Luận văn Chọn giống vi khuẩn và khảo sát một số điều kiện lên men acetic để làm giấm trái cây

yền phù tế bào vi sinh vật với dung dịch các monomer. Sau đó, tạo điều kiện để các monomer liên kết và tạo phân tử polimer. Các phân tử polimer liên kết với nhau bằng liên kết cộng hóa trị để tạo nên cấu trúc gel chứa tế bào vi sinh vật. Cách 2 :ta trộn huyền phù tế bào vi sinh vật với dung dịch chất mang polimer. Hỗn hợp sẽ được tiến hành với những phản ứng thích hợp để tạo liên kết giữa các sợi polimer với nhau.Những liên kết mới được hình thành sẽ tạo 1 mạng lưới dày đặc chứa tế bào vi sinh vật.Sau đó khối gel này được đưa đến thiết bị tạo hạt và thu được các hạt gel polimer chứa tế bào vi sinh vật cố định. c.Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấu trúc non-covalent gel Phương pháp này giống phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấu trúc covalent gel nhưng mạng lưới trong cấu trúc gel này được hình thành từ những liên kết khác liên kết khác liên kết cộng hóa trị, thường là liên kết hydro. Chất mang thường được sử dụng là carregeenan. d. Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấutrúc cryogel Cryogel được tạo thành bằng cách sử dụng phương pháp lạnh đông. Ở điều kịen nhiệt độ thấp, mẫu nguyên liệu sẽ biến đổi cứng lại và hình thành cấu trúc mới. Polyvinylalcohol là loại polimer được sử dụng trong tạo gel cryogel có khả năng cố định tế bào tốt, có cấu trúc lỗ xốp đặc trưng, bền chắc, lượng tế bào bị rửa trôi không nhiều sau chu kỳ lên men và giữ được hoạt tính trong thời gian dài do không tiếp xúc với dung môi hữu cơ. e.Các phương pháp khác Phương pháp làm thay đổi nhiệt độ: huyền phù dung dịch chất mang và tế bào gel khi hạ nhiệt độ. Chất mang sử dụng: agar, gelatin. Phương pháp này không thích hợp với những tế bào nhạy với nhiệt. Phương pháp đóng rắn polimer: tế bào hòa với polimer lỏng rồi được nhỏ vào bình chất đóng rắn tạo ra hạt xúc tác như cellulose triaxetat. Phương pháp này không thích hợp với tế bào sống. 1.3.3.5.4. Ưu nhược điểm chung của phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong lòng chất mang. a.Ưu điểm -Có thể áp dụng cho nhiều loại tế bào vi sinh vật cố định trong cấu trúc gel polimer. -Mật độ tế bào cố định trong cấu trúc gel lớn. -Không có sự hình thành liên kết giữa tế bào vi sinh vật và chất mang mà tế bào chỉ bị nhốt bên trong, vì vậy protein của màng tế bào vi sinh vật không bị phá hủy. -Không có sự tương tác trực tiếp giữa tế bào vi sinh vật với dung môi hữu cơ nên ít gây ảnh hưởng đến sự sống và họat tính của tế bào. b.Nhược điểm -Tế bào vi sinh vật phân bố không đều trong gel vì vậy ảnh hưởng đến hiệu suất quá trình trao đổi chất. -Không thích hợp khi cơ chất là những phân tử lượng lớn vì khó khuếch tán được qua màng gel. - Một số chất mang có thể ảnh hưởng không tốt đến họat tính của tế bào vì có thể gây cản trở đến sự trao đổi chất của vi sinh vật. - Gel polimer cóthể bị phá hủy bởi tốc độ sinh trưởng của tế bào gây ảnh hưởng đến quá trình sản xúât. 1.3.3.6. Cố định tế bào không chất mang 1.3.3.6.1.Phương pháp liên kết chéo giữa các tế bào Đây