) và thấp nhất ở mẫu phân lập HCM-Tr4 (43,1 %); Chỉ số bệnh cao nhất ở mẫu phân lập TN-L3 (4,9 %) và HCM-L2 (4,7 %) khác biệt có ý nghĩa khi so với các mẫu phân lập TN-L2 (2,9 %) và HCM-Tr4 (2,9 %). Thời điểm 7 NSLN, tỷ lệ bệnh cao nhất ở mẫu phân lập TN-Tr1 và mẫu phân lập TN-Th2 cùng đạt giá trị 88,8%, khác biệt rất có ý nghĩa khi so với các mẫu phân lập TN-Tr3 (59,2%), TN-Tr4 (59,2%), TN-L2 (55,0%), HCM- Tr3 (50,8%), HCM-Tr4 (46,9%), HCM-Tr5 (59,2%), HCM-L1 (59,2%) và ĐT-Tr1 (50,8%); Chỉ số bệnh tại thời điểm 7 NSLN cao nhất ở dòng TN-Th1 (7,0%) và TN-L3 (6,1%) khác biệt rất có ý nghĩa trong thống kê khi so với các mẫu phân lập TN-Tr3 (4,3%), TN-Tr4 (4,2%), TN-L2 (4,5%), HCM-Tr3 (3,8%), HCM-Tr4 (3,9%). 68 Bảng 3.3. Tình hình bệnh trên trái trong điều kiện không gây vết thương (%) Mã mẫu Tỷ lệ bệnh (%) Chỉ số bệnh (%) 3 NSLN 5 NSLN 7 NSLN 3 NSLN 5 NSLN 7 NSLN TN-Tr1 0,7 b 0,7 d 0,7 c 0,7 b 0,7 c 0,7 c TN-Tr2 0,7 b 2,0 c 4,5 a 0,7 b 1,0 c 1,6 b TN-Tr3 0,7 b 0,7 d 0,7 c 0,7 b 0,7 c 0,7 c TN-Tr4 0,7 b 0,7 d 0,7 c 0,7 b 0,7 c 0,7 c TN-L1 0,7 b 0,7 d 0,7 c 0,7 b 0,7 c 0,7 c TN-L2 0,7 b 0,7 d 0,7 c 0,7 b 0,7 c 0,7 c TN-L3 3,3 a 3,9 a 4,5 a 1,3 a 2,1 a 2,3 a TN-Th1 2,0 ab 2,0 c 2,0 b 1,0 a 1,0 c 1,4 b TN-Th2 0,7 b 0,7 d 0,7 c 0,7 b 0,7 c 0,7 c HCM-Tr1 0,7 b 0,7 d 0,7 c 0,7 b 0,7 c 0,7 c HCM-Tr2 0,7 b 0,7 d 0,7 c 0,7 b 0,7 c 0,7 c HCM-Tr3 0,7 b 0,7 d 0,7 c 0,7 b 0,7 c 0,7 c HCM-Tr4 0,7 b 0,7 d 0,7 c 0,7 b 0,7 c 0,7 c HCM-Tr5 0,7 b 0,7 d 0,7 c 0,7 b 0,7 c 0,7 c HCM-L1 0,7 b 0,7 d 0,7 c 0,7 b 0,7 c 0,7 c HCM-L2 0,7 b 0,7 d 0,7 c 0,7 b 0,7 c 0,7 c ĐT-Tr1 0,7 b 0,7 d 0,7 c 0,7 b 0,7 c 0,7 c ĐT-Tr2 0,7 b 0,7 d 0,7 c 0,7 b 0,7 c 0,7 c ĐT-Tr3 0,7 b 0,7 d 0,7 c 0,7 b 0,7 c 0,7 c ĐT-Th1 3,0 a 2,9 b 3,3 b 1,5 a 1,8 b 2,0 a CV (%) 3,5 3,3 3,7 16,1 20,7 14,8 Ft 17,4** 21,0** 22,5** 8,6** 13,7** 38,9** * Ghi chú: Trong cùng một cột hoặc hàng, các trị số có cùng ký tự đi kèm khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê; ** khác biệt rất có ý nghĩa thống kê; *: khác biệt có ý nghĩa; số liệu xử lý được chuyển đổi theo công thức √x Ở Bảng 3.3, điều kiện lây nhiễm không gây vết thương, tại thời điểm 3 NSLN tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh của mẫu phân lập ĐT-Th1 có giá trị cao nhất (3,0% và 1,5%) khác biệt không có ý nghĩa khi so với các mẫu phân lập TN-L3 (3,3% và 1,3% ) và TN-Th1 (2,0% và 1,0%) nhưng khác biệt rất có ý nghĩa so với các mẫu rất có ý nghĩa khi so với các mẫu phân lập còn lại. Thời điểm 5 NSLN, ở mẫu phân lập TN-L3 có tỷ 69 lệ bệnh cao nhất đạt 3,9%, tiếp đến là mẫu ĐT-Th1 (đạt 2,9%), TN-Tr2 (2,0%) và