Luận văn Nghiên cứu điều kiện phân tích thuốc kháng sinh họ β – lactam trong các mẫu sinh học và dược phẩm

PLC) là phương pháp được dùng phổ biến nhất trong quá trình tách phân tích và điều chế các hợp chất đang được quan tâm trong các đối tượng sinh học, hoá học, dược học và y học. Hệ RP-HPLC có các ưu điểm nổi trội sau: 1. Có độ linh động và độ chọn lọc cao 2. Có khả năng cân bằng cột nhanh, cột có hiệu lực cao, các pic cân đối. 3. Pha động là nước hay hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ thân thiện với môi trường. Nói chung, hệ RP-HPLC có độ linh hoạt và độ chọn lọc cao, dung môi làm pha động có thể là dung môi hữu cơ hoà tan tốt trong nước như methanol, acetonitril, hay có thêm những dung dịch đệm pH được trộn với nhau theo tỷ lệ nhất định. Trong nhiều trường hợp nước là thành phần chính của pha động. - Pha động trong RP- HPLC Pha động là yếu tố thứ hai sau pha tĩnh quyết định đến hiệu quả tách của quá trình sắc ký. Pha động thường là các dung môi phân cực như H2O, MeOH, ACN,hay hỗn hợp của 2 hay 3 dung môi này theo những tỷ lệ nhất định. Các dung môi hữu cơ trên có thể hoà tan thêm một lượng nhỏ axit hay bazơ hữu cơ. Pha động có độ phân cực gần giống với độ phân cực của chất phân tích thì thời gian lưu của chất càng ngắn. Chính vì điều này mà cần phải lựa chọn pha động sao cho phù hợp. Các yếu tố cần được quan tâm và lựa chọn cho mỗi hệ pha đó là: 1. Bản chất pha động. - Thành phần của chất tạo ra pha động - Loại dung môi sử dụng - pH của pha động 2. Tốc độ pha động: Khi pha động đã có một thành phần phù hợp mà tốc độ rửa giải không phù hợp thì cũng chưa có kết quả tách sắc ký hoàn toàn tốt. Khi tốc độ pha động tăng, thời gian lưu của chất giảm, đồng thời diện tích píc cũng giảm. Do đó cần tiến hành lựa chọn tốc độ pha động cho phù hợp để vừa tách hoàn toàn các chất, vừa đỡ tốn dung môi mà vẫn đảm bảo tăng độ nhạy của phép phân tích. 2.2.3. Detector huỳnh quang Một số chất phân tích hay sản phẩm của chất phân tích với một chất khác (phản ứng có tính định lượng) có tính chất huỳnh quang thì xác định bằng detector huỳnh quang. Nguyên nhân sinh ra phổ huỳnh quang phân tử là do các điện tử hóa trị tự do của nguyên tử hay điện tử hóa trị nằm trong liên kết hóa học (, liên hợp - ) của phân tử bị thay đổi mức năng lượng, chúng nhận năng lượng và ở mức năng lượng cao, trạng thái này không bền, nó bị suy biến và sau đó phát ra bức xạ. Như vậy, quá trình sinh ra phổ huỳnh quang là tổ hợp của hai quá trình hấp thụ bức xạ của phân tử và quá trình phát xạ huỳnh quang của nó. Mặc dù tín hiệu huỳnh quang là phát ra mọi hướng, nhưng chỉ có chùm tia phát xạ huỳnh quang nằm vuông góc với chùm tia sáng kích thích là chùm phát xạ huỳnh quang có cường độ lớn và có ý nghĩa. Chùm phát xạ huỳnh quang này đặc trưng cho mỗi loại phân tử. Nguyên tắc của detector huỳnh quang: dựa trên nguyên nhân sinh ra phổ huỳnh quang. Chiếu một chùm tia sáng kích thích có bước sóng xác định () phù hợp vào cuvet chứa mẫu phân tích, để chất phân tích phát ra chùm tia phát xạ huỳnh quang của nó (). Sau đó nhờ hệ quang học thu, phân tách lấy