là phương pháp liên kết các tế bào vi sinh vật riêng biệt thành 1 khối tế bào cố định nhờ các tác nhân lưỡng hoặc đa chức mà không sử dụng chất mang. Trong phương pháp này, thông qua 1 số hợp chất đặc biệt có khả năng hình thành các liên kết nối mạng, sẽ diễn ra phản ứng giữa tế bào hoặc các tthành phần của tế bào như enzyme với các họat chất này. Nhờ vậy, các tế bào sẽ liên kết với nhau tạo thành cấu trúc dạng hình viên. Ứng dụng nổi bật nhất của phương pháp này trong công nghiệp là cố định trực khuẩn Bacillus cogulans để sản xúât các dạng đồng phân của đường glucose. a.Ưu điểm - Điều kiện nhẹ nhàng, có khả năng kéo dài thời gian họat động của tế bào. - Làm tăng tính chống chịu của tế bào đối với các yếu tố làm biến tính. b.Nhược điểm - Đây là phương pháp có độ bền cơ học kém nhất. 1.3.3.6.2. Cố định tế bào vi sinh vật bằng màng chắn membrane Đây là phương pháp cố định trong các cơ chất có phân tử lượng lớn có thể thẩm thấu vào trong tế bào, các chất mang có thể tái sử dụng.Ở dạng membrane tế bào được cố định thông qua quá trình siêu lọc và vi lọc bằng màng membrane. Màng membrane được tạo ra là polimer có tính bán thấm với những kích thước lỗ đủ nhỏ chỉ cho cơ chất đi vào và sản phẩm đi ra mà tế bào vẫn bị nhốt trong đó. Trước khi tạo màng bao tế bào lại cần phải biết trọng lượng phân tử của tế bào để có thể tạo lỗ phù hợp trên màng. a.Ưu điểm -Mật độ tế bào cố định khá lớn. -Độ bền cơ học cao. -Có thể ứng dụng cho nhiều loại tế bào khác nhau. b.Nhược điểm -Độ bền cơ học kém. -Sự sinh trưởng của tế bào làm phá hủy màng chắn. 1.3.3.7. Giá thể bacterial cellulose (BC) a.Vi khuẩn sản xuất bacterial cellulose (BC) BC được tổng hợp bởi 1 số vi khuẩn. Cấu trúc BC ở mỗi loài tuy khác nhau nhưng con đường tổng hợp và cơ chế điều hòa tổng hợp BC ở mỗi loài có lẽ giống nhau. Các đặc điểm khác nhau thường là các đặc điểm vật lý của sản phẩm BC, như chiều dài chuỗi glucan, tính kết tinh và trạng thái kết tinh của nó. Trạng thái kết tinh khác nhau xácđịnh các tính chất vật lý khác nhau như độ bền, độ hòa tan trong các dung môi, tính chịu ảnh hưởng của các tác nhân gây đột biến. Trong các lòai có thể dùng sản xúât BC thì Acetobacter xylinum có khả năng tổng hợp BC hiệu quả nhất và được tập trung nghiên cứu nhiều nhất. Acetobacter xylinum có dạng hình que, thẳng hoặc hơi cong, có thể di động hoặc không, không sinh bào tử, Gram âm nhưng Gram của chúng có thể già đi hay do điều kiện môi trường. Acetobacter xylinum là vi khuẩn hiei khí bắt buộc, pH tối ưu 5,5, nhiệt độ tối ưu để phát triển là 25-30oC. Nguồn hydrocacbon mà Acetobacter xylinum là gluccse, saccharose, maltose, manitol. Môi trường thích hợp cho sự phát triển của Acetobacter xylinum là nước dừa già. b. Cấu trúc của BC Ngày nay nhờ vào sự phát triển của công nghệ hiện đại người ta đã xác định được cấu trúc của BC.BC có cấu trúc gần giống như cấu trúc của cellulose thực vật, là chuỗi polymer của các nhóm glucose liên kết với nhau qua các nối -1,4-glucan. Các chuỗi đơn phân tử glucan liên kết với nhau bằng liên kết Vander Waals. Qua liên kết hydro, các lớp đơn phân tử này sẽ kết hợp