Luận văn Nghiên cứu đặc tính điện hóa của fenofibrat và ứng dụng trong phân tích

chuẩn của fenofibrat trên nền mẫu huyết tương ........................ 41 MỞ ĐẦU Cholesterol là dưỡng chất quan trọng và cần thiết cho sự hoạt động phát triển một cách bình thường của cơ thể. Tuy nhiên khi lượng chất này trong máu quá cao sẽ gây ra nhiều ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe như: xơ vữa động mạch, cao huyết áp. Nguyên nhân gây tăng cholesterol có liên quan đến chế độ ăn, thói quen sinh hoạt, luyện tập, và có xu hướng ngày càng tăng trong xã hội phát triển. Hiện nay, có nhiều loại thuốc uống làm giảm cholesterol trong máu, chủ yếu tập trung ở hai nhóm đó là fibrat và statin. Một trong những hoạt chất được sử dụng khá phổ biến cho bệnh nhân điều trị cholesterol cao là fenofibrat. Fenofibrat có nhiều ưu điểm vượt trội so với các dẫn chất cùng nhóm, tần suất và cường độ tác dụng phụ thấp, có thể phối hợp với các thuốc thuộc nhóm statin trong điều trị chứng tăng cholesterol trong máu. Hiện nay, vì lợi ích kinh tế đã có không ít tổ chức, cá nhân đã cho ra đời nhiều loại thuốc giả, thuốc kém chất lượng làm nguy hại cho sức khỏe và kinh tế người bệnh. Vì vậy, vấn đề kiểm định lại hàm lượng của thuốc theo đúng tiêu chuẩn là một vấn đề rất quan trọng và thực sự cần thiết. Việc kiểm định chất lượng thuốc ở dạng bào chế cũng như dược động học của thuốc cần phải có phương pháp phân tích một lượng thuốc nhỏ trong các mẫu sinh học để có thể tìm hiểu khả năng tồn tại cũng như khả năng hấp thu của thuốc trong cơ thể để từ đó đưa ra liều lượng đúng và phù hợp với người bệnh. Có nhiều phương pháp được sử dụng để xác định các chất có hoạt tính sinh học nói chung và fenofibrat nói riêng như các phương pháp sắc ký, phương pháp quang phổ UV-Vis, phương pháp cực phổ và von - ampe hòa tan hấp phụ. Trong dược điển Việt Nam, fenofibrat đã được nghiên cứu và xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Tuy nhiên, chi phí cho phân tích HPLC cao, quy trình xử lý mẫu phức tạp, thiết bị đắt tiền. Do vậy, với mong muốn nghiên cứu một phương pháp có thể kiểm tra song hành với phương pháp trong dược điển nên chúng tôi đã lựa chọn phương pháp von - ampe hòa tan hấp phụ. Đây là phương pháp có độ nhạy và độ chọn lọc cao, quy trình phân tích đơn giản, chi phí phân tích cho mẫu cần kiểm nghiệm không cao. Chính vì vậy, trong phạm vi của luận văn, chúng tôi chọn phương pháp von - ampe hòa tan hấp phụ để nghiên cứu các đặc tính điện hóa và quy trình xác định fenofibrat trong mẫu dược phẩm và mẫu huyết tương. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về chất nghiên cứu fenofibrat 1.1.1. Cấu tạo của fenofibrat Fenofibrat có tên khoa học theo IUPAC là propan-2-yl{2-4-[(4-clophenyl) cacbonyl] phenoxy}-2- methylpropanoate được biết với tên thương mại là tricor, là một dẫn xuất của axit fibric [1]. Công thức cấu tạo của fenofibrat như ở hình 1.1: Hình 1.1: Công thức cấu tạo của fenofibrat Công thức phân tử là: C20H21ClO4, khối lượng mol phân tử là 360,831(g/mol). Fenofibrat là bột kết tinh màu trắng, ít tan trong nước (< 0,5 mg/lít), tan tốt trong metanol [1]. 