tia phát xạ huỳnh quang thích hợp cần đo hướng vào nhân quang điện để đo chúng, khuyếch đại và biểu diễn chúng. Việc định lượng chất phân tích dựa trên sự phụ thuộc tuyến tính giữa cường độ của tia phát xạ huỳnh quang của chất với nồng độ của chất đó trong mẫu. Iq= kCL Trong đó: k : Hằng số L: Bề dày của cuvét (cm) C: Nồng độ của chất trong mẫu (mol/lít) Iq: Cường độ chùm sáng kích thích. Như vậy, detector huỳnh quang gồm hai bộ đơn sắc, hai hệ quang. Một hệ quang cung cấp chùm tia kích thích, một hệ quang thu nhận chùm tia phát xạ huỳnh quang của chất mẫu, vuông góc với chùm tia kích thích. Detector huỳnh quang có độ nhạy và độ chọn lọc cao. Hình 2.2. Sơ đồ cấu tạo của detector huỳnh quang. 2.2.4. Một số đại lượng đặc trưng của HPLC - Thời gian lưu và hệ số tách k’ Khi được nạp vào cột sắc ký, các chất phân tích sẽ bị giữ lại trên cột trong một khoảng thời gian nhất định. Thời gian đó tính từ lúc mẫu được nạp vào cột cho đến lúc chất tan được rửa giải ra khỏi cột ở thời điểm có nồng độ cực đại. Đó chính là thời gian lưu của chất. (tRi). tRi = to + t’Ri Trong đó: to là thời gian không lưu giữ của chất (thời gian chết) t’Ri là thời gian lưu thực của chất trên cột tách Ngoài ra người ta còn sử dụng hệ số lưu giữ k’ để đánh giá khả năng tách k’ = = k’ không phụ thuộc vào tốc độ dòng mà chỉ phụ thuộc vào thành phần pha động. Nếu k’ lớn thì thời gian rửa giải lâu, k’ bé thì píc của chất tiến gần đến pic dung môi do vậy các chất không tách được - Số đĩa lý thuyết và khả năng phân giải của cột tách Đối với một cột tách sắc ký thì đại lượng đặc trưng cho cột tách là số đĩa hiệu dụng của cột tách và khả năng phân giải của cột tách. Số đĩa hiệu dụng: Nef = Trong đó: Nef là số đĩa hiệu dụng của cột tách tR(i) là thời gian lưu của chất cần phân tích i trên cột tách (giây) to là thời gian không lưu giữ ( thời gian chết:giây) Wi là độ rộng chân pic của cấu tử i (giây) Độ phân giải của hai chất rửa giải có vị trí cạnh nhau trên sắc đồ R(i + 1,i) = Trong đó: R(i +1, i) là độ phân giải của 2 pic cạnh nhau trong sắc đồ t’R(i +1), t’R(i) lần lượt là thời gian lưu thực của cấu tử i +1 và i Wi +1, Wi lần lượt là độ rộng chân píc của hai cấu tử i +1 và i Hai đại lượng này có quan hệ chặt chẽ với nhau. Nếu như số đĩa hiệu dụng càng lớn thì độ phân giải càng tốt. Sự phụ thuộc này được mô tả bằng quan hệ toán học như sau: R(i +1) = Trong đó là thời gian lưu tương đối của hai cấu tử i + 1 và i = Trong điều kiện phân tích thực tế, chúng ta cần quan tâm tới độ phân giải của cột tách đối với một hỗn hợp chất phân tích cụ thể. Cần phải nghiên cứu, khảo sát, chọn pha tĩnh về kích thước hạt nhồi, chiều dài cột tách như thế nào để đạt được độ phân giải theo yêu cầu đặt ra. Thông thường đối với một hỗn hợp các chất phân tích nhất định thì yếu tố quyết định hiệu quả tách ở đây là các điều kiện và bản chất của pha tĩnh, thành phần pha động trong hệ HPLC. 2.2.5. Phân tích định lượng bằng HPLC Trong điều kiện phân tích cố định đã chọn, đại lượng đặc trưng cho một chất là thời gian lưu tRi của chất đó trên cột tách. Do đó, có thể phân tích định tính các