Luận văn Nghiên cứu khả năng sinh Aspergillus Niger Pectin Methylesterase trên cơ chất bã táo

phẩm rau muối chua, táo cắt lát, rau quả đóng hộp…). Trong quá trình làm trắng nguyên liệu ở nhiệt độ thấp, thời gian dài sẽ làm kích hoạt PME phân cắt nhóm ester của pectin, tạo điều kiện cho pectin liên kết với ion Ca2+ tạo cấu trúc theo mong muốn. Ảnh hƣởng của sự demethoxyl pectin đối với độ cứng mô thực vật bao gồm hai hiện tƣợng: ở mô chƣa xử lý, sự hiện diện các nhóm carboxyl tự do làm tăng khả năng tạo thành và độ bền của phức calci giữa hai mạch pectin, và ở mô đã xử lý nhiệt sẽ có sự gia tăng liên kết với ion Ca2+ và làm giảm nguy cơ bị tự phân cắt hay còn gọi là β–elimination (Sajjaanatukal and Van Buren, 1989). Tuy nhiên, một vài loại trái cây chỉ chứa một lƣợng rất nhỏ PME nội bào. Do đó nhiều phƣơng pháp khác nhau đƣợc đề nghị để bổ sung enzyme vào mô thực vật Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 11 nguyên vẹn và cách đơn giản nhất là phƣơng pháp ngâm – thấm thụ động. Tuy nhiên đây là một quá trình xảy ra chậm và sự thấm enzyme vào mô chỉ giới hạn ở bề mặt. Vì thế cần có sự hiện diện của các chất phụ gia. Nếu trong mô có khoảng không chứa khí đáng kể thì phải tiến hành dƣới áp lực trực tiếp hoặc là chân không. Kỹ thuật trong trong chân không (vacuum infusion–VI) đƣợc sử dụng trong nhiều quá trình chế biến khác nhau để cải thiện chất lƣợng về cấu trúc của sản phẩm hoặc tạo sự đồng nhất của các thành phần chức năng trong sản phẩm. Ngâm bằng kỹ thuâṭ chân không áp dụng cho trái đào cắt nửa với PME của bƣởi và CaCl2 đã làm tăng đáng kể độ cứng của trái đào đóng hộp. Theo Baker và Wicker (1996), có mối tƣơng quan giữa mức độ ester hóa của pectin với khả năng cải thiện độ cứng. VI của PME nấm mốc với CaCl2 đƣợc khảo sát thấy có hiệu quả cải thiện độ cứng cho dâu tây cắt nửa lạnh đông. Trong lĩnh vực chăn nuôi, ngƣời ta cho thêm chế phẩm pectinase vào thức ăn có chứa nhiều cellulose để làm tăng quá trình hấp thu thức ăn của gia súc, vì nó góp phần vào việc thủy phân chất pectin, cellulose có trong thức ăn. Lƣợng chế phẩm pectinase thƣờng dùng là 0,03 ÷ 0,05% so với nguyên liệu. PME có tính đặc hiệu cao và chỉ tác dụng lên một cơ chất nhất định là pectin. Chính vì thế, đặc điểm tính chất của pectin cũng cần đƣợc quan tâm. 2.3 PECTIN 2.3.1 Cấu tạo hóa học của pectin Pectin là một polymer đƣợc hình thành chủ yếu nhờ những đơn vị acid polygalacturonic (GalA) gắn kết nhau bởi các liên kết α – 1,4 glycoside. Trong pectin tự nhiên có khoảng hai phần ba nhóm acid đƣợc ester hóa bằng methanol. Tùy thuộc vào nguồn pectin mà pectin có khối lƣợng phân tử từ 80.000 ÷ 200.000 (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004). Pectin trong thƣơng mại có hàm lƣợng acid galacturonic thƣờng hơn 75% và độ ester hóa từ 30 ÷ 80% (Ly Nguyen, 2004). Pectin không hòa tan trong rƣợu và các dung môi hữu cơ khác. Pectin hòa tan trong nƣớc, amoniac, dung dịch kiềm, carbonate natri và glycerine nóng. Độ hòa tan của pectin trong nƣớc tăng lên khi mức độ ester hóa trong