với nhau tạo nên cấu trúc tiền sợi với chiều rộng 1,5nm. Các sợi kết hợp với nhau tạo thành các bó. Các bó kết hợp với nhau tạo thành các dãy có kích thước từ 3-4nm và chiều rộng 70-80nm. Theo Zaaz (1977) thì kích thước của dãy là 3.2x133nm, theo Brown và cộng sự (1976) là 4.1x177nm. So với PC thì BC có độ polimer hóa cao hơn và kích thước nhỏ hơn. BC có độ polymer hóa từ 2000-6000, có khi lên đến 16000 hay 20000.Còn ở PC thì khả năng polymer hóa của nó chỉ từ 13000-14000. Trong tự nhiên, cellulose kết tinh ở hai dạng I vàII,đây là 2 dạng phổ biến nhất. Tùy thuộc vào điều kiện môi trường nuôi cấy và giống vi khuẩn mà dạng nào sẽ chiếm ưu thế nhưng thường trong tự nhiên dạng cellulose I được tổng hợp phổ biến hơn. Ngòai ra, cellulose I có thể chuyển thành cellulose II, nhưng cellulose II không thể chuyển ngược thành cellulose I được. c. Đặc điểm của BC BC là 1 sản phẩm polysaccharide ngọai bào của vi khuẩn. BC sẽ bao quanh và bám chặt lấy tế bào vi khuẩn khi nó được tổng hợp. BC có 1 số đặc điểm nổi bật thích hợp cho việc sử dụng làm giá thể cố định tế bào vi sinh vật. BC là dạng polimer có độ tinh sạch cao hơn các dạng cellulose khác, chúng không có ligin và hemicellulose. BC có thể bị phân hủy hòan tòan và có thể phục hồi. Sợi cellulose được tổng hợp có trọng lượng nhẹ, kíchthước ổn định và sức căng cao, có độ bền sinh học cao đặc biệt là cellulose I. Có khả năng giữ nước cao (99%). Trong điều kiện ngập nứơc, nước có thể vận chuyển xen vào các sợi cellulose. Lớp màng cellulose được tổng hợp trực tíêp. Đặc biệt vi khuẩn có thể tổng hợp được các loại màng mỏng và các sợi cực nhỏ. Trong cấu trúc BC có các trục đơn giúp cho lớp màng tạo thành trở nên mạnh hơn. Trong suốt quá trình nuôi cấy chúng ta có thể kiểm sóat được đặc điểm lý học của phân tử cellulose (trọng lượng phân tử và khả năng kết tinh) nhờ quan sát cấu trúc của chúng bằng cách cho thuớc nhuộm vào môi trường nuôi cấy. Có thể tác động lên các gel liên quan đến quá trình tổng hợp cellulose. Từ đó có thể kiểm soát các dạng kết tinh và trọng lượng phân tử của cellulose. Chương 2: VẬT LIỆU - NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1. Mẫu giấm Mẫu giấm thu thập từ ở Tp.HCM, Long An, Bạc Liêu. Số mẫu thu thập ở mỗi vùng o Long An : 2 mẫu o Bạc Liêu : 1 mẫu o Tp HCM : 7 mẫu 2.1.2. Môi trường nuôi cấy [6], [7], [8], [45].  MT1 : Môi trường Ethanol-Cao nấm men - Ethanol 20ml - Cao nấm men 10g - CaCO3 20g - Agar 20g - Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml (Ethanol cho vào sau khi hấp khử trùng)  MT2 : Môi trường làm giàu sinh khối - Glucose 10g - Cao nấm men 5g - Pepton 3g - Ethanol 5ml - Acid acetic 0,3ml - Dịch chiết khoai tây 10% 100ml - Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml (Khoai tây gọt vỏ rửa sạch, cân 10g, cắt lát mỏng, thêm vào 100ml nước, đun sôi 5 phút, lọc  dịch chiết khoai tây 10%)  MT3: Môi trường lên men dùng định tính acid acetic - Glucose 30g - KH2PO4 15g - (NH4)2SO4 15g - Ethanol 30ml - Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml  MT4 : Môi trường lên men dùng định lượng acid acetic - Ethanol 30ml - Glucose 5g - Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml - pH 4,5  MT5 :Môi trường nhân giống cấp I - Glucose 10g - Pepton 5g - KH2PO4 3g - MgSO4 3g - (NH4)2SO4 0,1g - Cao nấm men 5g - CH3COOH 0,05g - Ethanol 1ml - Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml  MT6 :Môi trường nhân giống cấp II -Glucose 5g - K2HPO4 0,1g - KH2PO4 0,1g - MgSO4 0,5g -(NH4)2SO4 0,1g -Cao nấm men 5g -CH3COOH 0,05g -Ethanol 5ml -Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml  MT7: Môi trường cao thịt- pepton dùng nuôi vi khuẩn Acetic để nhuộm Gram, quan sát hình dạng, kích thước tế bào. - Cao thịt 3g - Pepton 10g - NaCl 5g - Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml - pH 7,2  MT8: Môi trường khảo sát ảnh hưởng của pH lên sự tăng trưởng của vi khuẩn Acetic - Glucose 20g - Cao nấm men 5g - Pepton 3g - Ethanol 5ml - Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml  MT9: Môi trường khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tăng trưởng của vi khuẩn Acetic - Glucose 20g - Cao nấm men 5g - Pepton 3g - Ethanol 5ml - Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml  MT10 : Môi trường glutamate xác định khả năng phát triển của vi khuẩn - Sodium glutamate 5g - Glucose 10g - KH2PO4 1g - MgSO4.7H2O 0,2g - KCl 0,1g - Agar 20g - Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml - pH 7,2  MT11 : Môi trường mannitol xác định khả năng phát triển của vi khuẩn - Mannitol 25g - Cao nấm men 5g - Pepton 3g - Agar 20g - Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml - pH 6  MT 12: Môi trường thử khả năng tạo H2S - Cao thịt 3g - Pepton 10g - NaCl 5g - Na2S2O3 2,5g - Acetate chì 10% 5ml - Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml  MT13: Môi trường thử khả năng phân giải dextrin - Dextrin 20g - Cao nấm men 10g - Agar 20g - Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml  MT 14: Môi trường thử khả năng phân hủy canxi-lactate thành carbonate của vi khuẩn Acetic - Canxi-lactate 10g - Cao nấm men 10g - Agar 20g - Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml - pH 7  MT 15 : Môi trường thử khả năng phân giải gelatin của vi khuẩn Acetic - Gelatin 4g - Glucose 0,05g - Pepton 0,01g - NaCl 3g - K2HPO4 1.5g - KH2 PO4 1,5g - Agar 20g - Nước thịt 5ml - Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml (Hoà tan các muối vào 100ml nước cất. Gelatin được hoà tan riêng trong 400ml nước cất, bổ sung đường, pepton, nước thịt. Trộn 2 dung dịch trên với nhau rồi đun sôi vài phút. Agar được hoà tan riêng trong 500ml nước cất khác và trộn chung với các thành phần còn lại thành 1000ml môi trường).  MT 16: Môi trường thử khả năng tạo -pyrone - Glucose 30g - Cao nấm men 10g - CaCO3 20g - Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml  MT 17: Môi trường thử khả năng oxy hoá acetate hoặc lactate - Sodium acetate 2g - Cao nấm men 2g - Pepton 3g - Brothymol blu 0,02g - Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml - pH 6,4  MT 18:Môi trường lên men sản xuất Bacterial cellulose Môi trường nước dừa già - (NH4)2SO4 8g - (NH4)2HPO4 2g - Sucrose 20g - Nước dừa già 1000ml - pH=4,5 ( Được chỉnh bằng acid acetic đậm đặc ) 2.1.3. Thiết bị máy móc dùng cho quá trình thí nghiệm 1) Bếp từ NAMECO. NAMHONG MECHANICAL COMPANY. Made in VIETNAM 2) Cân kỹ thuật: AND EK – 600G. AC AC DAPTER DC 12 V MFD BY A&D CO. ,LTD 3) Cân phân tích: AND HR – 200G. AC AC DAPTER DC 12 V MFD BY A&D CO. ,LTD 4) Kính hiển vi : SELLER INSTRUMENT MICROSCOPE DIVISION ST.LOUIS, MO. 800-489-2282 5) Lò viba :MICROWAVE OVEN.SANYO. 