TN-Th1 (2,0%) khác biệt rất có ý nghĩa khi so với các mẫu phân lập còn lại. Đối với chỉ số bệnh, mẫu phân lập TN-L3 có giá trị cao nhất (2,1%), kế tiếp là ĐT-Th1 (1,8%), khác biệt rất có ý nghĩa khi so với các mẫu phân lập còn lại. Thời điểm 7 NSLN, tỷ lệ bệnh đạt cao nhất là 4,5% ở các mẫu phân lập TN-Tr2, TN-L3, kế tiếp là mẫu phân lập ĐT-Th1 (3,3%), khác biệt rất có ý nghĩa so với các mẫu phân lập còn lại. Chỉ số bệnh cao nhất ở TN-L3 (2,3%) và ĐT-Th1 (2,0%), tiếp đến là mẫu phân lập TN-Tr2 (1,6%), TN-Th1 (1,4%) và khác biệt rất có ý nghĩa so với các mẫu phân lập còn lại. Kết quả lây nhiễm của các mẫu nấm Colletotrichum spp. đã được phân lập trên mẫu trái trong điều kiện phòng thí nghiệm cho thấy có 20 mẫu nấm Colletotrichum spp. đều gây bệnh trên trái trong điều kiện gây vết thương và có 4 mẫu nấm gây bệnh trong điều kiện không gây vết thương sau 7 ngày NSLN là TN-Tr2 TN-L3, TN-Th1, và ĐT-Th1. 3.1.2.2. Đánh giá khả năng gây bệnh của các mẫu nấm Colletotrichum spp. đã phân lập trong điều kiện nhà màng Kết quả thí nghiệm phun lây nhiễm 20 mẫu nấm gây bệnh thán thư trên cây ớt trong điều kiện nhà màng, được trình bày theo tỷ lệ bệnh (Bảng 3.4) và chỉ số bệnh (Bảng 3.5). Kết quả dựa theo tỷ lệ bệnh ở Bảng 3.4 cho thấy sau 5 ngày lây nhiễm mẫu phân lập TN–L3 có tác dụng gây bệnh cao nhất là 3,41% không có sự khác biệt đối với nghiệm thức phun mẫu phân lập HCM–Tr2 nhưng khác biệt so với các nghiệm thức còn lại. Mẫu phân lập có sự lây nhiễm thấp nhất là mẫu phân lập HCM-Tr4 với tỷ lệ lây nhiễm là 1,98%. Sau 7 ngày tỷ lệ bệnh cao nhất ở nghiệm thức phun lây nhiếm mẫu phân lập TN-Tr2 (7,39%) và mẫu phân lập HCM-Tr2 (7,33%), thấp nhất là ở nghiệm thức phun mẫu phân lập HCM-Tr5, ĐT-Tr3 và TN-Tr4 với lần lượt các tỷ lệ 3,82%, 3,7% và 3,58%. Sau 9 ngày tỷ lệ bệnh cao nhất ở nghiệm thức phun lây nhiễm mẫu phân lập TN-L3 (9,94%), thấp nhất là ở nghiệm thức phun mẫu phân lập TN-Th2 với tỷ lệ bệnh là 4,1%. Sau 14 ngày phun lây nhiễm mẫu phân lập TN-L3 có tỷ lệ gây bệnh trên cây ớt thí nghiệm cao nhất là 19,96%, không có sự khác biệt với nhiệm thức phun mẫu phân lập HCM-L2 (19,09%) và HCM-Tr2 (18,51%), tỷ lệ bệnh thấp nhất ở 70 nghiệm thức phun mẫu phân lập ĐT-Tr3 là 8,91%. Sự khác biệt giữa các nghiệm thức thí nghiệm rất có ý nghĩa về mặt thống kê. Bảng 3.4. Tỷ lệ bệnh sau khi lây nhiễm trong điều kiện nhà màng (%) Mã mẫu 5 NSLN 7 NSLN 9 NSLN 11 NSLN 14 NSLN TN-Tr1 2,19 de 4,98 cd 8,14 bcd 10,02 b 14,44 c TN-Tr2 2,36 cde 7,39 a 8,58 bc 13,18 a 15,83 c TN-Tr3 2,3 cde 4,15 de 4,70 ijk 5,32 de 9,88 ef TN-Tr4 2,14 de 3,58 e 4,22 jk 5,77 de 11,06 de