1.1.2. Dƣợc lực học và động học của fenofibrat 1.1.2.1. Dược lực học Fenofibrat là dẫn chất của axit fibric, thuốc hạ lipid máu. Thuốc ức chế sinh tổng hợp cholesterol ở gan, làm giảm các thành phần gây vữa xơ (lipoprotein tỷ trọng rất thấp VLDL và lipoprotein tỷ trọng thấp LDL) làm tăng sản xuất lipoprotein tỷ trọng cao (HDL), và còn làm giảm triglycerid máu. Do đó, thuốc fenofibrat làm cải thiện đáng kể sự phân bố cholesterol trong huyết tương. Fenofibrat được dùng để điều trị bệnh nhân có lipoprotein cao trong mẫu huyết tương. Fenofibrat có thể làm giảm 20 - 25% cholesterol toàn phần và 40 - 50% triglycerid trong máu [2,3]. 1.1.2.2. Dược động học Fenofibrat được hấp thu tốt từ đường dạ dày, ruột. Trong nước tiểu của người uống, fenofibrat chủ yếu tồn tại dưới dạng axit fenofibric. Nồng độ của axit fenofibric cao nhất trong huyết tương xảy ra trong vòng 6 đến 8 giờ sau khi uống. Lúc này fenofibrat nhanh chóng thủy phân thành axit fenofibric. Trong máu không tìm thấy fenofibrat nguyên dạng. Dạng chuyển hóa có hoạt tính, axit fenofibrat, kết hợp với axit glucuronic và sau đó được bài tiết trong nước tiểu. Fenofibrat được bài tiết chủ yếu trong nước tiểu chiếm khoảng 60% [2,3]. 1.2. Các phƣơng pháp xác định fenofibrat Hiện nay, có nhiều phương pháp khác nhau để xác định fenofibrat như: các phương pháp sắc ký lỏng, phương pháp quang phổ, phương pháp von - ampe 1.2.1. Phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao Phương pháp sắc ký lỏng được sử dụng chủ yếu để xác định đồng thời fenofibrat và một số chất khác trong mẫu sinh học với các điều kiện: các chất phân tích được thực hiện trên cột RP C18, kích thước hạt phù hợp, detector UV. A.Arora1 và các cộng sự đã xác định fenofibrat trong mẫu huyết tương bằng phương pháp HPLC. Nội dung nghiên cứu là mô tả cụ thể quy trình xác định fenofibrat trong huyết tương người sử dụng sắc kí lỏng pha đảo. Pha động được sử dụng đơn giản với độ nhạy đủ để định lượng fenofibrat với lượng thấp 0,095 mg /mL, hệ số biến thiên thấp hơn 20% và độ chính xác dao động từ 101,99 -107,41%, Khoảng tuyết tính từ 0,095 mg/mL đến 19,924 mg/mL, R2 lớn hơn 0,98. Phương pháp trên có giá trị trong việc phân tích của thuốc trong huyết tương người. Các phương pháp với hiệu chỉnh nhỏ có thể được sử dụng để phân tích thuốc ở dạng bào chế khác nhau [14]. Để xác định đồng thời atorvastatin canxi, ezetimib và fenofibrat trong mẫu sinh học, Archita Patel và các cộng sự đã sử dụng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao. Các chất phân tích được thực hiện trên cột RP C18 (kích thước hạt 5 mm, đường kính 150 mm × 4,6 mm), pha động gồm metanol - axetonitrin - nước (76 + 13 + 11, v/v/v), tốc độ dòng 1 ml/phút. Sử dụng detector UV ở bước sóng 253 nm thì thời gian lưu của atorvastatin canxi, ezetimib và fenofibrat lần lượt ở 2,25; 3,68; 6,41 phút, khoảng tuyến tính từ 2 – 10 µg/mL (R2 = 0,998) cho atorvastatin và ezetimib, 40 – 120 µg/mL (R2 = 0,998) cho fenofibrat, LOD và LOQ của atorvastatin nằm trong khoảng 0,11 - 0,3477 µg.mL-1; của ezetimibe 0,07 - 0,2177 µg.mL-1; và của fenofibrat 0,25 - 0,77 µg.mL-1. Hiệu suất thu hồi của atorvastatin canxi; ezetimib và fenofibrat lần lượt là 99,83%; 99,89%; 99,98% và độ lệch chuẩn nhỏ hơn 2% [21]. Phương pháp sắc kí lỏng cũng được Fathy M.M Salama và các cộng sự sử dụng để xác định chính xác hàm lượng fenofibrat trong mẫu dược phẩm với điều kiện cột C18 restekpinnacle II phenyl (5µm, 250mm × 4,6mm) và pinnacle II phenyl (5 µm, 10 mm × 4), pha động gồm metanol 0,1%; axit photphoric ( 60 : 40; v/v) với tốc độ dòng 2 mL/phút, nhiệt độ cột 500C, pH = 2,5. Detector UV đặt tại các bước sóng 302 nm đối với chất nội chuẩn (IS) và 289 nm đối với fenofibrat. Khoảng tuyến tính từ 60 - 140 ppm với hệ số tương quan bằng 0,9999; hiệu suất thu hồi của quy trình xử lý mẫu fenofibrat từ 99,77 - 100,39% [27]. Rayan G. Alamri, Kazi Mohsina, Ajaz Ahmad, Mohammad Raishc và Fars K. Alanazia đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng cao với detector UV (UHPL - UV) để xác định fenofibrat và axit fenofibric bị chuyển hóa trong mẫu huyết tương của chuột bạch. Nhóm tác giả đã sử dụng điều kiện phân tích của hệ sắc ký lỏng như sau: cột C18 với thành phần pha động là metanol và nước (65 : 35), tốc độ dòng là 0,3 mL/phút (đẳng dòng) và bước sóng hấp thụ của detector UV là 284 nm. Để đo được nồng độ của fenofibrat và axit fenofibric trong mẫu huyết tương chuột thì các tác giả đã sử dụng kĩ thuật xử lý mẫu là chiết lỏng lỏng với quy trình như sau: mẫu huyết tương được lấy và chuyển vào các ống ly tâm 1,5 mL. Sau đó thêm chuẩn các dung dịch fenofibrat, axit fenofibric và chất nội chuẩn (2500 ng/mL) rồi trộn đều. Sử dụng metanol để kết tủa huyết tương. Tiếp theo quay ly tâm trong 10 phút với tốc độ quay là 2500 vòng/ phút. Sau khi ly tâm, phần dung dịch được đuổi bằng N2 ở 45 - 50 oC và cuối cùng cặn được hòa tan bằng 200 µl pha động và được bơm vào hệ sắc ký. Các kết quả đạt được: giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng là 30 và 90 ng/mL với fenofibrat và 40 và 100 ng/mL đối với axit fenofibric cùng với hệ số biến thiên trong ngày nhỏ hơn 5% [32]. Để xác định được nồng độ fenofibrat trong huyết tương của người, nhóm nghiên cứu đã sử dụng xử lý mẫu bằng kĩ thuật chiết pha rắn và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV. Điều kiện của hệ sắc ký là pha động đệm phosphat với metanol tỉ lệ 40 : 60, bước sóng UV là 288 nm, nhiệt độ cột là 350C và tốc độ dòng là 0,8 mL/phút, giới hạn phát hiện là 36 µg/mL. Với đặc điểm là nền mẫu phức tạp thì nhóm tác giả đã nghiên cứu thành công khi tìm ra quy trình chiết pha rắn: trước hết rửa cột bằng 1ml metanol và 1ml đệm photphat với tốc độ là 6,00 mL/phút. Sau đó,bơm lên cột 0,8 mL mẫu với tốc độ là 0,18 mL/phút; dung dịch rửa tạp là 1mL đệm photphat pH = 7,4, tốc độ chảy là 1,5 mL/phút; dung dịch rửa giải là 1mL metanol và 1mL axit photphoric 0,04 M, hiệu suất thu hồi xác định fenofibrat trong huyết tương người đạt trên 99% [23]. Nhóm tác giả Dasandi Bhavesh, Sanjay Shaha và Shivprakash cũng đã xác định hàm lượng của axit fenofibric trong huyết tương người bằng phương