chất trong mẫu chưa biết bằng HPLC thông qua thời gian lưu mẫu chất chuẩn đó. Để tiến hành phân tích định lượng, thông thường trong phương pháp HPLC người ta biểu diễn quan hệ nồng độ chất phụ thuộc vào chiều cao pic hoặc diện tích pic sắc ký. H = k.Cb S = k.Cb Trong đó: H- chiều cao pic sắc ký của chất S- diện tích pic sắc ký của chất k- hằng số điều kiện thực nghiệm thực nghiệm b- hằng số bản chất 0 < b ≤ 1 Ở vùng nồng độ nhỏ thì b = 1, mối quan hệ giữa H, S và C là quan hệ tuyến tính H = k1.C = f(C) S = k2. C = f(C ) Biểu diễn mối tương quan của diện tích pic vào nồng độ chất phân tích cho kết quả vùng tuyến tính lớn hơn. Tuy nhiên trong thực nghiệm, việc đo chiều cao pic là dễ dàng hơn đo diện tích pic. Nên trong phân tích lượng nhỏ, người ta thường đo chiều cao pic. Tuy nhiên khoảng tuyến tính sẽ nhỏ hơn. Trong luận văn này, chúng tôi thiết lập quan hệ đo diện tích pic phụ thuộc vào nồng độ chất phân tích, khảo sát khoảng tuyến tính sau đó tiến hành xác định nồng độ chất theo cả hai phương pháp đường chuẩn và thêm chuẩn. - Phương pháp đường chuẩn Nguyên tắc của phương pháp này là: pha một dãy mẫu chuẩn của chất phân tích có nồng độ từ Co đến C5 và mẫu phân tích Cx trong cùng một điều kiện phân tích. Sau đó tiến hành chạy sắc ký để ghi sắc đồ của dãy mẫu chuẩn và mẫu phân tích. Xác định chiều cao H hay diện tíc S của pic sắc ký trong tất cả các mẫu trên rồi tiến hành dựng đường chuẩn theo quan hệ H=f(C) hay S=f(C). Từ giá trị Hx hay Sx của mẫu phân tích, áp vào đường chuẩn chúng ta sẽ biết được nồng độ của chất trong mẫu phân tích. - Phương pháp thêm chuẩn Nguyên tắc thực hiện cũng giống với phương pháp đường chuẩn, tuy nhiên chúng ta dùng ngay chính dung dịch mẫu phân tích làm nền để pha chế dãy mẫu chuẩn. Từ đường chuẩn thực hiện phép ngoại suy tuyến tính, ta sẽ tìm được giá trị nồng độ Cx của chất phân tích trong mẫu đã được bơm vào cột tách. 2.3. Kĩ thuật dẫn xuất hóa các β- Lactam với thuốc thử NBD-F Như trên đã trình bày, detector huỳnh quang là một detector rất nhạy và có độ chọn lọc cao. Chính vì lí do này, kĩ thuật HPLC với detector huỳnh quang đang ngày càng được sử dụng rộng rãi trong phân tích lượng vết, nhất là trong phân tích các mẫu sinh học. Nhưng để sử dụng được kĩ thuật này, đòi hỏi chất phân tích hay sản phẩm của chất phân tích với một chất khác phải có khả năng phát huỳnh quang. Trong thực tế, không có nhiều chất mà bản thân nó tự phát ra huỳnh quang. Các thuốc kháng sinh - Lactam cũng là những chất không tự phát huỳnh quang. Để sử dụng được kĩ thuật này, chúng ta phải dẫn xuất hóa nó với một chất khác. Theo [44], các tác nhân dẫn xuất hóa thường dùng là: Các tác nhân Phản ứng vào nhóm 4-Bromomethyl-7-methoxycoumarin Carboxylic acids 7-Fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole (NBD-F) Amines (bậc 1 và bậc 2) and thiols 1-Dimethylaminonaphthalene-5-sulfonyl chloride Amines (bậc 1) and phenols 1-Dimethylaminonaphthalene-5-sulfonyl hydrazine Carbonyls Trong bản luận văn này, chúng tôi chọn tác nhân dẫn xuất hóa (thuốc thử) là: 7-Fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole (NBD-F). Cơ chế phản ứng [43]: Các β- Lactam có nhóm amin bậc một có dạng công thức chung là R1- NH2 R1- NH2 + NBD-F R1-NH-NBD + HF (β- Lactam) (NBD-F) Như vậy, tác nhân dẫn xuất hóa NBD-F sẽ tấn công và thế vào những β- Lactam có nhóm amin bậc một (-NH2). Cơ chế phản ứng rất đơn giản, tuy nhiên cần phải khảo sát các điều kiện về nhiệt độ và thời gian để phản ứng đạt hiệu suất cao nhất. 2.4. Dụng cụ và hoá chất 2.4.1. Máy móc và dụng cụ Máy HPLC model LC-20AB của hãng Shimadzu bao gồm - Bộ loại khí dung môi, Degasser–DGU-20A3 - Van trộn dung môi FCV-20AB - Bơm dung môi 2 kênh LC-20AB - Bộ ổn nhiệt cho cột tách CTO-20A - Bơm mẫu tự động SIL-20A - Detector huỳnh quang RF-10AXL - Hệ điều khiển CBM-20Afile - Phần mềm điều khiển và xử lý kết quả LC solution version 1.11 Máy đo pH Catrige lọc với kích thước mao quản 0,45m ; bể siêu âm, tủ lạnh, máy điều nhiệt, tủ sấy, máy ly tâm và các dụng cụ thí nghiệm thông dụng khác. 2.4.2. Hoá chất Các chất chuẩn: AMP, CEP, CEF tinh khiết do Viện kiểm nghiệm Bộ Y tế (48A Hai Bà Trưng – Hà Nội) sản xuất và cung cấp. MeOH, ACN tinh khiết cho chạy HPLC Merck (Đức). Các hoá chất khác: axit acetic, natri acetate tinh khiết phân tích và nước đeion. 7-Fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole (NBD-F) của Sigma – Aldrich cung cấp, bảo quản ở -200C. Dung dịch đệm được pha từ axit acetic và natri acetate, dung dịch được lọc qua màng lọc 0,45µm trước khi bơm vào cột sắc ký. Dung dịch chuẩn được pha trong MeOH từ các chất chuẩn trên với nồng độ 1000ppm và bảo quản trong tủ lạnh. Các dung dịch chuẩn có nồng độ thấp hơn được pha từ dung dịch chuẩn trên bằng MeOH và được sử dụng trong ngày. Thuốc thử NBD-F được pha trong MeOH với nồng độ 1000ppm và pha loãng dần bằng MeOH đến nồng độ thấp hơn và được bảo quản trong tủ lạnh. 2.5. Cách tiến hành phản ứng: Điều chế dẫn xuất giữa chất chuẩn β – lactam và thuốc thử NBD-F. Hút 20l dung dịch mỗi chất chuẩn nồng độ 100ppm và 60l NBD-F 100ppm. Thực hiện phản ứng trong bình điều nhiệt ở một nhiệt độ và thời gian thích hợp. Dung dịch thu được đem pha loãng bằng dung môi là thành phần pha động đến một nồng độ xác định, sau đó đem phân tích trên HPLC với detector huỳnh quang. Đối với mẫu Blank, làm tương tự như mẫu phân tích, nhưng không cho chất phân tích. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát các điều kiện tạo dẫn xuất giữa β - Lactam và thuốc thử NBD-F 3.1.1. Khảo sát nhiệt độ phản ứng dẫn xuất hóa Nhiệt độ dẫn xuất hóa là một yếu tố rất quan trọng. Nhiệt độ thích hợp, chất phân tích phản ứng hoàn toàn với thuốc thử, làm cho kết quả của phép phân tích chính xác hơn. Trong phản ứng của chất phân tích với thuốc thử NBD-F, tham khảo các tài liệu trong nước và trên thế giới, chúng tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ từ 500C đến 800C. Điều kiện chạy sắc ký là: bước sóng kích thích Ex = 470nm, bước sóng phát xạ Em = 530nm, thể tích vòng mẫu V=20l, vận tốc pha động v= 1ml/phút. Cột Supelcosil RP-C18, đệm acetat 10mM (pH=4,5), ACN/MeOH/ đệm = 25/25/50, thu được các kết quả như sau: (a) Mẫu Blank (b)500C (c) 550C (d) 