phân tử pectin tăng và khi khối lƣợng phân tử pectin giảm (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004). Cấu trúc của pectin gồm chủ yếu các đơn vị galacturonic acid mặc dù chúng có thể đƣợc cấu tạo từ 17 loại monosaccharide khác nhau. Có 3 loại pectic polymer chính cấu thành pectin: homogalacturonan (HG), rhamnogalacturonan I (RGI) và rhamnogalacturonan II (RGII). Bên cạnh 3 loại polysaccharide chính kể trên, một số dẫn xuất khác của galacturonan cũng đƣợc tìm thấy trong vách tế bào của những Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 12 loại thực vật đặc biệt, chẳng hạn xylogalacturonans và apiogalacturonans (Ridley et al., 2001). Hình 5: Cấu tạo phân tử pectin Nguồn: Brent L. Ridley et al., 2000 Mặc dù cấu tạo của các pectic polymer đã đƣợc biết đến khá nhiều nhƣng cách kết hợp các phần tử nhỏ lại thành một đại phân tử vẫn chƣa sáng tỏ. 2.3.2 Mức độ ester hóa của pectin Pectin có thể đƣợc phân loại dựa vào chỉ số mức độ ester hóa DE (Degree of esterification). Theo đó, pectin đƣợc chia thành ba nhóm: ­ Pectin có DE rất cao gần 100%, ­ Pectinic acid có DE trung bình, ­ Pectic acid có DE rất thấp hoặc không có. Mức độ ester hóa của các hợp chất pectin chi phối khả năng phản ứng của các enzyme có liên quan. Bảng 2: Hàm lƣợng pectin và mức độ ester hóa pectin ở một số loại trái cây Loại trái cây Hàm lƣợng pectin % Mức độ ester hóa DE% Táo Nho Vỏ cam Lê Khóm Dâu tây 0,5 ÷ 1,6 0,1 ÷ 1,4 3,5 ÷ 5,5 0,7 ÷ 0,9 0,04 ÷ 0,1 0,5 ÷ 0,7 80 ÷ 92 50 ÷ 65 65 50 ÷ 70 22 ÷ 40 20 ÷ 60 Nguồn: Wolfgang Aehle, 2004 Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 13 Mức độ este hóa của pectin cho thấy khả năng liên kết với các ion kim loại, đặc biệt là những ion có hóa trị II. Khi hai nhóm carboxyl tự do của hai chuỗi HG đứng cạnh nhau sẽ tạo nên một vùng tích điện âm, vùng này có thể đƣợc điều tiết bởi ion kim loại hóa trị II nhƣ Ca2+. Bằng cách này mà gel calci pectate có thể đƣợc tạo thành. Phải có ít nhất chín đơn vị GalA chƣa ester hóa để tạo nên liên kết ngang bền vững giữa các chuỗi (Liners et al., 1992). 2.3.3 Vai trò chuyển hóa pectic trong sự thay đổi cấu trúc tế bào thực vật Cấu trúc vách tế bào thực vật có thể đƣợc chia thành ba lớp: phiến giữa (lớp chung– middle lamella), vách sơ cấp (primarry wall), vách thứ cấp (secondary wall) (Brett and Waldron, 1996). Giữa hai vách sơ cấp của các tế bào liền kề nhau là phiến giữa, là một lớp mỏng giàu chất bột đƣờng đa là pectin, thƣờng hiện diện dƣới dạng calci pectate (hình 6). Hình 6: Cấu tạo phức chất calci pectate Nguồn: Buchanan et al., 2000; trích dẫn bởi Kalamaki et al., 2006 Khi quả chín, pectin hóa nhày nên các tế bào không còn gắn chặt vào nhau nữa, quả bị mềm đi. Trên vách tế bào thực vật có những lỗ nhỏ giúp các chất thông thƣơng với nhau, các lỗ này đƣợc gọi là cầu liên bào (plasmodesmata) ở vị trí này tế bào chất của hai tế bào liền kề liên tục nhau (Brett and Waldron, 1996). Trong thực vật, pectin tồn tại dƣới ba dạng: pectin hoà tan, pectinic acid và protopectin. ­ Pectin hòa tan là ester