Luận văn Một số yếu tố ảnh hưởng kết quả nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng và phản ứng hoạt hóa tinh trùng chó

ình ứng dụng nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng 2.8.1. Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng bò và đồng nuôi cấy với phôi Năm 1992, Xu và ctv đã thành công trong việc tạo phôi bò in vitro bằng phƣơng pháp đồng nuôi cấy giữa phôi bò và tế bào biểu mô ống dẫn trứng của bò 12 (bovine oviductal epithelial cells, BOEC). BOEC này đƣợc nuôi cấy theo phƣơng pháp nuôi cấy tế bào từ mảnh mô, những mảnh BOEC đƣợc tách bằng cách dùng 2 kẹp vuốt mạnh ống dẫn trứng. Sau một đêm nuôi cấy BOEC trong môi trƣờng nuôi cấy, hình ảnh những mảnh BOEC trông giống nhƣ cấu trúc hình sâu (worm-like). Bởi vì trong mảnh BOEC có một số tế bào chết và tế bào sống đƣợc thấy rất rõ khi quan sát dƣới kính hiển vi, thêm vào đó là sự xuất hiện và chuyển động của những lông rung của BOEC. Đến ngày nuôi cấy thứ ba một số BOEC có khả năng hình thành lớp đơn (monolayer) trông giống nhƣ cấu trúc bóng nƣớc (vesicle-like). Sự tồn tại của BOEC đƣợc xác định qua sự chuyển động của lông rung, lông rung này vẫn đƣợc thấy đến ngày nuôi cấy thứ 10. Một số tế bào bắt đầu bám vào đáy đĩa vào ngày thứ tƣ hoặc thứ năm. Nhƣng chúng không hình thành lớp đơn phân tử (tạo vesicle-like), thậm chí đến ngày thứ 10. Những tế bào và những “bóng nƣớc” (vesicle-like) tồn tại đến 7 tuần nuôi cấy. 2.8.2. Đồng nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng với trứng chó Năm 2002, Luisa Bogliolo và ctv đã thành công trong việc làm tăng tỉ lệ chín của trứng chó in vitro bằng phƣơng pháp đồng nuôi cấy giữa trứng và tế bào biểu mô ống dẫn trứng của chó. Những tế bào biểu mô này đƣợc tách bằng cách dùng dao cạo trên bề mặt trong của ống dẫn trứng và chúng đƣợc tạo huyễn dịch trong môi trƣờng nuôi cấy chín trứng với nồng độ xấp xỉ 104 tế bào/ml. Sau 48 giờ đồng nuôi cấy, tỉ lệ phần trăm trứng chín đến giai đoạn MII mà không đồng nuôi cấy với tế bào biểu mô là 4%. Khi đồng nuôi cấy với tế bào biểu mô của đoạn loa và đoạn bóng của ống dẫn trứng, tỉ lệ phần trăm trứng chín đến giai đoạn MII tƣơng ứng là 15,6% và 16,7%. 2.9. Tinh trùng 2.9.1. Sơ lƣợc quá trình sản sinh tinh trùng Theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt (1997), sự sản sinh tinh trùng xảy ra khi bắt đầu thành thục tính dục. Đó là quá trình biệt hóa tế bào, bắt đầu từ tế bào mầm đến khi sản sinh ra các tinh trùng. Theo Phan Trƣờng Duyệt và Phan Khanh Vy (2001), quá trình này có thể chia làm 3 giai đoạn: giai đoạn tạo tế bào mầm (giao tử), biệt hóa chức năng để thụ tinh (phân bào giảm nhiễm) và biệt hóa về cấu trúc để có khả năng di chuyển chủ động. - Sự tạo giao tử: trong giai đoạn đầu của bào thai, các tế bào mầm di chuyển đến tuyến sinh dục đang phát triển. Trong trƣờng hợp sinh tinh, các tế bào này vào 13 trong ống tinh của tinh hoàn. Những tế bào mầm này chƣa trƣởng thành gọi là tinh nguyên bào, sẽ phát triển bằng cách phân bào nguyên nhiễm. Tinh nguyên bào nằm dọc bờ ngoài của ống tinh, gần với các tế bào đệm (tế bào Sertoli). Các tế bào Sertoli tồn