TN-L1 2,71 bcd 4,48 de 6,08 gh 7,84 c 10,18 ef TN-L2 2,08 de 4,21 de 5,08 ij 6,33 d 10,9 de TN-L3 3,41 a 6,45 ab 9,94 a 13,48 a 19,96 a TN-Th1 2,51 cde 5,86 bc 8,99 b 13,78 a 17,98 b TN-Th2 2,82 bc 3,95 de 4,10 k 4,59 e 12,45 d HCM-Tr1 2,08 de 5,84 bc 6,97 efg 10,31 b 14,9 c HCM-Tr2 3,24 ab 7,33 a 8,80 b 13,65 a 18,51 ab HCM-Tr3 2,14 de 6,67 ab 7,31 def 8,68 c 15,59 c HCM-Tr4 1,98 e 6,43 ab 7,80 cde 11,12 b 14,90 c HCM-Tr5 2,16 de 3,82 e 4,81 ijk 6,01 d 10,93 de HCM-L1 2,14 de 4,2 de 6,42 fg 8,38 c 10,78 e HCM-L2 2,72 bcd 6,18 b 8,50 bc 10,44 b 19,09 ab ĐT-Tr1 2,08 de 3,89 de 4,64 ijk 8,38 c 9,70 ef ĐT-Tr2 2,08 e 3,89 de 4,64 ijk 5,69 de 9,7 ef ĐT-Tr3 2,13 de 3,70 e 4,96 ijk 5,89 d 8,91 f ĐT-Th1 2,51 dce 5,86 bc 8,99 b 13,78 a a 17,98 b CV (%) 10,59 8,42 5,90 5,79 5,09 Ft 8,12** 27,62** 72,82** 116,84** 86,97** * Ghi chú: Trong cùng một cột hoặc hàng, các trị số có cùng ký tự đi kèm khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê; ** khác biệt rất có ý nghĩa thống kê; số liệu xử lý được chuyển đổi theo công thức √x Kết quả dựa theo chỉ số bệnh tại Bảng 3.5 cho thấy sau 7 ngày lây nhiễm mẫu phân lập HCM-Tr2 có chỉ số bệnh cao nhất là 3,32% không có sự khác biệt đối với nghiệm thức phun mẫu phân lập TN-Tr2, HCM-Tr3 và HCM-L2 nhưng khác biệt so với các nghiệm thức còn lại. Nghiệm thức có chỉ số bệnh thấp nhất là 1,07% khi phun mẫu phân lập TN-Tr4. Sau 9 ngày chỉ số bệnh cao nhất ở nghiệm thức phun lây nhiễm mẫu phân lập TN-Tr2 (3,81%), HCM-Tr2 (3,71%) và HCM-L2 (3,43%), chỉ số bệnh thấp nhất là ở nghiệm thức phun mẫu phân lập TN-Th2 (1,26%). Sau 11 ngày tỷ lệ bệnh cao nhất ở nghiệm thức phun lây nhiếm mẫu phân lập TN-Tr2 (4,82%) tuy nhiên 71 không có sự khác biệt với các nghiệm thức phun các mẫu phân lập (HCM-L2, HCM- Tr2, TN-Thl và TN-L3), thấp nhất là ở nghiệm thức phun mẫu phân lập TN-Tr4 với chỉ số bệnh là 1,75% và mẫu phân lập TN-Th2 là 1,54%. Sau 14 ngày phun lây nhiễm mẫu phân lập TN-L3 có chỉ số bệnh trên cây ớt thí nghiệm cao nhất là 6,41%, không có sự khác biệt với nhiệm thức phun mẫu phân lập TN-Thl (5,83%), chỉ số bệnh thấp nhất ở nghiệm thức phun mẫu phân lập ĐT-Tr2 là 3,02%. Sự khác biệt giữa các nghiệm thức thí nghiệm rất có ý nghĩa về mặt thống kê. Bảng 3.5. Chỉ số bệnh sau khi lây nhiễm trong điều kiện nhà màng (%) Mã Mẫu 5 NSLN 7 NSLN 9 NSLN 11 NSLN 14 NSLN TN-Tr1 0,68 1,15 e 2,46 def 3,05 c-f 4,36 de TN-Tr2 1,14 3,24 ab 3,81 a 4,82 a 5,43 bc TN-Tr3 0,94 1,14 e 1,64 g-j 1,87 gh 3,29 fg TN-Tr4 0,94 1,07 e 1,44 ij 1,75 h 3,26 fg TN-L1 1,07 1,15 e 1,91 f-i 2,5 d-h 3,26 fg TN-L2 0,98 1,14 e 1,5 hij 1,95 gh 3,26 fg