6) Máy đo OD: THERMO ELECTRON CORPORATION. Made in USA 7) Máy đo pH: ACCUMET MODEL 15 pH METER.OSI – BP 124 – 78312 MAUREPAS CEDEX 8) Máy khuấy từ: SEM – PTV. LTD. Made by AUTRALIA. 9) Máy lắc ngang: 3006 GFL. Made by GERMANY 10) Tủ ấm 300C : PROLABO N0 32519 11) Tủ ấm 340C : PROLABO N0 32519 12) Tủ sấy và khử trùng dụng cụ: EASTOCEAN ZTD 98-A. 13) Tủ lạnh SANYO 14) Nồi hấp khử trùng 15) Tủ cấy vô trùng 16) Thiết bị sục khí : máy khúây từ, cá khuấy từ, thiết bị bơm oxy 17) Thiết bị lên men hồi lưu: thiết bị bơm oxy, máy bơm 18) Một số dụng cụ thí nghiệm khác như: petri, ống nghiệm, erlen, becher, buret, ống đong, pipet, pipetman, đèn cồn, que cấy…. 2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Thu thập mẫu giấm Để phân lập được các chủng lên men Acetic tốt, chúng tôi đã thu thập nhiều mẫu giấm từ nhiêu nơi khác nhau, đồng thời các mẫu giấm này phải đạt 2 chỉ tiêu: - Phải là giấm nuôi. - Phải có vị chua. 2.2.2. Khảo sát 1 số đặc tính của mẫu giấm 2.2.2.1. Xác định hàm lượng acid tổng Xác định hàm lượng acid tổng trong các mẫu giấm thu được bằng phương pháp chuẩn độ dùng NaOH 0,1N với phenoltalein 1% làm chỉ thị màu. Hàm lượng acid tổng (qui ra acid acetic) được tính theo công thức: ( V- V0)*x*0a(g/l) = 006*1000; Số ml dịch lên men chuẩn Trong đó: V: số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ số ml dịch lên men chuẩn. V0 : số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ mẫu thử không. x :số hiệu chỉnh NaOH 0,1N so với acid oxalic 0,1N. 0,006 : Số mg acid acetic tương ứng 1ml NaOH 0,1N. 2.2.2.2. Xác định pH Xác định pH của mẫu giấm bằng máy đo pH. 2.2.2.3. Phân lập và khảo sát một số đặc điểm phân loại. 2.2.2.3.1. Phân lập Trong môi trường có sử dụng nguồn cacrbon là ethanol và có sự hiện diện của CaCO3, (MT1) các khuẩn lạc tạo được vòng phân giải xung quanh (làm tan CaCO3) có thể được xem là dự tuyển của vi khuẩn sinh acid acetic. Tiến hành pha loãng mẫu giấm ở các độ pha loãng khác nhau: 10-1, 10-2, 10-3 ,10-4,10-5 ,10-6. Ủ trong tủ ấm 300C trong 3 ngày. Chọn những khuẩn lạc riêng rẽ có vòng làm tan CaCO3. Làm thuần bằng cách cấy ria nhiều lần cho đến khi quan sát chỉ còn 1 loại khuẩn lạc trên môi trường. Kiểm tra độ thuần khiết bằng cách quan sát hình dạng khuẩn lạc, nhuộm Gram. 2.2.2.3.2..Khảo sát đặc điểm phân loại  Dạng khuẩn lạc Tiến hành cấy vi khuẩn phân lập được trên bề mặt môi trường ethanol- cao nấm men có CaCO3 (MT1) sao cho có được những khuẩn lạc tách rời. Nuôi ở nhiệt độ phòng và theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc. Sau 3 ngày quan sát và mô tả đặc điểm của khuẩn lạc.  