tại trong suốt cuộc đời tính dục và số lƣợng của chúng là nhân tố hạn chế việc sản sinh tinh trùng. Trƣớc tuổi thành thục tính dục, các tinh nguyên bào không hoạt động. Từ tuổi thành thục sinh dục trở đi, tinh nguyên bào phân chia liên tục bằng quá trình phân bào nguyên nhiễm tạo nên nhiều tế bào và cung cấp liên tục các tế bào mới (tinh trùng). - Sự biệt hóa về chức năng: một vài tế bào dừng phân chia và biệt hóa thành tế bào tinh trùng nguyên thủy. Mỗi tế bào tinh trùng nguyên thủy trải qua quá trình phân bào giảm nhiễm. Phân chia giảm nhiễm đầu tiên tạo ra 2 tế bào tinh trùng thứ cấp, khi quá trình phân chia giảm nhiễm thứ 2 hoàn thành tạo nên 4 tiền tinh trùng đơn bội. Sự sinh tinh nhạy cảm với điều kiện môi trƣờng, đặc biệt là sự thay đổi về nhiệt độ. Nhiệt độ thích hợp là khoảng 2 độ dƣới nhiệt độ cơ thể. - Sự biệt hóa về cấu trúc: các tiền tinh trùng biệt hóa thành tinh trùng trƣởng thành. Quá trình biệt hóa này gọi là hiện tƣợng sinh tinh. Các tiền tinh trùng dài ra phát triển thành đuôi nối với nhau và kết nối với lớp dƣới của tế bào Sertoli qua các cầu nối bào tƣơng. Các tế bào Sertoli giữ vai trò dinh dƣỡng, nuôi các tiền tinh trùng (tinh tử) cho đến khi thành tinh trùng (Nguyễn Tƣờng Anh, 2002). Chỉ sau khi sự biệt hóa hoàn chỉnh, các tinh trùng mới đƣợc giải phóng vào ống tinh. Cuối cùng tinh trùng vào mào tinh (mào tinh là những ống tinh cuộn lại, nằm sát tinh hoàn) và tiếp tục trƣởng thành trong một khoảng thời gian nhất định. Độ dài thời gian của quá trình sinh tinh trùng là ổn định cho mỗi loài. 2.9.2. Cấu tạo của tinh trùng Theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt (1997), nhƣ những tế bào khác, tinh trùng cũng đƣợc bao bọc bởi màng tế bào và cũng có các cấu trúc bên trong (nhân, ty thể…). Cấu tạo gồm 3 phần (trích dẫn từ Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005): phần đầu chứa vật chất di truyền, phần cổ và đuôi có liên quan đến chức năng vận động. Đầu mang acrosome nổi rõ và đƣợc nối chặt với phần cổ, do đó hiện tƣợng mất đầu trên tinh trùng chó xảy ra với tần số thấp hơn so với ngựa và các loài nhai lại. Tinh trùng chó có hình dạng đặc thù khác biệt so với các loài khác. Nó có dạng sợi dài, đƣờng kính của đầu hơi nhỏ, còn đuôi thì khá dài, chiều dài toàn bộ khoảng 50 - 60 µm. 14 - Đầu tinh trùng: dài khoảng 5,6 µm, có 2 phần gồm nhân và thể chóp acrosome. Trong nhân chứa chromatin đậm đặc, đó là DNA liên kết với 1 protein, đặc biệt là những phân tử DNP (deoxyribonucleoprotein) xếp song song và gắn rất chặt chẽ với nhau làm cho cấu trúc của nhân gần nhƣ cấu trúc của tinh thể. Nhân chiếm 65% thể tích của đầu tinh trùng. Số nhiễm sắc thể trong tinh trùng là đơn bội, không có RNA. Phần trƣớc đƣợc bao bọc bằng một acrosome, có hình dạng nhƣ 1 cái túi mỏng gồm 2 lớp màng bọc sát vào nhân. Trong acrosome có chứa các enzyme thủy phân nhƣ: hyaluronidase, phosphatase acid, esterase và các hydrolase acid. Chúng có liên quan đến quá trình xâm nhập của tinh trùng qua màng trứng vào bên trong để thụ tinh. - Cổ tinh trùng: là phần rất ngắn, dài 1 µm, hơi co lại và cắm vào hõm ở đáy phía sau của nhân. Tế bào