TN-L3 1,17 2,62 bc 2,91 cd 4,45 ab 6,41 a TN-Thl 0,95 2,59 bc 3,02 cd 4,47 ab 5,83 ab TN-Th2 1,01 1,1 e 1,26 j 1,54 h 3,99 ef HCM-Tr1 1,03 2,27 cd 2,84 cde 3,35 cde 5,03 bcd HCM-Tr2 1,44 3,32 a 3,71 ab 4,57 ab 5,44 bc HCM-Tr3 1,1 2,84 abc 3,11 bc 3,43 cd 4,28 de HCM-Tr4 1,05 2,47 bc 3,18 bc 3,82 bc 4,72 cde HCM-Tr5 0,87 1,69 de 2,43 def 2,98 c-f 4,18 de HCM-L1 0,95 1,32 e 2,26 efg 3,06 c-f 3,85 efg HCM-L2 0,96 2,79 abc 3,43 abc 4,67 ab 5,52 bc ĐT-Tr1 0,89 1,25 e 1,82 f-j 2,45 e-h 3,02 g ĐT-Tr2 0,89 1,25 e 1,82 f-j 2,45 e-h 3,02 g ĐT-Tr3 0,91 1,23 e 1,83 f-j 2,21 fgh 3,30 fg ĐT-Th1 0,95 2,59 bc 3,02 cd 4,47 ab 5,83 ab CV (%) 7,60 15,38 10,67 12,28 8,34 Ft 1,04ns 24,31** 27,31** 24,06** 27,59** * Ghi chú: Trong cùng một cột hoặc hàng, các trị số có cùng ký tự đi kèm khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê; ** khác biệt rất có ý nghĩa thống kê; số liệu xử lý được chuyển đổi theo công thức √x Từ kết quả đánh giá dựa theo tỷ lệ bệnh (Bảng 3.4) và chỉ số bệnh (Bảng 3.5) cho thấy một số mẫu nấm phân lập có độc lực cao như các mẫu TN-L3, TN-Tr2, TN- 72 Th1, HCM-Tr2, HCM-L2, ĐT-Th1. Các mẫu này được dùng để định danh kiểm tra dưới loài bằng phương pháp sinh học phân tử. 3.1.2.3. Định danh các mẫu nấm Colletotrichum spp. gây bệnh có độc lực cao bằng kỹ thuật sinh học phân tử ITS4/ITS5 ACT512F/ACT783R GDF1/GDR1 Bt2a/Bt2b GSF1/GSR1 CHS79F/CHS354R CL1C/CL2C Hình 3.4. Điện di sản phẩm khuếch đại PCR các mẫu phân lập Colletotrichum spp. Phụ lục 36. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi ITS4/ITS5 1: TN-Tr2; 2: HCM-Tr2; 3: ĐT-Th1; 4: TN-Th1; 5: HCM-L2; 6: TN-L3; Ladder 100bp 1: TN-Tr2; 2: HCM-Tr2; 3: ĐT-Th1; 4: TN-Th1; 5: HCM-L2; 6: TN-L3; Ladder 100bp Phụ lục 38. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi GDF1/GDR1 1: TN-Tr2; 2: HCM-Tr2; 3: ĐT-Th1; 4: TN-Th1; 5: HCM-L2; 6: TN-L3; Ladder 100bp 1: TN-Tr2; 2: HCM-Tr2; 3: ĐT-Th1; 4: TN-Th1; 5: HCM-L2; 6: TN-L3; Ladder 100bp Phụ lục 40. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi GSF1/GSR1 1: TN-Tr2; 2: HCM-Tr2; 3: ĐT-Th1; 4: TN-Th1; 5: HCM-L2; 6: TN-L3; Ladder 1 kb 1: TN-Tr2; 2: HCM-Tr2; 3: ĐT-Th1; 4: TN-Th1; 5: HCM-L2; 6: TN-L3; Ladder 100bp Phụ lục 42. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CL1C/CL2C 1: TN-Tr2; 2: HCM-Tr2; 3: ĐT-Th1; 4: TN-Th1; 5: HCM-L2; 6: TN-L3; Ladder 1 kb 73 Các mẫu nấm gây bệnh có tính độc cao từ kết quả đánh giá độc lực của các mẫu phân tích thuộc hai nhóm phức hợp loài là Colletotrichum gloeosporioides (TN-Tr2 và HCM-Tr2) và Colletotrichum truncatum (TN-L3, TN-Th1, HCM-L2 và ĐT-Th1). Để kiểm tra định danh mức