pháp sắc kí khối phổ với các điều kiện đo: Cột C18 sử dụng chế độ đẳng dòng với tốc độ là 0,2 mL/phút và sử dụng chiết lỏng lỏng để chiết axit fenofibric với quy trình: 250 µL huyết tương của người được thêm 25 µL chất nội chuẩn axit mefenamic là 7,0 µg/mL; sau đó trộn với 250 µL axit formic 0,1% và lắc đều trong 10 s; rồi đem đi lắc với 4,5 mL hỗn hợp đietylete và etyl acetat tỉ lệ 1: 1 trong 5 phút; tiếp đó quay ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút; cuối cùng lấy phần hữu cơ đem đuổi dung môi bằng khí N2 ở nhiệt độ 45 0 C rồi hòa tan phần cặn bằng 0,5 mL ACN và nước tỉ lệ 1:1. Kết quả thu được: khoảng tuyến tính từ 0,05 - 7,129 µg/mL và kết quả cho thấy hàm lượng của axit fenofibric sẽ giảm dần sau khi người bệnh uống thuốc sau 5 giờ và lượng hấp thụ lớn nhất của người bệnh là từ 4 - 5 giờ sau khi uống [25]. Để xác định đồng thời hàm lượng của atorvastatin canxi và fenofibrat trong thuốc viên, các tác giả N.Jain, R. Raghuwanshi và Deepti Jain đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao – pha đảo. Với các điều kiện của hệ sắc ký là cột luna C18; pha động metanol – đệm axetat pH 3,7 tỉ lệ 82 : 18 (v/v); tốc độ dòng 1,5 mL/phút, nhiệt độ cột là 25oC, bước sóng xác định là 248 nm và các chất có thời gian lưu lần lượt là 3,02 phút và 9,05 phút. Kết quả thu được khoảng tuyến tính từ 1-5 µg/mL và 16 - 80 µg/mL tương ứng với atorvastatin canxi và fenofibrat. Sau đó áp dụng điều kiện phân tích đó để xác định hàm lượng atorvastatin canxi và fenofibrat trong mẫu thuốc viên với quy trình xử lý mẫu sử dụng metanol – nước tỉ lệ 80 : 20 (v/v) để chiết, thu được kết quả rất tốt khi cả hai chất đều được chiết đạt hiệu suất thu hồi trên 100% [30]. Phương pháp sắc kí lỏng khối phổ - khối phổ (UPLC - MS/MS) được Alothman ZA và các cộng sự dùng để xác định fenofibrat trong mẫu dược phẩm và mẫu huyết tương người. Quy trình xử lý mẫu: mẫu huyết tương được thêm 5 mL dung môi có chứa (etyl acetat : đietylete) sau đó được cho vào máy lắc 10 phút rồi quay li tâm trong 10 phút ở 5000 rpm, tiếp đó tách lấy lớp huyết tương. Các điều kiện tối ưu: cột tách C18 cột (kích thước hạt 1,7 mm; ID 50 mm x 2.1 mm), dung dịch rửa giải isocratic, pha động gồm metanol và nước (80 : 20%, v/v), tổng thời gian phân tích 2 phút. Khoảng tuyến tính từ 0,5 - 200 ng/mL (r2 = 0,993; n = 6), với (LOD) = 0,12 µg/mL; (LOQ) = 0,41 µg/mL, độ thu hồi fenofibrat trong huyết tương (96,41 ± 6,14)% với độ lệch chuẩn tương đối ít hơn 3% [17]. Để xác định được hàm lượng của fenofibrat và sản phẩm thủy phân của chúng trong mẫu thuốc, Alaa El - Gindy và các cộng sự đã sử dụng phương pháp sắc kí lỏng khối phổ với các điều kiện: cột tách ODS với pha động gồm axetonitrin: nước (80 : 20, v/v, tại pH = 4) với detector UV bước sóng ở 287 nm cho fenofibrat và một pha động chứa axetonitrin – 10 mM KH2HPO4 0,1% dietylamin (60 : 40, v/v; pH = 4,6) với bước sóng phát hiện ở 270 nm cho vinpocetine. Phép phân tích cho kết quả LOD và LOQ của vinpocetin lần lượt là 2,00.10-2 µm.mL-1 và 6,66.10-2 µm.mL-1; hệ số tương quan R2 = 0,9999; tương ứng với fenofibrat là 2,02.10-2 µm.mL-1 và 6,72. 