chất ở cổ có chứa 2 trung tử: trung tử gần nằm sát nhân, trung tử xa nằm xa nhân hơn và từ đó bắt nguồn của 9 cặp sợi trục kéo dài đến tận đuôi tinh trùng. - Đuôi tinh trùng: dài khoảng 49,26 - 50,26 µm, đƣợc bao bọc bằng 1 màng chung và đƣợc chia thành 3 phần: đoạn giữa, đoạn chính và chót đuôi. Đoạn giữa nằm từ cổ đến vòng nhẫn Jensen, có tiết diện lớn hơn đoạn chính và chót đuôi. Lõi của đoạn giữa và toàn bộ chiều dài của đuôi là một tập hợp bó trục. Tập hợp này gồm 9 cặp vi ống ngoài xếp đồng tâm xung quanh 2 vi ống đơn ở trung tâm và chúng đƣợc bao quanh bằng 9 sợi chắc, dày. Bó trục và những sợi ƣa áp suất của đoạn giữa đƣợc phủ bên ngoài bằng những ty thể. Bọc ty thể chứa các enzyme oxy hóa và oxyphosphoryl hóa. Trong đoạn giữa cũng có nhiều chất dự trữ năng lƣợng: phospholipid, lecithin, plasmalogen… Vì vậy, ty thể đƣợc xem nhƣ nguồn phát sinh năng lƣợng cần thiết cho hoạt động của tinh trùng. Đoạn chính là đoạn dài nhất của đuôi tinh trùng, bắt đầu từ vòng nhẫn Jensen kéo dài đến chỗ tiếp giáp với chót đuôi. Khác với đoạn giữa, đoạn này không có bọc ty thể. Một vỏ bọc gồm những sợi chắc phủ bên ngoài đoạn chính và đoạn giữa có vai trò duy trì khả năng ổn định cho các yếu tố co rút của đuôi. Chót đuôi là phần tận cùng, ngắn nhất của đuôi. Nó chỉ gồm những sợi của bó trục trung tâm và đƣợc bao bọc bằng màng tế bào. 2.9.3. Đặc tính của tinh trùng Theo Trịnh Bỉnh Duy (2001), trong ống sinh tinh, tinh trùng có thể sống vài tuần nhƣng khi đƣợc phóng ra ngoài, đời sống tối đa chỉ từ 24 - 48 giờ. Khi trữ ở nhiệt độ thấp, chuyển hóa giảm nên thời gian sống của tinh trùng kéo dài hơn. 15 Theo Trần Tiến Dũng (2002), tinh trùng có 5 đặc tính: tính chuyển động về phía trƣớc, tính lội ngƣợc dòng nƣớc, tính tiếp xúc với vật lạ, tính tiếp xúc với hoá chất và tính tiếp xúc với điện. Tinh trùng sống thì luôn luôn chuyển động. Đuôi ngoằn ngoèo uốn khúc chuyển động gây một xung động để tự tiến tới trƣớc. Ngoài ra, tinh trùng có đầu giống hình quả lê nên tự nó chuyển động xung quanh trục của thân nó. Sự rung động của đuôi kết hợp với sự xoay quanh của trục giữa làm cho tinh trùng vận động tiến thẳng tới trƣớc. Tốc độ tiến thẳng của tinh trùng phụ thuộc vào các điều kiện nội tại và ngoại cảnh nhƣ: niêm dịch ở đƣờng sinh dục cái tiết ra nhiều hay ít, phƣơng thức phóng tinh của con đực và độ co bóp của sừng tử cung, ống dẫn trứng. Tinh trùng chuyển động nhờ đuôi lái nên nó có thể chuyển động ngƣợc dòng nƣớc và cũng có xu hƣớng lội ngƣợc dòng nƣớc, ngƣợc với trọng lực của giọt tinh dịch. Đối với một vật lạ, tinh trùng có đặc tính vây xung quanh vật lạ ấy. Do đó tinh trùng vào đến ống dẫn trứng, gặp tế bào trứng thì tinh trùng tập trung xung quanh tế bào trứng và tìm nơi lõm của tế bào trứng để đi vào. Ống dẫn trứng tiết ra chất hóa học, kích thích tinh trùng hƣng phấn, làm tinh trùng tập trung lại và tiến đến tế bào trứng. Chất hóa học này gọi là chất fertilizin. Ngoài ra trong ống dẫn trứng hay tử cung có một điện thế mà bản thân tinh trùng cũng mang điện nên cũng có điện thế, đặc tính của dòng điện chạy từ cao đến thấp cho nên tinh trùng lội có phƣơng hƣớng