600C (e) 650C (g) 700C (h) 750C (i) 800C Hình 3.1. Sắc ký đồ ở các nhiệt độ phản ứng khác nhau (Ex=470nm, Em=530nm, V=20l, v= 1ml/phút. Cột RP-C18, đệm acetat 10mM (pH=4,5), ACN/MeOH/ đệm = 25/25/50) Bảng 3.1. Sự phụ thuộc của Spíc vào nhiệt độ phản ứng Nhiệt độ phản ứng dẫn xuất hóa (Độ C) S píc (mAu.s) CEP CEF AMP 50 791720 808148 855376 55 1755208 1983221 2003652 60 2816232 3214568 3345877 65 5214584 5890144 6277893 70 6110493 7528330 8185432 75 6002430 6812376 7754680 80 5567090 6121344 7021566 (Ex=470nm, Em=530nm, V=20l, v= 1ml/phút. Cột RP-C18, đệm acetat 10mM (pH=4,5), ACN/MeOH/ đệm = 25/25/50) Hình 3.2 . Đồ thị sự phụ thuộc S píc vào nhiệt độ phản ứng (Ex=470nm, Em=530nm, V=20l, v= 1ml/phút. Cột RP-C18, đệm acetat 10mM (pH=4,5), ACN/MeOH/ đệm = 25/25/50) Nhìn vào sắc đồ sắc ký trên, so sánh giữa mẫu Bank và mẫu phân tích, ta có: pic đầu tiên là sản phẩm phụ của phản ứng, píc thứ hai là CEP, tiếp theo là CEF và AMP. Dựa vào bảng số liệu và đồ thị trên, nhận thấy: nhiệt độ phản ứng ảnh hưởng rất lớn tới diện tích píc. Nhiệt độ càng nhỏ, Spíc càng nhỏ (nhiệt độ từ 500C đến 650C). Nhiệt độ quá lớn, Spíc giảm, đồng thời sinh ra nhiều sản phẩm phụ. Tại nhiệt độ 700C, Spíc là lớn nhất. Với những nhận xét như vậy, chúng tôi quyết định chọn nhiệt độ phản ứng tạo dẫn xuất là 700C cho những khảo sát tiếp theo. 3.1.2. Khảo sát thời gian phản ứng dẫn xuất hóa Thời gian của phản ứng dẫn xuất hóa cũng là một yếu tố rất quan trọng ảnh hưởng tới hiệu suất phản ứng. Thời gian thích hợp, phản ứng xảy ra hoàn toàn, kết quả của phân tích chính xác hơn. Trong phản ứng này, chúng tôi tiến hành khảo sát thời gian phản ứng từ 8 phút đến 15 phút. Điều kiện chạy sắc ký như trên, nhiệt độ dẫn xuất hóa là 700C và thu được kết quả như sau: (a) 8 phút (b) 10 phút (c) 12 phút (d) 15 phút Hình 3.3. Sắc ký đồ ở các thời gian phản ứng khác nhau (Ex=470nm, Em=530nm, V=20l, v= 1ml/phút. Cột RP-C18, đệm acetat 10mM (pH=4,5), ACN/MeOH/ đệm = 25/25/50) Bảng 3.2. Sự phụ thuộc của Spíc vào thời gian phản ứng. Thời gian phản ứng dẫn xuất hóa (phút) S píc (mAu.s) CEP CEF AMP 8 4321355 4657216 5109124 10 4846875 5011321 5811029 12 6182215 7521480 8025681 15 6002354 6542780 7092356 (ACN/MeOH/đệm Acetat = 25/25/50. Tốc độ 1ml/phút. Nồng độ đệm 10mM, pH=4,5; Ex=470nm; Em=530nm) Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc Spíc vào thời gian phản ứng (ACN/MeOH/đệm Acetat = 25/25/50. Tốc độ 1ml/phút. Nồng độ đệm 10mM, pH=4,5; Ex=470nm; Em=530nm) Nhìn vào bảng và sắc ký đồ trên ta thấy, thời gian phản ứng càng ít, Spíc càng nhỏ, phản ứng tạo dẫn xuất không xảy ra hoàn toàn (t = 8 phút và 10 phút). Thời gian phản ứng càng lớn, Spíc giảm đồng thời xuất hiện nhiều sản phẩm phụ (t = 15 phút). Tại thời gian phản ứng là 12 phút, Spíc tạo ra là lớn nhất, không xuất hiện sản phẩm phụ. Với những nhận xét đó, chúng tôi chọn thời gian phản ứng là 12 phút cho những khảo sát tiếp theo. 3.2. Khảo sát các điều kiện chạy sắc ký 3.2.1. Chọn bước sóng của detector Trong phép phân tích đồng thời, việc chọn bước sóng rất quan trọng vì nó quyết định trực tiếp đến độ nhạy