Hình thái vi khuẩn  Khả năng di động Quan sát khả năng di động của vi khuẩn dưới dạng tiêu bản giọt treo. Tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường làm giàu sinh khối (MT2)  Nhuộm Gram Tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường cao thịt-pepton (MT7) trong 16-24 giờ. Hút 1ml dịch vi khuẩn pha loãng trong nước cất vô trùng để mật độ tế bào trong thị trường kính hiển vi vừa phải và dễ quan sát. Làm vết bôi vi khuẩn với đối chứng là Bacillus Gram dương, E.coli Gram âm. Sau khi nhuộm, soi kính với vật kính dầu 100X.  Đặc điểm sinh lý, sinh hoá  Khả năng oxy hoá ethanol thành acid acetic  Định tính acid acetic tạo thành Nuôi các chủng khảo sát trên môi trường lên men định tính (MT3) ở nhiệt độ phòng trong 4 ngày. Cho vào ống nghiệm 3ml dịch lên men và 1ml dung dịch NaOH . Nhỏ vào ống nghiệm vài giọt dung dịch FeCl3 5%, lắc đều ống nghiệm và đun sôi trên ngọn đèn cồn. Nếu dung dịch có acid acetic thì sẽ có màu đỏ thẫm do sắt acetate tạo thành. Đối chứng dương là ống đựng acid acetic chuẩn, đối chứng âm là môi trường không nuôi cấy vi khuẩn. Phản ứng diễn ra theo phương trình sau: CH3COOH +NaOH  CH3COONa +H2O CH3COONa + FeCl3  Fe(CH3COO)3 +3NaCl Màu đỏ thẫm  Định lượng acid acetic tạo thành Sau khi nuôi các chủng khảo sát trên môi trường tăng sinh (MT2) rồi chuyển sang môi trường nhân giống cấp 1 (MT5), môi trường nhân giống cấp 2 (MT6). Sau 7 ngày định lượng acid acetic tạo ra theo phương pháp xác định acid tổng.  Khảo sát đặc tính sinh catalase Nguyên tắc Catalase xúc tác sự phân giải H2O2 thành H2O và O2. Nếu vi khuẩn khảo sát có khả năng tạo catalase thì khi nhỏ H2O2 vào dịch nuôi cấy vi khuẩn đó, H2O2 bị phân giải thành H2O và O2, gây hiện tượng sủi bọt. O2 2H2O2 2 H2O Catalase Thực hiện Nuôi cấy các chủng khảo sát trong ống nghiệm chứa môi trường tăng sinh khối (MT2) trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Nhỏ 1 giọt dịch nuôi cấy lên tấm lam và nhỏ từ từ H2O2 vào. Quan sát và ghi nhận hiện tượng.  Khả năng tạo H2S Đây là đặc điểm của vi sinh vật có khả năng sử dụng các amino acid trong môi trường có Thiosulfate Natri. Chúng tạo thành những đường cấy màu đen do tạo được sulfua chì theo phản ứng sau: COOH.CH.NH2.CH2S.S.CH2.CH.NH2.COOH + H2 + 4H  2H2S + 2NH3 + 2CH3COOH+ 2HCOOH H2S + Pb(CH3COO)2  PbS + 2CH3COOH Sulfua chì màu đen Thực hiện Cấy chủng khảo sát lên ống thạch đứng chứa môi trường thử khả năng tạo H2S (MT13) bằng những đường cấy thẳng, sâu, gần sát thành ống nghiệm. Ủ ở nhiệt độ phòng, sau 2 ngày, quan sát những đường cấy, nếu vi khuẩn tạo H2S thì đường cấy sẽ có màu đen do tạo sulfua chì.  Khả năng oxy hoá acetate hoặc lactate Tiến hành theo phương pháp của Leifson. Đây là phương pháp nhanh và dễ dàng nhất để phân loại vi khuẩn Acetic đến cấp giống. Nếu chủng khảo sát có khả năng oxy hoá acetate hoặc lactate thì chủng đó thuộc giống Acetobacter còn ngược lại chủng đó thuộc giống Gluconobacter . Nguyên tắc Sử dụng môi trường sodium acetate hoặc sodium lactate có bromothymol-blue làm chất chỉ thị màu. Chỉ thị màu này có pH nhạy cảm trong khoảng pH 5,6-7,4 và biến đổi màu từ màu vàng sang xanh dương. Khi acetate hoặc lactate bị oxy hoá thì môi trường trở nên kiềm tính. Bằng cách quan sát sự chuyển màu của môi trường (vàng chuyển sang xanh dương) cho phép đánh giá được khả năng oxy hoá acetate hoặc lactate của chủng vi sinh vật khảo sát. Thực hiện Cấy chủng khảo sát vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường sodium acetate. Nuôi ở nhiệt độ 300C sau 7 ngày quan sát sự chuyển màu của môi trường. 