nhất định. 2.9.4. Sự vận chuyển tinh trùng trong đƣờng sinh dục cái Sự vận chuyển của tinh trùng trong đƣờng sinh dục cái đƣợc ghi nhận gồm 3 giai đoạn (theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt, 1997): vận chuyển nhanh, thành lập các ổ chứa và phóng thích chậm, kéo dài. Ngay sau khi đƣợc phóng thích, tinh trùng di chuyển nhanh chóng nhờ vào khả năng hoạt động của chúng cũng nhƣ nhờ có hoạt động co rút tăng lên của lớp cơ tử cung và màng treo ống dẫn trứng. Thời gian của giai đoạn vận chuyển nhanh này kéo dài khoảng 2 – 10 phút. Khi di chuyển, tinh trùng đƣợc tách khỏi tinh thanh và hoà vào dịch tiết của đƣờng sinh dục cái. Phần lớn tinh trùng đƣợc giữ lại trong những nếp màng nhầy phức tạp của các hốc trong cổ tử cung, thiết lập những ổ chứa tinh trùng. Ở loài chó, ổ chứa tinh trùng khu trú trong các tuyến nội mạc tử cung. Sau khi đã thiết lập đủ các ổ chứa tinh trùng trong đƣờng sinh dục, tinh trùng đƣợc phóng thích liên tiếp trong thời gian dài. Sự phóng thích chậm rãi này đảm bảo cho tinh trùng có khả năng liên tục tiến vào ống dẫn trứng để thụ tinh trứng. Tốc độ và kiểu hoạt động của tinh trùng đƣợc thay đổi khi tinh trùng 16 vận chuyển qua các bộ phận khác nhau của đƣờng sinh dục cái. Sự tăng hoạt hóa của hoạt động tinh trùng xảy ra chủ yếu trong ống dẫn trứng vào lúc sắp rụng trứng, đƣợc kích thích nhờ dịch của đoạn eo và đoạn bóng của ống dẫn trứng. Trong tử cung và dịch ống dẫn trứng tỉ lệ tinh trùng kỳ hình thấp hơn so với trong tinh dịch nguyên. Trong quá trình vận chuyển, một số tinh trùng bị thực bào và bị thất thoát vào trong xoang bụng. Trong thời gian lƣu trú lại nhiều giờ trong đƣờng sinh dục cái, màng tinh trùng trải qua những thay đổi quan trọng nhƣ: những protein cố định trên bề mặt màng sinh chất bằng những mối nối không đồng hóa trị đều đƣợc nới lỏng (theo Villaroya và Scholler, 1987); một số protein cấu trúc (hoặc protein từ dịch hoàn phụ và đƣợc gắn vào màng) bị giảm khối lƣợng phân tử (Esbenshade và Clegg, 1980); các protein có thể di chuyển và phân bố lại một cách cục bộ, hình thành nên những diện tích nhỏ thiếu vắng các protein, là giai đoạn cần thiết cho sự phối hợp áp vào nhau của màng sinh chất và màng ngoài acrosome; cuối cùng là sự thất thoát cholesterol của màng sinh chất và màng ngoài acrosome. Sự phân bố lại các protein của màng sinh chất quanh acrosome và những thay đổi trong thành phần các lipid này có khả năng làm rách acrosome. 2.10. Môi trƣờng pha loãng – bảo quản tinh trùng chó 2.10.1. Các yếu tố ảnh hƣởng sự tồn tại của tinh trùng - Vai trò của nƣớc cất: trong môi trƣờng pha loãng tinh dịch, các chỉ tiêu của nƣớc cất nhƣ khả năng tích ion, tổng vật chất khô, tổng lƣợng vi khuẩn… sẽ ảnh hƣởng rất lớn đến sức sống của tinh trùng (trích dẫn từ Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005). Theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt (1997), tinh dịch heo đƣợc pha loãng trong môi trƣờng bảo quản với nƣớc cất khử ion, thẩm thấu ngƣợc và tiệt trùng bằng tia cực tím, đã cho kết quả bảo tồn trên 5 ngày; ngoài ra, hoạt lực và sức sống tinh trùng tốt hơn so với dùng nƣớc