độ dưới loài bằng phương pháp sinh học phân tử, các mồi được khuếch đại dựa vào trình tự các mồi vùng gen ITS4,5 (internal transcribed spacer), ACT (partical actin), GPDH (Glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase), TUB2 (β-tubin), GS (Glutamine synthetase), CHS (Chitin synthase) và CAL (Calmodin) (Bảng 2.5). Bảng 3.6. Kết quả định danh loài Colletotrichum spp. dựa vào trình tự các vùng gen Tên mẫu/Vùng gen TN-Tr2 (1) HCM-Tr2 (2) ĐT-TH1 (3) TN-TH1 (4) HCM-L2 (5) TN-L3 (6) ITS (I) Colletotrichum gloeosporioides Colletotrichum scovillei Colletotrichum truncatum Colletotrichum truncatum Colletotrichum truncatum Colletotrichum truncatum ACTIN (A) Colletotrichum siamense Colletotrichum siamense Colletotrichum truncatum Colletotrichum truncatum Colletotrichum truncatum Colletotrichum truncatum GAPDH (G) Colletotrichum siamense Colletotrichum scovillei Colletotrichum truncatum Colletotrichum truncatum Colletotrichum truncatum Colletotrichum truncatum TUBIN (T) Colletotrichum siamense Colletotrichum scovillei Colletotrichum truncatum Colletotrichum truncatum Colletotrichum truncatum Colletotrichum truncatum GS (S) Colletotrichum gloeosporioides Colletotrichum acutatum Colletotrichum truncatum Colletotrichum truncatum Colletotrichum truncatum Colletotrichum truncatum CHS (C) Colletotrichum fructicola Colletotrichum scovillei Colletotrichum truncatum Colletotrichum truncatum Colletotrichum truncatum Colletotrichum truncatum CAL (L) Colletotrichum siamense Colletotrichum scovillei Colletotrichum siamense Colletotrichum siamense Colletotrichum siamense Colletotrichum siamense Sau khi khuếch đại mồi, mẫu được gởi đi định danh và phân loại các phức hợp dưới loài do Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trường, trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh nhận thực hiện (dịch vụ theo hợp đồng) (Phụ lục 3). Kết quả phân tích các mẫu Bảng 3.6 cho thấy ngoài hai phức hợp loài Colletotrichum spp. được phân loại và định danh dùng hình thái, đề tài còn ghi nhận thêm được một số phân loài như C. siamense, C. scovillei, C. acutatum và C. fructicola. Sự đa dạng các loài mới phát sinh trên loài nấm Colletotrichum spp. cũng được phát hiện gần đây bởi một số tác giả ở Úc, Trung Quốc, Ấn Độ [12,13]. 