của phép phân tích. Vì phương pháp nghiên cứu là HPLC ghép nối detector huỳnh quang, do sử dụng detector cố định bước sóng, do đó phải tiến hành khảo sát điều kiện để chọn ra được bước sóng kích thích (Ex) và bước sóng phát xạ (Em) tối ưu nhất cho phân tích đồng thời các chất. Do các -lactam là các hợp chất không màu, hấp thụ ánh sáng vùng tử ngoại. Khi dẫn xuất hóa nó với thuốc thử NBD-F, sản phẩm của phản ứng là một chất có màu và có khả năng phát huỳnh quang. Tham khảo các tài liệu trên thế giới [35,36,48], chúng tôi quyết định chọn bước sóng kích thích là Ex= 470nm, bước sóng phát xạ Em= 530nm cho các khảo sát tiếp theo. 3.2.2. Chọn thể tích vòng mẫu (sample loop) Hệ bơm mẫu cho sắc ký lỏng sử dụng nguyên lý cơ bản là mẫu ban đầu được nạp vào trong vòng chứa mẫu có thể tích nhất định bằng một xi lanh ở áp suất thường, sau đó nhờ hệ thống chuyển van mà mẫu được dòng pha động nạp trong cột tách. Độ chính xác, độ đúng và lượng mẫu cần thiết nạp vào cột tách không những phụ thuộc vào thiết kế của van bơm mẫu mà còn phụ thuộc vào kỹ thuật nạp mẫu vào trong cột. Dựa vào khả năng thay đổi các vòng mẫu khác nhau mà có thể thay đổi được thể tích mẫu bơm vào cột. Tuy nhiên yếu tố này cũng góp phần vào việc mở rộng chân pic sắc ký (doãng pic). Nếu như vòng mẫu chứa quá dài, lượng mẫu bơm vào cột quá lớn thì hiện tượng doãng pic xảy ra càng lớn gây ra sự chen lấn pic trong quá trình tách. Lượng mẫu được xác định bằng lượng thể tích vòng chứa mẫu mà ta chọn. Với thể tích mẫu nhỏ hơn thể tích mẫu tới hạn Vo thì khi bơm mẫu vào cột tách chiều cao hay diện tích của pic sẽ tăng một cách tuyến tính. Đến giới hạn Vmẫu > Vo, nếu ta tiếp tục tăng thể tích mẫu thì chiều cao pic sắc ký cũng không tăng được nữa mà lúc đó pic sắc ký sẽ tù và doãng, không sắc nét nữa. Vì vậy việc chọn thể tích vòng mẫu cũng rất quan trọng. Nếu độ nhạy đủ để phân tích, thường chỉ nên dùng vòng mẫu càng nhỏ càng tốt để tạo nên pic có độ sắc nét cao, tránh sự doãng pic. Trong phân tích HPLC người ta thường dùng vòng mẫu 10, 20, 50, 100l, trong đó vòng mẫu 20l là phổ biến nhất. Vì hàm lượng thuốc kháng sinh trong mẫu thực thấp, nên thể tích vòng mẫu là 10l thì quá nhỏ, còn thể tích vòng mẫu là 50l hoặc 100l thì quá lớn. Phân tích kháng sinh, chúng tôi chọn van bơm mẫu tự động với thể tích vòng mẫu là 20l. 3.3. Chọn pha tĩnh Pha tĩnh trong HPLC là một yếu tố quan trọng quyết định sự tách của một hỗn hợp chất. Bản chất pha tĩnh quyết định đến cơ chế tách và khả năng lưu giữ chất. Tuỳ thuộc vào đối tượng phân tích mà ta chọn cột tách có pha tĩnh và kích thước hạt thích hợp. Đối tượng phân tích của chúng tôi là các β - Lactam, là các hợp chất ít phân cực, do vậy chúng tôi chọn pha tĩnh là các silicagel có gắn gốc ankyl mạch dài, không phân cực để tách hỗn hợp trên. Đã có rất nhiều công trình xác định β – Lactam sử dụng pha tĩnh là cột RP-C8 hay RP-C18. Kết quả các công trình này cũng cho thấy sử dụng pha tĩnh là cột RP-C8 thì thời gian lưu của chất sớm hơn rất nhiều so với cột RP-C18, nhưng khả năng tách các chất của cột RP-C18 là chọn lọc và rõ ràng hơn. Mặt khác