cất thƣờng và nƣớc cất khử ion. - Chất điện giải và không điện giải trong môi trƣờng: theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt (1997), chất không điện giải (nhƣ các loại đƣờng) có tác dụng làm giảm độ dẫn điện của môi trƣờng, “bảo vệ” cho tinh trùng tránh đƣợc hiện tƣợng mất điện tích trên bề mặt tinh trùng. Nhờ đó, ngăn ngừa đƣợc hiện tƣợng tụ dính của tinh trùng, giúp cho tinh trùng duy trì sức sống thuận lợi hơn. Ngoài ra, chất không điện giải còn giữ vai trò chất khử, ngăn ngừa đƣợc sự oxy hóa của oxygen. Khi pha loãng 17 bằng những dung dịch đƣờng thì hạn chế sự sinh sản của các vi khuẩn gây mủ và tăng độ nhớt của môi trƣờng. Chất điện giải là các cation hóa trị 2 (Ca, Mg, St, Ba) làm cho tinh trùng tụ dính lại và cation hóa trị 3, 4 ( Al, Fe, Ta) làm cho tinh dịch đông lại, tinh trùng chết nhanh chóng. Ngƣợc lại, các anion có mối tƣơng quan thuận: anion hóa trị 2 tác động lên tinh trùng tốt hơn so với anion hoá trị 1, còn anion hoá trị 3 lại càng tốt hơn. - Tác động của pH (trích dẫn từ Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005): tinh dịch chó có pH hơi toan tính biến động từ 6,5 – 6,8. Ở pH này, sức hoạt động của tinh trùng bị ức chế nên thời gian sống lâu hơn. Nếu môi trƣờng hơi kiềm pH từ 7,0 – 7,5 (theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt, 1997) thì sức hoạt động của tinh trùng đƣợc tăng cƣờng nên thời gian sống ít hơn. Để môi trƣờng có khả năng duy trì một cách ổn định pH ở mức thích hợp, ngƣời ta thƣờng đƣa vào môi trƣờng những chất có năng lực đệm nhƣ: bicarbonate, citrate, phosphate… - Áp suất thẩm thấu (trích dẫn từ Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005): phụ thuộc vào nồng độ hòa tan của các phân tử và các ion trong môi trƣờng. Theo Iguer và Verstegen (2001) áp suất thẩm thấu của tinh dịch chó dao động từ 290 – 460 mOsm. - Theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt (1997), vai trò của chất kháng sinh trong môi trƣờng pha loãng tinh trùng là hạn chế tác hại của vi khuẩn. Theo Hoàng Tích Huyền và ctv (2001), kháng sinh penicillin thuộc nhóm β-lactam tạo phức “nhầm” với transpeptidase (phức bền và không phục hồi). Sự tạo phức này làm vi khuẩn không tạo đƣợc vách. Vì vách vi khuẩn Gr + (và một phần của vi khuẩn Gr -) là mạng lƣới dày đặc các peptidoglycan nối với nhau, mà xúc tác cho sự nối peptidoglycan là các enzyme transpeptidase và carboxypeptidase. Nhƣ vậy, penicillin có tác dụng tốt đối với vi khuẩn Gr+. Streptomycin và gentamycin thuộc nhóm amynoglycosid, diệt vi khuẩn bằng cách ức chế tổng hợp vi khuẩn ở mức ribosome. Streptomycin gắn vào tiểu phần 30S của ribosome và một số aminoglycosid khác có thể tác động lên cả tiểu phần 50S. Aminoglycosid có phổ tác dụng rộng, chủ yếu trên vi khuẩn Gr- và có tác dụng vừa phải đối với tụ cầu. Theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt (1997), streptomycin có độc tính cao hơn penicillin nên streptomycin có một phần nào đó gây tác hại đến sức sống của tinh trùng. Trong việc bảo quản tinh dịch chó hiện nay các tác giả vẫn thƣờng sử dụng kết hợp 2 kháng sinh là penicillin và streptomycin (trích