74 Theo Cannon và cộng sự (2012), định danh nấm Colletotrichum spp. dựa trên phân tích phân tử ngày càng phổ biến và dẫn tới nhiều thay đổi trong phân loại các loài thuộc chi này. Thông thường đối với Colletotrichum spp., thường sử dụng 5 cặp mồi trở lên của các vùng gen khác nhau. Kết quả nghiên cứu của Weir và cộng sự (2012) cho thấy, C. gloeosporioides thực chất là các phức hợp loài (special complex), trong đó C. gloeosporioides gồm ít nhất 22 loài khác nhau [5,6]. Và kết quả chạy sinh học phân tử của các cặp mồi cho mẫu nấm C. truncatum cho kết quả thống nhất 6 trên 7 cặp mồi được chạy. Với các công trình nghiên cứu được công bố trong và ngoài nước cho thấy nấm Colletotrichum spp. có sự biến đổi đa dạng. 3.2. Hoàn thiện công nghệ tạo oligochitosan-silica nano Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới quan tâm đến vật liệu lai “vô cơ – hữu cơ” vì chúng có nhiều hiệu ứng cộng gộp các tính chất lý, hóa và sinh học của hai loại vật liệu. Đã có nhiều công trình nghiên cứu chế tạo hỗn hợp lai của nSiO2 với các loại vật liệu khác như hỗn hợp nSiO2/chitosan, nSiO2/tripolyphosphaste (TPP). Tuy vậy, chưa có các công trình nghiên cứu về chế tạo vật liệu lai nSiO2/oligochitosan, đặc biệt là hiệu ứng sinh học của hỗn hợp vật liệu lai này đối với thực vật, điển hình là hiệu ứng kích kháng bệnh đối với cây ớt. Các công nghệ trước đây chế tạo hỗn hợp nSiO2/chitosan, nSiO2/TPP thường ổn địn trong môi trường pH thấp (~3  3,5), bị kết lắng trong môi trường có pH cao (trung tính và kiềm nhẹ) do đó khó ứng dụng trong nông nghiệp. Do oligochitosan không bị kết tủa trong mội trường trung tính và kiềm nhẹ, nên quá trình chế tạo hỗn hợp vật liệu lai (vô cơ/hữu cơ) nSiO2/oligochitosan thuận lợi hơn so với các công nghệ trước đây khi sản xuất hỗn hợp nSiO2/chitosan, nSiO2/TPP. Đây chính là các cơ sở quan trọng nhất hướng đến việc cần phải nghiên cứu sản xuất và sử dụng oligochitosan- silica nano trong nghiên cứu này. 75 3.2.1. Điều chế oligochitosan có trọng lượng phân tử thấp bằng phương pháp xác định liều lượng chiếu xạ tia gamma Co-60 kết hợp với H2O2 Kết quả KLPT (Mw) của chitosan khi chiếu xạ với liều xạ khác nhau trên các mẫu dung dịch chitosan 4% có và không có H2O2 (Bảng 3.7). Kết quả Bảng 3.7 cho thấy với cả 3 mẫu dung dịch chitosan 4% có và không có H2O2, khi tăng liều chiếu xạ, KLPT của chitosan đều giảm xuống. Khi có mặt H2O2, mức độ suy giảm KHPT của chitosan nhanh hơn so với dung dịch không có H2O2 và mức độ suy giảm tăng khi hàm lượng H2O2 tăng từ 0,5 đến 1%. Kết quả phù hợp với các kết quả đã khảo sát cắt mạch chitosan trong dung dịch chứa H2O2 xảy ra theo hiệu ứng đồng vận [113, 114, 115]. Bảng 3.7. Sự suy giảm KLPT của chitosan trong dung dịch 4% có và không có H2O2 theo liều xạ Liều xạ, kGy CTS 4% CTS 4%/H2O2 0,5% CTS 4%/H2O2 1% 0 44,500 44,500 44,500 3,5 319,000 17,900 16,700 7,0 14,800 12,600 10,500 10,5 12,300 9,000 7,700 14,0 10,500 