trong cùng một loại cột, chiều dài cột tách cũng ảnh hưởng rất lớn đến sự phân giải các chất. Cột Supelcosil có chiều dài 250mm×4,6mm tách tốt hơn cột Hypersil 150mm×4,6mm. Vì thế trong điều kiện của phòng thí nghiệm và phạm vi khoá luận này, chúng tôi chọn cột Supelcosil RP-C18 kích thước 250mm×4,6mm đường kính hạt nhồi 5m của hãng Sulpenco-Australia được chọn để tách các chất trên. 3.4. Chọn pha động Kháng sinh β - Lactam là các hợp chất ít phân cực và có khả năng tan trong dung dịch axit hay kiềm yếu. Các pKa của chúng có giá trị trong khoảng 2,6 – 2,8. Phức huỳnh quang tạo ra cũng có tính axit, nhưng tính axit yếu hơn các β – Lactam. Trên cơ sở đó chúng tôi sử dụng dung môi thông dụng dành cho hệ RP-HPLC như MeOH, ACN, và dung dịch đệm được sử dụng thích hợp nhất ở đây là đệm acetat để chọn ra một hỗn hợp pha động tốt nhất. Vì ở đây khảo sát nhiều kháng sinh cùng một lúc, các kháng sinh này lại có các pKa rất sát nhau. 3.4.1. pH dung dịch đệm Ảnh hưởng của pH có ý nghĩa rất lớn đối với trao đổi ion và trao đổi cặp. Với các kháng sinh họ β - Lactam có pKa nằm trong khoảng 2,6-2,8 là các chất có tính axit yếu, phức của nó với NBD-F cũng mang tính axit, do đó việc sử dụng dung dịch đệm có tính axit thường thu được các píc sắc ký rõ nét. Vì thế, chúng tôi chọn chọn và khảo sát thành phần dung dịch đệm CH3COOH/CH3COONa có nồng độ 10mM với khoảng pH thay đổi từ 4,0 – 5,5. Kết quả thu được như sau: Bảng 3.3. Sự phụ thuộc của thời gian lưu của các chất vào pH pha động pH Thời gian lưu (phút) CEP CEF AMP 4,0 15 17 26 4,5 11,7 12,7 17,5 5,0 9,5 10,2 12,9 5,5 7 7,6 8,8 (ACN/MeOH/đệm Acetat = 25/25/50. Tốc độ 1ml/phút. Nồng độ đệm 10mM) Bảng 3.4. Sự phụ thuộc k’ vào pH pha động pH Hệ số k, CEP CEF AMP 4,0 2 2,4 4 4,5 2,07 2,34 5,6 5,0 1,8 2,1 2,82 5,5 1,33 1,53 1,93 (ACN/MeOH/đệm Acetat = 25/25/50. Tốc độ 1ml/phút. Nồng độ đệm 10mM) Hình 3.5. Sự phụ thuộc k’ vào pH của pha động (ACN/MeOH/đệm Acetat = 25/25/50. Tốc độ 1ml/phút. Nồng độ đệm 10mM) Nhìn vào bảng và hình cho thấy, ở các giá trị pH khác nhau thứ tự rửa giải của các β - Lactam là: CEP, CEF, AMP. Khi pH pha động càng tăng, thời gian lưu của các chất càng giảm. Điều này được giải thích như sau: khi pH thấp, chất phân tích tồn tại ở dạng phân tử nhiều hơn, tương tác với pha tĩnh nhiều hơn làm thời gian lưu tăng. Còn khi pH càng lớn, chất phân tích tồn tại dưới dạng ion nhiều hơn, tương tác với pha tĩnh ít hơn, thời gian lưu giảm. Như vậy, pH = 5,0 hoặc 5,5 thì thời gian lưu ngắn hơn. Hơn nữa, để hiệu quả tách cao thì các chất ra khỏi cột tách có các píc tương ứng phải được tách biệt rõ ràng. Quan sát trên đồ thị và sắc đồ, chúng tôi nhận thấy ở giá trị pH = 5, các píc sắc ký có sự khác nhau rõ rệt về hệ số tách k’, sự tách rõ ràng hơn; còn ở pH=5,5 thì thời gian lưu tuy ngắn hơn pH=5,0 nhưng hai chất CEP và CEF bị dính nhau. Với nhận xét như vậy, chúng tôi chọn pH = 5,0 cho các thí nghiệm tiếp theo. Sắc đồ tách các -lactam tại các giá trị pH của pha động khảo sát thu được: (a) (b) (c) (d) Hình 3.6. Sắc ký đồ ở các pH khác nhau (a). pH = 4,0 (b). pH = 4,5 (c). pH = 5,0 (d).pH= 5,5 (ACN/MeOH/đệm Acetat = 25/25/50. Tốc độ 1ml/phút. Nồng độ đệm 10mM) 3.4.2. Tỉ lệ thành phần pha động Tỉ lệ thành phần dung môi tạo ra pha động có ảnh hưởng đến quá trình rửa giải các chất mẫu ra khỏi cột tách. Khi tỉ lệ thành phần pha động thay đổi thì lực rửa giải của pha động thay đổi, tức là làm thay đổi thời gian lưu của chất phân tích ra khỏi cột và do đó làm thay đổi hệ số dung tích của chất phân tích. Để có được một tỉ lệ thành phần pha động phù hợp cần tiến hành khảo sát với các tỉ lệ khác nhau. Với thành phần pha động đã lựa chọn gồm dung dịch đệm acetat 10mM, pH = 5,0; dung môi ACN và MeOH. 3.4.2.1. Khảo sát tỉ lệ giữa dung môi hữu cơ và dung dịch đệm Chọn tỉ lệ ACN: MeOH= 1:1, tiến hành khảo sát tỉ lệ giữa dung môi hữu cơ và dung dịch đệm, ta thu được kết quả sau: Bảng 3.5. Sự phụ thuộc của thời gian lưu vào tỉ lệ giữa dung môi hữu cơ và đệm Dung môi hữu cơ/Đệm Thời gian lưu (phút) CEP CEF AMP 45/55 16 17,5 25 50/50 9 10,2 13 55/45 8 8,8 11 (ACN/MeOH= 1/1. Tốc độ 1ml/phút. Nồng độ đệm 10mM, pH=5,0) (a) (b) (c) Hình 3.7. Sắc ký đồ tại các tỉ lệ dung môi hữu cơ/Đệm khác nhau Dung môi hữu cơ/ Dung dịch đệm 45/55 50/50 55/45 (ACN/MeOH= 1/1. Tốc độ 1ml/phút. Nồng độ đệm 10mM, pH=5,0) Nhìn vào bảng và hình trên, ta nhận thấy: khi tỉ lệ dung môi hữu cơ thấp (45%), thời gian rửa giải lớn. Khi tỉ lệ này càng lớn, các chất ra càng nhanh, nhưng tại tỉ lệ 55%, hai píc đầu tiên là CEP và CEF bị dính nhau, còn ở 50% các píc sắc ký tách nhau rõ ràng. Với nhận xét như vậy, chúng tôi chọn tỉ lệ giữa dung môi hữu cơ và đệm = 50/50 cho các khảo sát tiếp theo. 3.4.2.2. Khảo sát tỉ lệ giữa ACN/ MeOH Với tỉ lệ giữa dung môi hữu cơ/ đệm = 50/50, chúng tôi tiến hành khảo sát tỉ lệ giữa ACN/ MeOH, thu được các kết quả dưới đây: Bảng 3.6. Sự phụ thuộc của thời gian lưu vào tỉ lệ giữa ACN/ MeOH ACN/MeOH/Đệm Thời gian lưu (phút) CEP CEF AMP 15/35/50 14 15 20 20/30/50 16 18 25 25/25/50 9 10 13 30/20/50 6,8 7,6 8,5 (Dung môi hữu cơ/ đệm= 50/50. Tốc độ 1ml/phút. Nồng độ đệm 10mM, pH=5,0) Bảng 3.7. Sự phụ thuộc của k’ vào tỉ lệ ACN/ MeOH ACN/MeOH/Đệm Hệ số k’ CEP CEF AMP 15/35/50 1,8 2,0 3,0 20/30/50 2,5 2,9 4,4 25/25/50 1,6 1,9 2,7 30/20/50 1,2 1,45 1,74 (Dung môi hữu cơ/ đệm= 50/50. Tốc độ 1ml/phút. Nồng độ đệm 10mM, pH=5,0) (a) (b) (c) (d) Hình 3.8. Sắc ký đồ tại các tỉ lệ ACN/MeOH khác nhau ACN/MeOH/đệm acetat (a). 15/35/50 (b). 20/30/50 (c). 25/25/50 (d). 30/20/50 (Dung môi hữu cơ/ đệm= 50/50. Tốc độ 1ml/phút. Nồng độ đệm 10mM, pH=5,0) Hình 3.9. Sự phụ thuộc k’ vào tỉ lệ ACN/MeOH (Dung môi hữu cơ/ đệm= 50/50. Tốc độ 1ml/phút. Nồng độ đệm 10mM, pH=5,0) Nhận thấy khi thành phần ACN cao, pic sắc ký xuất hiện sớm, hệ số k’ gần nhau, các chân pic tách nhau không rõ ràng , ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Khi giảm tỷ lệ ACN thì mất nhiều thời gian rửa giải chất ra khỏi cột hơn, hệ số k’ tăng, đồng thời pic bị doãng. Với những nhận xét như vậy, chúng tôi chọn tỷ lệ pha động như sau: ACN/ MeOH/ Đệm là 25/25/50. 3.4.3. Nồng độ đệm acetat của pha động Với các điều kiện đã lựa chọn, chúng tôi tiến hành khảo sát nồng