dẫn từ Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005). Vì penicillin cản 18 trở tạo vách vi khuẩn, tạo điều kiện để streptomycin dễ thấm qua màng và vào tác động lên ribosome của vi khuẩn (Hoàng Tích Huyền và ctv, 2001). - Vai trò của lòng đỏ trứng: theo Milônanôp (1962), lòng đỏ trứng có lƣợng anion nhiều nên lòng đỏ trứng thƣờng có pH toan tính từ 6 – 6,7. Ông còn nhận định, khi cho citrate natri vào môi trƣờng có lòng đỏ trứng gà sẽ làm tăng độ nhớt của môi trƣờng giúp cho tinh trùng ít bị dao động trong quá trình vận chuyển và tránh sốc khi hạ nhiệt độ. Ngoài ra, lòng đỏ trứng còn có năng lực đệm tốt vì hàm lƣợng PO4 3- rất cao. Lòng đỏ trứng chứa 32% lipid, 16,6% protein, 1% glucid có tác dụng cung cấp dƣỡng chất cho tinh trùng, ngăn ngừa tinh trùng tiêu thụ lipid của bản thân vì trong quá trình sống tiềm sinh tinh trùng vẫn sử dụng lipid trong nguyên sinh chất (trích dẫn từ Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005). Iguer và Verstegen (2001) đã làm thí nghiệm chứng minh vai trò của lòng đỏ trứng trong việc bảo quản tinh dịch chó. Tinh dịch chó đƣợc bảo quản đến thời điểm hoạt lực còn 50% trong 3 môi trƣờng: Biladyl, Green extender, Fresh – phos với thời gian tƣơng ứng: 3,2±1; 2,9±2,5; 2,3±0,5 ngày và bổ sung 20% lòng đỏ trứng vào 3 môi trƣờng: Biladyl, Green extender, Fresh – phos với thời gian tƣơng ứng: 8,5±0,2; 4,5±1,1; 5,2±0,4 ngày. 2.10.2. Một số môi trƣờng bảo quản tinh trùng chó - Iguer và Verstegen (2001) khảo sát khả năng bảo quản của 4 môi trƣờng: Tris – glucose, Tris – fructose, EDTA và Tris – BES (bảng 2.3). Kết quả về thời gian sống và còn khả năng thụ tinh giảm dần theo thứ tự nhƣ sau: Tris – glucose, Tris – Fructose, EDTA, Tris – BES tƣơng ứng: 13±1; 9,7±0,6; 4±0,6; 3,6±1,1 ngày. Trong môi trƣờng Tris – glucose, ông vẫn thấy tinh trùng sống tới ngày thứ 16 sau khi bảo quản. 19 Bảng 2.3. Công thức môi trƣờng bảo quản tinh chó (nguồn: Iguer và Verstegen, 2001) Thành phần môi trƣờng Tris – glucose Tris – fructose EDTA Tris – BES Nhiệt độ bảo quản (OC) 0 – 4 0 – 4 0 – 4 0 – 4 EDTA (g) 0,37 Tris (g) 3,025 3,025 0,43 Glucose (g) 1,25 6 0,59 Fructose (g) 1,25 Bicarbonate Na (g) 0,12 Citrate Na (g) 1,7 1,7 Nƣớc cất (ml) 100 100 100 100 BES (g) 1,49 Lactose (g) 3,4 Penicillin (mg/100ml) 100 100 100 100 Streptomycin (mg/100ml) 100 100 100 100 Lòng đỏ trứng (ml) 20 20 20 20 pH 6,82 6,84 6,81 6,84 Áp suất thẩm thấu (mOsm) 381 364 464 310 - Thái Thị Mỹ Hạnh (2005) khảo sát khả năng bảo quản của 4 loại môi trƣờng tris – glucose, glycine, tris – BES và EDTA (bảng 2.4). Kết quả về thời gian sống còn khả năng thụ tinh (t5) giảm dần theo thứ tự nhƣ sau: Tris – glucose, Glycine, Tris – BES, EDTA tƣơng ứng với thời gian 65,24; 61,97; 25,46; 19,96 giờ. 20 Bảng 2.4. Công thức pha chế 4 môi trƣờng bảo quản tinh chó (nguồn: Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005) Thành phần môi trƣờng Tris – Glucose Glycine Tris – BES EDTA Glycine (g) 0,93 EDTA (g) 0,37 Tris (g) 3,025 0,43 Glucose (g) 1,25 1,25 0,59 6 Bicarbonate Na (g) 0,12 Citrate Na.1H2O (g) 1,7 1,45 Nƣớc cất 2 lần (ml) 100 100 100 100 BES (g) 1,49 Lactose (g) 3,4 Penicillin (mg) 100 100 100 100 Streptomycin (mg) 100 100 100 100 Lòng đỏ trứng (ml) 20 20 20 20 pH 6,82 6,8 6,81 6,81 Áp suất thẩm thấu (mOsm) 381 - 310 464 2.11. Hoạt hóa tinh trùng Hoạt hóa tinh trùng (sperm capacitation): là quá trình biến đổi đầu tiên của tinh trùng trong quá trình vận chuyển từ tử cung đến ống dẫn trứng. Quá trình này làm cho tinh trùng có khả năng phóng thích enzyme hyaluronidase, một enzyme làm phân hủy sự liên kết của các tế bào hạt (cumulus cell) bao quanh tế bào trứng, để tinh trùng có thể tiếp cận và kết hợp với màng trong suốt của trứng (zona pellucida). Vì vậy trong kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) tinh trùng phải đƣợc hoạt hóa (capacitation) trƣớc khi cho kết hợp với trứng đã chín (matured oocyte) (trích dẫn từ Nguyễn Văn Thuận, 2005). Theo Farstad (2000), môi trƣờng Tyrode cải tiến (Sperm - TALP) thƣờng đƣợc sử dụng trong quá trình hoạt hóa in vitro của tinh trùng bò, chó và cáo. 21 Các yêu cầu của quá trình hoạt hóa tinh trùng trong ống nghiệm (trích dẫn từ Huỳnh Thị Lệ Duyên, 2003): do tinh thanh ngăn cản phản ứng hoạt hoá và có chứa một số chất ức chế hoạt động của tinh trùng nên cần đƣợc loại bỏ. Trong môi trƣờng hoạt hóa, cần có sự hiện diện các thụ quan của cholesterol, có thể là huyết thanh hoặc albumin huyết thanh bò hoặc ngƣời (BSA hoặc HSA), sẽ thực hiện chức năng làm mất ổn định màng tinh trùng. Huyết thanh có hiệu quả hơn vì có các lipoprotein có khả năng thu hồi cholesterol tốt hơn albumin. Dịch nang trứng cũng là một thụ quan có hiệu quả cho việc thu nhận cholesterol. Sirivaidyapong và ctv (1999) cho rằng nồng độ Ca2+ cao trong môi trƣờng Sperm- TALP-1 sẽ làm tăng tỷ lệ tinh trùng chó có phản ứng acrosome (AR) còn sống và di chuyển trong suốt quá trình hoạt hóa ở 37OC. Bởi vì nồng độ Ca2+ trong môi trƣờng cao sẽ xâm nhập nhanh chóng vào bên trong tế bào (tinh trùng) làm nồng độ Ca 2+ bên trong tế bào tăng đến mức có thể hoạt hóa phản ứng acrosome. Ông chứng minh bằng cách thêm EDTA vào môi trƣờng thì phản ứng acrosome của tinh trùng chó không xảy ra. Ngƣợc lại nồng độ Mg2+ có thể ức chế phản ứng acrosome của tinh trùng. Phản ứng hoạt hoá tinh trùng có tính chất thuận nghịch. Các tinh trùng hoạt hoá có thể trở nên bất hoạt khi cho tinh dịch vào. Hai phƣơng pháp thông dụng nhất dùng trong thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) để hoạt hoá tinh trùng là phƣơng pháp “bơi lên” (swim-up) và phƣơng pháp Percoll. Tỉ lệ thụ tinh của các tinh trùng phân tách từ hai phƣơng pháp này là nhƣ nhau, khi các tinh trùng lấy ra theo 2 phƣơng pháp này đều bình thƣờng nhƣ nhau. Một điều quan trọng khi xử lí mẫu tinh dịch trƣớc khi đƣa vào thụ tinh trong ống nghiệm là tinh dịch cần phải đƣợc rửa sạch hoàn toàn để cho các yếu tố ức chế tinh trùng không thể hoạt động đƣợc (trích dẫn từ Phan Trƣờng Duyệt và Phan Khanh Vy, 2001). Phƣơng pháp “bơi lên” là phƣơng pháp phổ biến để tách tinh trùng ra khỏi tinh dịch, đƣợc sử dụng từ những năm 1970 đến nay. Nguyên tắc của phƣơng pháp này dựa vào sự di động của tinh trùng trong môi trƣờng. Phƣơng pháp này thích hợp cho mẫu tinh