6,600 5,500 17,5 9,100 5,500 4,600 21,0 7,900 5,000 4,200 Từ kết quả Bảng 3.7, chọn được 02 mẫu oligochitosan từ dung dịch chitosan 4%/H2O2 1%, chiếu xạ ở liều 10,5 và 17,5 kGy có KLPT tương ứng là 7,7 kDa và 4,6 kDa dùng cho thí nghiệm ức chế nấm bệnh trên thực vật. Kết quả Bảng 3.8 cho thấy đối với mẫu chitosan 4%/H2O2 1%, liều xạ 21 kGy, ĐĐA giảm từ 91,3% của chitosan trước khi chiếu xạ xuống thấp nhất là 85,6%. KLPT của chitosan hoặc oligochitosan càng nhỏ chỉ số PI càng thấp chứng tỏ độ phân tán hẹp và đồng nhất hơn mẫu chitosan ban đầu (PI=3,37). Theo Ulanski và Von Sonntag gốc •OH làm đứt liên kết C–H hình thành gốc tự do carbohydrat và tiếp theo là chuyển vị 76 gốc tự do đại phân tử dẫn đến liên kết glucozit bị cắt, tạo thành phân tử chitosan có KLPT thấp hơn [116]. Bảng 3.8. Độ ĐĐA% và chỉ số đa phân tán (PI) của chitosan theo liều xạ Liều xạ, kGy CTS 4% CTS 4%/H2O2 0,5% CTS 4%/H2O2 1% ĐĐA % PI ĐĐA % PI ĐĐA % PI 0 91,3 3,37 91,3 3,37 91,3 3,37 3,5 90,2 2,63 89,9 2,78 89,6 2,69 7,0 89,4 2,60 89,1 2,52 88,5 2,55 10,5 89,0 2,56 88,6 2,48 87,7 2,31 14,0 88,7 2,49 88,0 2,18 86,2 1,95 17,5 88,5 2,43 87,6 1,97 85,9 1,81 21,0 88,3 2,30 87,2 1,88 85,6 1,71 77 Hình 3.5. Sắc kí đồ GPC của các mẫu oligochitosan có Mw lần lượt là 2,5 kDa (a); 4,6 kDa (b) và 7,7 kDa (c) Kết quả Bảng 3.9 cho thấy với cùng nồng độ H2O2 0,5% chitosan nhỏ hơn, cụ thể là 2% thì mức độ suy giảm KLPT theo liều xạ nhanh hơn so với dung dịch chitosan nồng độ cao (4%). Như vậy có thể dự đoán rằng muốn tạo ra oligochitosan KLPT nhỏ thì việc lựa chọn nồng độ chitosan thích hợp là cần thiết. Ngoài ra còn có yếu tố khác chủ yếu là KLPT ban đầu của chitosan. Từ kết quả Bảng 3.9, lựa chọn được mẫu oligochitosan có KLPT 2,5 kDa nhận được ở liều xạ 21 kGy. Từ các kết quả thí nghiệm trên đề tài đã chọn được 3 mẫu oligochitosan có KLPT lần lượt là 7,7 kDa, 4,6 kDa và 2,5 kDa dùng cho thí nghiệm ức chế nấm bệnh trên cây ớt. a b c 78 Bảng 3.9. KLPT (Mw), PI và ĐĐA của chitosan trong dung dịch 2%/H2O2 0,5% theo liều xạ Liều xạ, kGy KLPT, Mw ĐĐA % PI 0,0 44.500 91,3 3,37 3,5 11.900 90,7 2,90 7,0 6.300 89,4 2,33 10,5 4.400 88,1 1,63 14,0 3.500 87,6 1,40 17,5 2.900 86,4 1,32 21,0 2.500 85,9 1,25 3.2.1.1. Khảo sát một số đặc trưng tính chất của phân đoạn oligochitosan điều chế Tính chất phổ hồng ngoại (IR): Kết quả phổ hồng ngoại cho thấy chitosan cắt mạch tạo oligochitosan có KLPT từ 2,5 đến 7,7 kDa có cấu trúc chính hầu như không thay đổi so với chitosan ban đầu (Hình IR 3.6a). Sự khác nhau về cường độ của các đỉnh ở 1320 và 1420 cm-1 đặc trưng tương ứng cho nhóm N-acetylglucosamine