methylic của acid polygalaturonic pectin, trong tự nhiên có khoảng 2/3 số nhóm carboxyl của polygalacturonic acid đƣợc ester hóa bằng methanol. Pectin đƣợc ester hóa sẽ tạo gel đặc trong dung dịch acid và trong dung dịch đƣờng có nồng độ cao (khoảng 60  65%). Enzyme pectinase tác Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 14 động lên các hợp chất pectin có khối lƣợng phân tử khác nhau và cấu trúc hóa học không đồng dạng (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004). ­ Pectinic acid là polygalacturonic acid có một phần nhỏ các nhóm carboxyl đƣợc ester hóa bằng methanol. ­ Protopectin tạo độ cứng cho quả xanh, không tan trong nƣớc và có cấu tạo hóa học phức tạp. Protopectin khi bị thủy phân bằng acid thì giải phóng pectin hòa tan. Trong quá trình chín, sự hòa tan của các pectic polymer là một hoạt động có liên quan tới các enzyme giảm cấp pectin nhƣ protopectinase, polygalacturonase (PG), PME và β–galactosidase. Khi xử lí nhiệt, protopectin sẽ bị thủy phân thành pectin hòa tan mà kết quả là làm mềm rau quả. Trong chế biến nhiệt, cần thiết tạo phản ứng giữa pectin hòa tan với ion calci để tạo phức calci–pectate. Đây là dạng muối không hòa tan trong nƣớc và lấp đầy các mô rau quả làm cho cấu trúc sản phẩm trở nên rắn chắc hơn. 2.4 QUÁ TRÌNH TRÍCH LY ENZYME PME TỪ NẤM MỐC A. NIGER TRÊN CƠ CHẤT BÃ TÁO 2.4.1 Khái quát về nguyên liệu táo Táo ta có tên khoa học là Ziziphus nummularia thuộc họ Rhamnaceae. Đây là loài cây ăn quả của vùng nhiệt đới, là loại cây đƣợc trồng khá phổ biến ở đồng bằng sông Cửu Long. Cây có thể lớn rất nhanh thậm chí trong các khu vực khô và cao tới 12 mét và đạt tuổi thọ 25 năm. Quả là loại quả hạch, khi chín nó mềm, chứa nhiều nƣớc, có vị ngọt. Các quả chín vào các khoảng thời gian khác nhau ngay cả khi chỉ trên một cây và có màu lục nhạt khi còn xanh và vàng nhạt khi chín. Kích thƣớc và hình dạng quả phụ thuộc vào các giống khác nhau trong tự nhiên cũng nhƣ loại đƣợc trồng. Quả đƣợc dùng để ăn khi đã chín hoặc ngâm rƣợu hay sử dụng để làm đồ uống. Nó là một loại quả giàu chất dinh dƣỡng và chứa nhiều vitamin C. Khi chƣa chín, lớp cùi thịt có màu trắng, giòn, nhiều nƣớc, vị từ chua tới ngọt, có tính chất làm se nhẹ, tƣơng tự nhƣ ở quả táo tây dại. Quả đã chín ít giòn hơn và chuyển dần sang dạng bột; quả quá chín nhăn nhúm, lớp cùi thịt có màu vàng sẫm, mềm, xốp và có mùi thơm. Lúc đầu hƣơng vị giống nhƣ quả táo tây và dễ chịu nhƣng nó trở thành có mùi xạ kỳ lạ khi đã chín kỹ. Quả chứa một hột cứng hình ôvan hay thuôn dài. Hột chứa 2 hạt hình elip, màu nâu, dài 6 mm. Táo là một trong những loại quả chứa rất nhiều chất dinh dƣỡng quý giá và giúp chữa rất nhiều bệnh nguy hiểm: giảm các bệnh đƣờng ruột, hạ lƣợng cholesterol trong máu, ngăn ngừa bệnh ung thƣ… Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 15 Hình 7: Trái táo (Ziziphus nummularia) Táo cũng giống nhƣ nhiều loại quả khác có rất nhiều pectin đặc biệt là phía trong lõi (Joshi, 2006), nên đƣợc chọn làm cơ chất để nuôi cấy nấm mốc sinh tổng hợp PME. Bảng 3: Thành