10-2 µm.mL-1 và hệ số tương quan R2 = 0,9998 [16]. 1.2.2. Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ phân tử Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử xác định đồng thời hàm lượng fenofibrat và rosuvastin trong mẫu huyết tương người đã được nghiên cứu. Các điều kiện đo được thực hiện trong nền metanol với bước sóng cho tín hiệu của rosuvastin là 243 nm, fenofibrat là 287 nm, khoảng nồng độ tuyến tính của fenofibrat là 4 - 28 ng/L; của rosuvastin là 1 – 6 ng/L, hệ số tương quan R2 = 0,9921; hiệu suất thu hồi fenofibrat nằm trong khoảng 96,3 % - 100,27 % [20]. Bên cạnh đó, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với quang phổ đạo hàm bậc 2 được Amer M.A. Alanazi và các cộng sự sử dụng để xác định đồng thời pravastatin và fenofibrat trong dược phẩm. Các điều kiện phân tích được thực hiện trên cột C18 ( kích thước hạt 5 mm, đường kính 125 mm x 4,6 mm), chất rửa giải isocratic, sử dụng pha động gồm axetonitrin 0,1% và đietylamin (50 : 50, v/v, tại pH = 4,5) với tốc độ dòng 1,0 mL/phút, chất được đo ở bước sóng 240 nm và hai chất này được xác định với thời gian lưu là 2,15 phút và 5,79 phút cho pravastatin và fenofibrat. Khoảng tuyến tính đối với pravastatin là 5-50 µg.mL-1, hệ số tương quan R 2 = 0,999 tương ứng với fenofibrat là 20 – 200 µg.mL-1, hệ số tương quan R2 = 0,996. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của pravastatin và fenofibrat lần lượt là 1,5; 5,0 µg.mL-1 và 6,5; 5,0 µg.mL-1. Cùng với phương pháp HPLC, tác giả cũng sử dụng phương pháp đạo hàm quang phổ bậc 2 để xác định pravastatin và fenofibrat tại hai bước sóng 237,6 nm và 295,1 nm; hệ số tương quan của pravastatin và fenofibrat đồng thời là R2 = 0,999, khoảng tuyến tính của pravastatin và fenofibrat lần lượt là 5 - 20 và 3 - 20 µg.mL-1, giới hạn phát hiện của pravastatin là 1,5 µg.mL-1; fenofibrat là 1,0 µg.mL-1. Giới hạn định lượng của pravastatin và fenofibrat tương ứng là 5,0 µg.mL-1 và 3,0 µg.mL-1 [18]. Phương pháp hấp thụ phân tử được Panikumar D Anumolu và cộng sự sử dụng để xác định atorvastatin và fenofibrat trong thuốc. Atorvastatin và fenofibrat được phát hiện ở bước sóng lần lượt là 281 nm và 296 nm. Khoảng nồng độ tuyến tính được xác định trong khoảng 2 - 12 ng/mL cho atorvastatin và 1 – 30 ng/mL cho fenofibrat, hệ số tương quan thu được tương ứng của atovastatin và fenofibrat là R2 = 0,9971 và 0,9985; hiệu suất thu hồi 98,8 - 102,5% cho atorvastatin và 99,6 - 100,25% cho fenofibrat [31]. M.S.Kondawar và các cộng sự đã sử dụng phương pháp quang phổ UV để xác định đồng thời ezetimibe và fenofibrat trong thuốc và các dạng bào chế. Bước sóng tìm thấy tối đa cho ezetimibe là 232,6 nm và fenofibrat là 286,6 nm. Khoảng nồng độ có thể xác định được cho cả hai chất là 2 – 20 µg/ml. Hiệu suất thu hồi đạt 98,67% - 100,34 % [29]. Phương pháp quang phổ cũng đã được Faizal P P và các cộng sự sử dụng để xác định fenofibrat dựa trên sự hấp thụ quang của fenofibrat trên nền metanol trong môi trường pH = 3,07 tại bước sóng 596 nm. Khoảng tuyến tính của fenofibrat từ 2 - 5 μg/mL. Hiệu suất thu hồi 100,3 % đến 100,37 %, với giới hạn phát hiện (LOD) 0,02 µg/mL, giới hạn định lượng (LOQ) 0,1 µg/mL [26]. 