trùng có mật độ cao và di động tốt nhƣng không phù hợp cho mẫu tinh có khả năng di chuyển kém (trích dẫn từ Huỳnh Thị Lệ Duyên, 2003). Farstad và ctv (1993) đã thành công trong việc tạo phôi in vitro trên loài cáo xanh (Alopex lagopus), trong quá trình hoạt hóa tinh trùng, Farstad đã sử dụng phƣơng pháp “bơi lên” này. 22 Năm 2001, Younglai và ctv đã so sánh tác động làm hƣ hại DNA tinh trùng ngƣời của phƣơng pháp “bơi lên” thông thƣờng và phƣơng pháp “bơi lên” trực tiếp. Phƣơng pháp “bơi lên” thông thƣờng là phƣơng pháp “bơi lên” mà mẫu tinh dịch ban đầu đƣợc rửa bằng cách ly tâm. Phƣơng pháp “bơi lên” trực tiếp là phƣơng pháp “bơi lên” mà mẫu tinh dịch ban đầu đƣợc đƣa trực tiếp vào quá trình “bơi lên” hay không trải qua bƣớc ly tâm để rửa. Tỉ lệ tinh trùng có DNA bị hƣ hại sau khi hoạt hoá bằng 2 phƣơng pháp “bơi lên” này đƣợc so sánh với mẫu tinh dịch ban đầu. Kết quả: sự hƣ hại DNA đều bé hơn 5% trong hầu hết các mẫu và không có sự thay đổi ý nghĩa nào trong mẫu DNA đƣợc quan sát giữa 2 phƣơng pháp “bơi lên” này. 23 PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nội dung nghiên cứu - Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng: + Thu thập tế bào biểu mô ống dẫn trứng bằng phƣơng pháp vuốt và phƣơng pháp cạo. + So sánh 2 phƣơng pháp nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng, bao gồm phƣơng pháp sử dụng lá kính (lamell) và phƣơng pháp không sử dụng lá kính. + Nhuộm xác định tỉ lệ tế bào sống và chết sau khi nuôi cấy. - Xác định ảnh hƣởng của thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa đến chất lƣợng tinh trùng: + Bảo quản các mẫu tinh dịch trong môi trƣờng Tris-glucose. + Hoạt hóa tinh trùng bằng phƣơng pháp bơi lên. + Khảo sát các chỉ tiêu đánh giá tinh trùng trƣớc và sau hoạt hóa ở các thời điểm bảo quản. 3.2. Thời gian và địa điểm thực hiện Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 06-02-2006 đến ngày 06-07-2006 tại trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 3.3. Vật liệu 3.3.1. Nguồn mẫu Ống dẫn trứng chó đƣợc thu thập tại lò mổ anh Phƣớc, quận Thủ Đức, Tp. Hồ Chí Minh. Mẫu tinh chó đƣợc thu tại nhà bác Sáu và nhà chị Hạnh. 3.3.2. Dụng cụ và thiết bị Eppendorf Ống nhựa (falcon) 15 ml Dao Kéo Găng tay Khay Lọ cồn Đầu lọc 0,2 µm 24 Dây đồng mảnh Kẹp Ống tiêm 1 ml và kim 26 G Đĩa nuôi cấy 35mm Nhiệt kế Bình cách nhiệt Pipette Pasteur Micropipette Buồng đếm hồng cầu Que thuỷ tinh Phiến kính, lá kính Các loại ống đông có chia độ Kính hiển vi Máy li tâm Cân (độ chính xác 0,001) pH kế (độ chính xác 0,01) Tủ sấy dụng cụ Nồi hấp Tủ cấy Tủ ấm CO2 Tủ bảo ôn ở nhiệt độ 0-10 0 C Kính hiển vi soi ngƣợc 3.3.3. Hoá chất NaCl NaOH HCl Nigrosin-eosin Dầu xem kính Thuốc nhuộm Kovács (1992) Môi trƣờng Tris-glucose Môi trƣờng Sperm-TALP-1 theo Sirivaiddyapong và ctv (1999) Môi trƣờng TCM 199 25 Môi trƣờng PBS Môi trƣờng Hepes – 199 Dầu khoáng Huyết thanh Lòng đỏ trứng Penicillin Streptomycin Gentamycin Kanamycin 3.4. Phƣơng pháp tiến hành 3.4.1. Nuôi cấy mô tế bào biểu mô ống dẫn trứng 3.4.1.1. Thu thập ống dẫn trứng tại lò mổ (Xu và ctv, 1992) - Chọn những chó cái đang giai đoạn lên giống.