và nhóm so sánh -CH2 thể hiện sự thay đổi ĐĐA của chitosan và oligochitosan [115]. Giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD): Kết quả giản đồ nhiễu xạ tia X cho thấy chitosan ban đầu có 2 đỉnh nhiễu xạ tai góc 2 là 10,3 và 19,8º (Hình XRD 3.6a). So với chitosan sự khác biệt chủ yếu về đặc trưng nhiễu xạ tia X của oligochitosan là đỉnh 2 ở 10,3º gần như không xuất hiện (Hình 3.6c và 3.6d) và cường độ của đỉnh 2 tại 19,8º giảm dần theo sự giảm KLPT của oligochitosan. Điền này chứng tỏ rằng oligochitosan có KLPT càng nhỏ thì đặc trưng chủ yếu là ở dạng vô định hình [116]. 79 Hình 3.6. Phổ hồng ngoại (IR) và nhiễu xạ tia X (XRD) của các mẫu chitosan (a) và các phân đoạn oligochitosan 7,7 kDa (b); 4,6 kDa (c) và 2,5 kDa (d) Kết luận: Đã chế tạo oligochitosan bằng phương pháp chiếu xạ tia gamma Co- 60 dung dịch chitosan có và không có H2O2. Đã khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chitosan và nồng độ H2O2 lên quá trình cắt mạch chitosan tạo oligochtosan. Đã lựa chọn 03 mẫu oligochitosan với KLPT là: 7,7; 4,6 và 2,5 kDa dùng để thí nghiệm ức chế nấm bệnh đối với cây ớt. Ngoài ra mẫu oligochitosan cũng được dùng để tạo hỗn hợp vật liệu lai với silica nano chế tạo từ vỏ trấu. 3.2.1.2. Đánh giá khả năng ức chế nấm bệnh của các phân đoạn oligochitosan điều chế Trong quá trình khảo sát khả năng kích kháng bệnh thán thư trên cây ớt (Capsicum frutescens L.) gây ra bởi nấm Colletotrichum spp. của hỗn hợp oligochitosan và nano silica, cần xác định được phân đoạn và nồng độ kháng nấm Colletotrichum spp. thích hợp của từng đơn vị kết hợp trong điều kiện in vitro. Hoạt tính kháng nấm của oligochitosan được giải thích là do chúng làm thay đổi tính thấm của tế bào [117, 118], ngăn chặn việc sao chép RNA của tế bào [118, 119] hay do hoạt tính tạo phức (chelate) với các yếu tố vi lượng làm ức chế sự phát triển của hệ sợi nấm [117]. Thêm vào đó oligochitosan còn được cho là diệt nấm hiệu quả bằng cách ngăn cản bào tử nấm nảy mầm, cản trở ống mầm kéo dài và ức chế sợi nấm bệnh phát triển [120, 121]. 80 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của các phân đoạn oligochitosan khác nhau ở nồng độ 0,01% đến sự phát triển Colletotrichum spp. trên môi trường PDA. Mẫu Đường kính tản nấm 3NSC 4NSC 5NSC 6NSC 7NSC 8NSC 9NSC 2,5 kDa 2,08±0,38 2,63±0,33 3,76±0,22 4,24±0,58 4,93±0,43 5,35±0,31 5,78±0,16 4,6 kDa 2,03±0,10 2,64±0,28 3,07±0,12 4,05±0,49 4,63±0,45 5,19±0,41 5,78±0,38 7,7 kDa 2,33±0,12 3,04±0,18 3,80±0,16 4,44±0,42 5,60±0,20 6,15±0,28 6,56±0,18 92,0 kDa 1,15±0,23 1,58±0,19 2,72±0,33 3,03±0,29 4,02±0,32 4,79±0,