2.2.3. Khảo sát đặc điểm lên men acetic 2.2.3.1.Chọn giống Trong quá trình lên men định lượng acid acetic tạo ra chúng tôi xác định được 2 chủng tạo acid acetic cao nhất là chủng A3 và A6. Do đó những thí nghiệm sau chúng tôi quyết định chọn 2 chủng này để khảo sát. 2.2.3.2. Chọn môi trường  Xác định pH thích hợp Tiến hành nuôi các chủng khảo sát trong môi trường tăng sinh khối (MT2) trong 24 giờ. Đối với mỗi chủng khảo sát huyền phù thật kỹ ống nghiệm chứa dịch nuôi cấy. Sau đó dùng pipetman hút chính xác 1 lượng dịch nuôi cấy (100l) phân vào các ống nghiệm chứa sẵn môi trường khảo sát ở các pH (MT8) tương ứng: 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 6,8. Nuôi các chủng cần khảo sát trong 4 ngày ở 300C, đo OD ở bước sóng 660nm và ghi nhận kết quả.  Xác định nhiệt độ thích hợp Tiến hành nuôi cấy các chủng khảo sát trên môi trường tăng sinh khối (MT2) trong 24giờ. Đối với mỗi chủng khảo sát huyền phù thật kỹ ống nghiệm chứa dịch nuôi cấy. Sau đó dùng pipetman hút chính xác 1 lượng dịch nuôi cấy (100l) phân vào các ống nghiệm chứa sẵn môi trường khảo sát nhiệt độ (MT 9 ) tương ứng là 150C, 180C, 250C , 300C ,350C, 370C, 400C, 450C. Đo OD ở bước sóng 660nm và ghi nhận kết quả.  Mật độ giống ban đầu thích hợp cho quá trình lên men Nuôi các chủng khảo sát trên môi trường tăng sinh và nhân giống cấp I, II và chuyển vào môi trường định lượng. Sau đó định hàm lượng acid tạo thành bằng phương pháp xác định acid tổng.  Xác định nồng độ ethanol thích hợp -Nuôi cấy chủng vi khuẩn khảo sát ở môi trường tăng sinh và nhân giống cấp I, II. Chuyển dịch nuôi cấy vào môi trường định lượng có nồng độ ethanol tương ứng là 3%, 4%, 5%, 8%, 10%, 12%. -Tiến hành thí nghiệm 2 lô: 1 lô hấp khử trùng và 1 lô không hấp khử trùng. Môi trường 1: hấp khử trùng; Môi trường 2 : không hấp khử trùng. (Mục đích thực hiện môi trường không hấp khử trùng để xem giống có khả năng chống được sự nhiễm khuẩn hay không). -Xác định hàm lượng acid sinh ra bằng phương pháp xác định acid tổng và ghi nhận kết quả. -Sau khi xác định được nồng độ ethanol ban đầu thích hợp cho quá trình lên men chúng tôi sẽ sử dụng nồng độ này cho các thí nghiệm tiếp theo.  Xác định thời gian nuôi cấy thích hợp - Cấy chủng khảo sát vào các erlen chứa môi trường tăng sinh khối (MT2) nuôi cấy lắc. Đo mật độ tế bào của mỗi chủng ở bước sóng 660nm cứ 24 giờ thì đo cho đến khi giá trị OD giảm. Ghi nhận kết quả. - Cho 25% dịch tăng sinh có nuôi cấy chủng vi khuẩn khảo sát vào erlen chứa môi trường nhân giống I (MT5), nuôi cấy lắc. Đo mật độ tế bào của mỗi chủng ở bước sóng 660nm, cứ 24 giờ thì đo cho đến khi giá trị OD giảm. Ghi nhận kết quả.  