1.2.3. Phƣơng pháp von - ampe hòa tan Fathy M. M. Salama và các cộng sự đã sử dụng kĩ thuật quét sóng vuông và xung vi phân với điện cực giọt thủy ngân rơi, điện cực so sánh là điện cực AgCl được sử dụng để xác định đồng thời etofibrate, fenofibrat và atorvastatin trong mẫu huyết tương và mẫu dược phẩm. Thu được các giá trị độ lệch chuẩn tương đối là < 2%. Giới hạn phát hiện (LOD) và định lượng (LOQ) được trong phạm vi 0,037 - 0,21 µg/mL và 0,12 - 0,71 µg/mL, cho thấy độ nhạy cao [27]. Abdel - Hay KM và cộng sự đã sử dụng hai kĩ thuật xung vi phân và von – ampe sóng vuôn để xác định etofibrat, fenofibrat và atovastatin trong mẫu dược phẩm và huyết tương người bởi sự khử trên điện cực giọt thủy ngân với điện cực so sánh là Ag/AgCl. Với việc dùng kĩ thuật von – ampe vòng thì nhận thấy rằng các chất này là bất thuận nghịch. Sau khi tối ưu tất cả các điều kiện: pH tương ứng của etofibrat, fenofibrat và atovastatin lần lượt là 7,0; 7,0 và 7,5; tốc độ quét tương ứng lần lượt là 50 mV/s; 40 mV/s và 60mV/s và biên độ xung 50 mV, các tác giả đã xây dựng đường chuẩn xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng nằm trong khoảng 0,037 – 0,21 µg/mL và 0,12 – 0,71µg/mL. Cuối cùng tác giả đã áp dụng phân tích được 03 mẫu thuốc. Với quy trình xử lí mẫu huyết tương: 1,0 mL huyết tương đã được thêm chuẩn được pha loãng bằng 5 mL metanol được đựng trong ống 10mL. Sau đó dung dịch được quay li tâm trong 10 phút với tốc độ quét 5000 vòng/phút. Lấy 2,5 mL dung dịch sau li tâm chuyển vào bình định mức 5,0 mL và định mức bằng hệ đệm với điều kiện như trên [15]. Ceren Yardımcı, Nuran Özaltın đã tiến hành nghiên cứu tính chất điện hóa của fenofibrat trong mẫu dược phẩm bằng phương pháp cực phổ sóng vuông trên điện cực thủy ngân treo với dung dịch đệm borat tại pH = 9,0. Tác giả sử dụng nền metanol, hệ số khuếch tán là 2,38 × 10-6 cm2.s-1. Thế đỉnh píc của fenofibrat Ep= - 1,2 V, khoảng tuyến tính từ 0,146 ppm - 4,96 ppm, hệ số tương quan R2 = 0,9992; giới hạn phát hiện (LOD) là 0,025 ppm [24]. Qua tổng quan tài liệu thấy rằng, phương pháp von - ampe có thể xác định được fenofibrat trong mẫu thuốc và mẫu sinh học. Tuy nhiên, chưa nhiều công trình nghiên cứu đầy đủ các đặc tính điện hóa cũng như khả năng hấp phụ chất trên điện cực HDME. Do vậy trong luận văn này, chúng tôi lựa chọn phương pháp von – ampe hòa tan hấp phụ để nghiên cứu và xác định fenofibrat trong mẫu thuốc và huyết tương. 1.3. Giới thiệu về phƣơng pháp von - ampe hòa tan hấp phụ 1.3.1. Nguyên tắc của phƣơng pháp von - ampe hòa tan hấp phu ̣ Về cơ sở lý thuyết, phương pháp AdSV khác biệt cơ bản với phương pháp ASV ở cơ chế của quá trình làm giàu (hay quá trình tı́ch lu ỹ chất trên bề mặt cực làm việc). + Giai đoạn làm giàu: Trong phương pháp AdSV, nếu chất phân tích là chất hữu cơ thì bản thân chất phân tích có khả năng tự hấp phụ lên bề mặt điện cực tại 1 thế thích hợp. Nếu chất phân tích là ion kim loại thì cần thêm phối tử hữu cơ có khả năng tạo phức với ion kim loại để tạo thành phức có khả năng hấp phụ trên bề mặt điện cực. Trong thời gian làm giàu, thế được giữ không đổi. Các điện cực làm việc trong AdSV thường được sử dụng như: HMDE, SMDE, Pt, than nhão (CPE), điện cực graphit ngâm tẩm, các điện cực có biến tính hoá học. Tuy nhiên đa số các nghiên cứu sử dụng kĩ thuật AdSV thường sử dụng điện cực HMDE do điện cực này có nhiều ưu điểm: bề mặt được tự làm sạch và lặp lại, dễ tự động hoá. + Giai đoạn hoà tan: thế được quét theo chiều catot (chiều âm hơn) và lúc này xảy ra quá trình khử các tiểu phần đã bị hấp phụ theo ba cơ chế sau: (1) Khử ion kim loại trong phức chất. (2) Khử phối tử trong phức chất. (3) Khử xúc tác hydro. Trong phương pháp AdSV, khi ghi đường von - ampe hoà tan, có thể sử dụng các kỹ thuật ghi đường von - ampe như trong phương pháp ASV. Tín hiệu đỉnh trên đường von - ampe hoà tan là cơ sở để định lượng theo phương pháp AdSV. Tín hiệu von - ampe hoà tan tỷ lệ thuận với nồng độ bề mặt của phức được hấp phụ trên cực làm việc theo phương trình (1) Q = n.F.S.C0 (1) Trong đó, Q : điện lượng cần thiết để khử chất điện hoạt đã được hấp phụ. n : Số electron trao đổi trong phản ứng điện cực tổng cộng. F (C/mol): hằng số Faraday. S (cm 2 ): diện tích bề mặt cực làm việc. C0 (mol/cm 2 ): nồng độ bề mặt của phức hấp phụ trên điện cực. Với một tốc độ quét thế xác định, dòng đỉnh píc hòa tan (Ip) tỉ lệ thuận với Q nên Ip tỉ lệ với S và C0. Mà C0 tỉ lệ với nồng độ chất trong dung dịch phân tích (C) khi các điều kiêṇ hấp phu ̣đươc̣ lăp̣ laị , nên Ip tỉ lệ với S và C. Để đạt được độ nhạy cao khi phân tích bằng AdSV cần tìm các điều kiện tối ưu cho quá trình hấp phụ. Do vậy, cường độ dòng phụ thuộc vào một số yếu tố như loại điện cực, thời gian tích lũy, thế tích lũy, dung môi, đặc tính bề mặt của điện cực, diện tích điện cực, lực ion, pH và nhiệt độ. Vì thế, cường độ dòng Ip = K.C, trong đó K là hệ số thực nghiệm, phụ thuộc vào các điều kiện: 1) điều kiện tích lũy (làm giàu) như thời gian tích lũy, thế tích lũy, tốc độ khuấy, nhiệt độ và thành phần dung dịch như pH, nồng độ đệm; 2) Điều kiện hòa tan như tốc độ quét thế, kiểu quét thế (xung vi phân, xung thường, sóng vuông, dòng xoay chiều); 3) Nồng độ chất nghiên cứu và bản chất của chất trong dung dịch (chất đó có khả năng hấp phụ trực tiếp hay gián tiếp thông qua tạo phức với các phối tử khác). Khi khống chế được các điều kiện tích lũy và thành phần dung dịch thì tìm được mối quan hệ trực tiếp Ip và C. Ip bị ảnh hưởng trực tiếp bởi bản chất của chất hấp phụ và bị ảnh hưởng gián tiếp vào thời gian tích lũy, thế tích lũy, tốc độ khuấy, thành phần dung dịch điện phân, nhiệt độ... Do vậy, phải nghiên cứu chọn các điều kiện tối ưu để hệ số K không thay đổi, đảm bảo độ lặp lại và độ chính xác của phép đo. Cần phải nhấn mạnh thêm rằng, thực chất của phương pháp von - ampe hòa tan hấp phụ là thực hiện quá trình tích lũy chất lên bề mặt điện cực (giai đoạn tích lũy chất tại một thế cố định trong một thời gian nhất định như là một kỹ thuật làm giàu chất), sau đó ghi tín hiệu hòa tan, tín