Xác định mật độ vi khuẩn phát triển trong môi trường nhân giống II để chuẩn bị lên men - Cho 25% dịch nhân giống I có nuôi cấy chủng vi khuẩn khảo sát vào erlen chứa môi trường nhân giống II (MT6), nuôi cấy lắc trong khoảng thời gian thích hợp. Để tính số vi khuẩn trong thể tích khảo sát ta cần đếm số khuẩn lạc trên đĩa petri. Đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch  Nguyên tắc: Mỗi sinh vật đứng riêng rẽ sẽ phát triển thành một khuẩn lạc trên môi trường thích hợp. Đếm số khuẩn lạc ta có thể tính ra số vi sinh vật trong 1 thể tích cần nghiên cứu.  Thực hiện: Pha loãng dịch cần đếm bằng cách dùng pipetman hút 1ml dịch vào 9ml nước cất vô trùng. Tùy độ đục của dịch nuôi cấy mà pha loãng ở nhiều nồng độ khác nhau. Sau đó trãi 0,1ml dịch pha loãng khác nhau lên hộp petri chứa môi trường Ethanol-Cao nấm men . Ủ ở 300C sau 48 giờ đếm số khuẩn lạc trên các đĩa (hai đĩa trãi cùng nồng độ pha loãng). Đếm số khuẩn lạc trên những đĩa có từ 30-300 khuẩn lạc để tính kết quả. Tổng vi khuẩn hiếu khí trong 1ml mẫu được tính theo công thức sau: A(CFU/ml) = Error! Trong đó : N: tổng số khuẩn lạc đếm được ni : số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi nồng độ pha loãng V: thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa fi : độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm 2.2.4. Các phương pháp nuôi cấy 2.2.4.1. Phương pháp nuôi cấy tĩnh Chuyển 25% dịch nhân giống II của chủng khảo sát vào môi trường định lượng,nuôi cấy tĩnh. Đo hàm lượng acid tổng tạo thành bằng phương pháp chuẩn độ bằng NaOH 0,1N với phenoltalein làm chỉ thị màu. 2.2.4.2. Phương pháp nuôi cấy bằng thiết bị lên men sục khí Chuyển 25% dịch nhân giống II vào môi trường định lượng, nuôi cấy bằng thiết bị lên men sục khí. Đo hàm lượng acid tổng tạo thành bằng phương pháp chuẩn độ bằng NaOH 0,1N với phenoltalein làm chỉ thị màu. Mỗi lần đo cách nhau 24giờ, nuôi cấy cho đến khi hàm lượng acid acetic sinh ra bắt đầu giảm. Mô tả thiết bị lên men sục khí Thiết bị lên men sục khí được cấu tạo như sau: Bình lên men (erlen 1000ml); Trong bình có 1 cá khuấy từ và bình đặt trên máy khuấy từ; Không khí từ bên ngoài vào bình lên men được vô trùng nhờ đi qua 1 phễu lọc, phễu lọc được nối với máy sục khí mục đích cung cấp oxy để quá trình oxy hoá diễn ra nhanh; Ống thoát khí giúp không khí từ trong bình lên men thoát ra bên ngoài môi trường; Ngoài ra còn có ống thu dịch lên men, ống tiếp nguyên liệu trong quá trình lên men. Hình 2.1 :Sơ đồ thiết bị lên men sục khí 6: Thiết bị lọc khí. 1. Bình lên men 7: Ống thoát khí. 2: Cá khuấy từ. 8: Ống thu dịch lên men. 3: Máy khuấy từ. 4: Máy sục khí. 9: Ống tiếp môi trường. 5: Ống thu khí. 2.2.4.3. Phương pháp nuôi cấy bằng thiết bị lên men hồi lưu  Mô tả thiết bị lên men hồi lưu Thiết bị gồm có 2 phần Phần trên : là thùng lên men được thiết kế theo phương pháp nhanh với mục đích tạo bề mặt tiếp xúc lớn hơn giữa vi khuẩn acetic với không khí để 2 7 1 3 8 9 5 4 6 oxy hóa rượu. Dịch lên men được chuyển từ trên xuống và không khí được chuyển từ dưới lên. Phản ứng sinh học được thực hiện trong khối tế bào cố định. Trong thiết bị này dịch lên men được cho thấm dần qua giá thể BC và được tu