hiệu thu được dạng píc là dòng hoà tan của sản phẩm hấp phụ lên bề mặt điện cực. Thế đỉnh píc hòa tan (Ep) và cường độ dòng píc hòa tan (Ip) phụ thuộc vào các yếu tố như: thành phần nền, phối tử tạo phức, pH, thời gian tích lũy, thế tích lũy, bản chất của đi ện cực làm việc, kỹ thuật ghi đường von - ampe hòa tan. Trong những điều kiện xác định, Ep đặc trưng cho bản chất điện hóa của chất phân tích và do đó dùng để phân tích định tính. Ip tỉ lệ thuận với nồng độ chất phân tích trong dung dịch, do vậy Ip dùng để phân tích định lượng. Phương pháp AdSV đặc biệt thích hợp để phân tích các ion kim loại không thể xác định được bằng kĩ thuật cực phổ thông thường (hay quá trình xác định rất phức tạp) như: Al, Ca, Be, Pt, Ga, Nb hay các chất hữu cơ. Cũng như von - ampe hoà tan thông thường, phương pháp von - ampe hoà tan hấp phụ nhạy hơn so với các phương pháp von - ampe điện hoá trực tiếp qua yếu tố làm giàu (tích luỹ). Ngoài những ưu điểm trên, phương pháp AdSV còn có những ưu điểm riêng so với phương pháp SV như: - Độ nhạy của AdSV thường lớn hơn nhiều so với ASV do kim loại không hoà tan trong thuỷ ngân mà tạo thành các lớp phức đơn phân tử. Ví dụ như điện cực màng thuỷ ngân. - Xác định được nhiều kim loại hơn và độ chọn lọc cao hơn so với phương pháp ASV và CSV do có thể lựa chọn được nhiều thuốc thử tạo phức bền và chọn lọc với kim loại cần phân tích [19,22]. - AdSV đặc biệt tỏ ra có ưu điểm trong phân tích các chất có hoạt tính sinh học, dược phẩm bao gồm những chất có hoạt tính điện hóa, có khả năng hấp phụ trên bề mặt điện cực giọt Hg và cả các chất không có hoạt tính điện hóa trực tiếp trên điện cực giọt cũng có thể được xác định sau khi dẫn xuất hoá bằng cách gắn với các nhóm dễ khử như nitroso, nitro...hoặc thủy phân tạo thành chất mới có hoạt tính điện hóa. - Một điểm đặc biệt của phương pháp von - ampe hoà tan hấp phụ là dựa vào các đặc tính hấp phụ ta có thể giải quyết được bài toán liên quan đến các quá trình điện cực, cơ chế phản ứng xảy ra trên điện cực như thế nào. - Phương pháp AdSV có thể loại trừ được ảnh hưởng của các yếu tố cản trở bằng cách chọn các điều kiện thí nghiệm thích hợp như: thành phần nền, pH, và thế hấp phu ̣làm giàu. 1.3.2. Các kỹ thuật ghi đo tín hiệu hoà tan chất cần phân tích 1.3.2.1. Kỹ thuật DP Điêṇ cưc̣ chı̉ thi ̣ đươc̣ phân cưc̣ bằng điêṇ áp môṭ chiều biến thiên tuyến tı́nh với tốc đô ̣châṃ (vài mV/s), cuối chu kỳ gioṭ người ta đăṭ vào môṭ xung vuông góc với biên đô ̣ 10 - 100 mV (thường choṇ 50 mV), thời gian đăṭ xu ng 40 - 100 ms, cường đô ̣dòng đươc̣ ghi 2 lần taị thời điểm 16,7 ms trước khi nap̣ xung và ngắt xung. Đường biểu diễn sự khác nhau giữa hai dòng này vào thế điện cực có dạng píc, rất dễ xác định và có độ phân giải cao. Do vậy xung vi phân giảm tối đa dòng dư, một hạn chế của cực phổ cổ điển. Thông thường các đi ều kiện đươc̣ choṇ như sau : thời gian giữa các xung 100 ms; độ dài xung 30 ms; thời gian đo 10 ms; bước thế 5mV; khi đó tốc độ quét cũng đạt 50 mV/s. Cho kết quả tốt với cả hê ̣thuâ ̣ n nghic̣h và không thuâṇ nghic̣h , nhưng không quét đươc̣ với tốc đô