phần pectin của táo và một số loại trái cây Trái cây Pectin (% w/w) Loại pectinase pH Táo Chuối Sơri Cam 0,7 – 0,8 0,5 – 0,6 0,2 – 0,3 0,6 – 0,9 PE – PG PE – PG PE PE 3,5 3,2 3,0 2,2 Nguồn: Bollag, 1991 2.4.2 Giống vi sinh vật Enzyme pectinmethylesterase từ vi sinh vật đƣợc sản xuất dƣới nhiều dạng khác nhau nhƣ dạng thô, dạng tinh khiết, dạng tinh thể. Tuy nhiên, chúng đều đƣợc sản xuất bằng hai phƣơng pháp nuôi cấy trên môi trƣờng rắn và trên môi trƣờng lỏng. PME có thể sản xuất từ nhiều nguồn nấm mốc và vi khuẩn, trong đó Aspergillus niger là một trong những chủng đƣợc sử dụng phổ biến (Schmitz, 2002). Aspergillus niger thuộc lớp nang khuẩn Ascomycetes, bộ cúc khuẩn Plectascales, họ Aspergillaceae. Khuẩn ty có vách ngăn. Trên đầu tế bào hình chai mọc các cuống sinh bào tử đính. Bào tử đính là tập hợp của những khuẩn ty cao xuất phát từ một tế bào lớn. Các nang quả phình to ở nang trên, chổ phình to có dạng hình cầu, hình bầu dục hoặc hình chùy đƣợc gọi là túi định. Xung quanh túi định có rất nhiều những mầm nhỏ gọi là thể bình mọc ra khắp mọi hƣớng, ở phần cuối của các mầm này gọi là các bào tử đính. Các bào tử đính xòe ra nhƣ những bông hoa cúc và mang màu sắc đặc trƣng cho từng loài. Aspergillus niger có bào tử đính màu đen. Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 16 Hình 8: Hình dạng nấm mốc Aspergillus niger Nguồn: cialtyID=14 Pectinases từ nguồn nấm mốc, đặc biệt là A. niger, thƣờng đƣợc sử dụng phổ biến trong công nghệ chế biến nƣớc quả, kế đến là cellulases và hemicellilases với doanh số thu đƣợc từ 3 dạng enzyme này xấp xỉ 20% một triệu dollar Mỹ thu đƣợc hàng năm đối với các enzyme công nghiệp khác (Kashyap et al., 2001). Các enzyme này thƣờng đƣợc sử dụng trong sản xuất các loại nƣớc quả trong nhƣ nƣớc táo, lê, nho,… và một lƣợng nhỏ sử dụng trong chế biến các dạng nƣớc quả có độ đục ổn định nhƣ nƣớc chanh, nƣớc mận. A. niger sản xuất nhiều loại enzyme tác động trên phần homogalacturonan của phân tử pectin. Chúng bao gồm pectin methylesterase (EC 3.1.1.11) và pectin acetylesterase (EC 3.1.1.6), endopolygalacturonase (EC 3.2.1.15), exopolygalacturonase (EC 3.2.1.67), … Hoạt động của pectin methylesterase cần thiết để tạo ra pectin có độ methylester thấp (pectate), nguồn cơ chất cho polygalacturonase và pectate lyase. Trong khi đó pectin lyase có thể sử dụng cơ chất có độ methyl ester bất kỳ. Hệ enzyme pectinolytic từ A.niger có nhiều ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và thức uống. Tuy nhiên, các enzyme này thƣờng ở dạng hỗn hợp, gây khó khăn cho việc ứng dụng chúng để tác động nhƣ các loại pectin công nghiệp, nhƣ trong các loại gel thực phẩm. Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 17 2.4.3 Môi trƣờng nuôi cấy Quá trình nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger sản xuất enzyme PME có thể đƣợc thực hiện theo cả hai phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt với môi trƣờng rắn và lên men chìm. Trong đó, phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt là phƣơng pháp tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trƣờng hay trên bề mặt vật liệu rắn, xốp, ẩm. Thông thƣờng, môi trƣờng dạng rắn với nguyên liệu chín là bột cám mì, bã củ cải, bột bắp nghiền, hạt thóc nẩy mầm, trấu và bổ sung thêm một số chất dinh dƣỡng khác (amonium sulfate, amonium chloride, amonium phosfate). Phƣơng pháp này phát triển rất mạnh từ những năm 1970 đến nay. Những ƣu điểm cơ bản của phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt: ­ Dễ thực hiện, quy tr ình công nghệ đơn giản ­ Lƣợng enzyme đƣợc tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thƣờng cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy chìm ­ Sản phẩm enzyme thô sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản. Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trƣờng rắn khi nuôi cấy bằng phƣơng pháp bề mặt trải qua các giai đoạn sau: (i) Giai đoạn 1: giai đoạn này kéo dài 10 ÷ 14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy, lúc này bào tử bắt đầu trƣơng nở và hô hấp. Ở giai đoạn này có xảy ra nhiều biến đổi: ­ Nhiệt độ tăng rất chậm ­ Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa ­ Thành phần dinh dƣỡng bắt đầu có sự thay đổi ­ Khối môi trƣờng còn rời rạc ­ Enzyme mới bắt đầu đƣợc hình thành. (ii) Giai đoạn 2: giai đoạn này kéo dài khoảng 14 ÷ 18 giờ. Trong giai đoạn này có những thay đổi cơ bản sau: ­ Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất mạnh, có thể nhìn rõ đƣợc sợi nấm ­ Môi trƣờng đƣợc kết lại khá chặt ­ Độ ẩm môi trƣờng giảm dần ­ Nhiệt độ môi trƣờng sẽ tăng nhanh có thể đạt đến 40 ÷ 45oC ­ Các chất dinh dƣỡng bắt đầu giảm nhanh, do sự đồng hóa mạnh của nấm sợi ­ Các enzyme đƣợc hình thành và enzyme nào có cơ chất cảm ứng trội hơn sẽ đƣợc tạo ra nhiều hơn ­ Lƣợng oxy trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần phải đƣợc thông khí mạnh là tốt nhất. Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 18 (iii) Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài khoảng 10 ÷ 12 giờ. Lúc này nhiệt độ khối môi trƣờng sẽ giảm dần, cƣờng độ hô hấp giảm dần một cách rõ rệt. Màu sắc của sợi nấm bắt đầu thay đổi và thể hiện màu đặc trƣng (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004). 2.4.4 Thu nhận enzyme Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận đƣợc chế phẩm enzyme. Chế phẩm này đƣợc gọi là chế phẩm thô vì ngoài thành phần enzyme ra chúng còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trƣờng và nƣớc có trong môi trƣờng. Tùy theo mục đích sử dụng, có thể dùng chế phẩm thô này ngay không cần qua quá trình tinh sạch. Trong những trƣờng hợp cần thiết khác, ta phải tiến hành làm sạch enzyme. Khi enzyme đƣợc tách hết nƣớc, sinh khối vi sinh vật và thành phần môi trƣờng và chúng ở dạng tinh thể, ta thu đƣợc chế phẩm enzyme sạch. Để thu nhận đƣợc chế phẩm enzyme PME tinh khiết thì chế phẩm enzyme thô phải đƣợc trích ly bằng phƣơng pháp kết tủa nhờ dung môi hữu cơ hay muối trung tính. Muối trung tính nhƣ amonium sulfate, natri chloride thƣờng đƣợc sử dụng để kết tủa enzyme vì độ hoà tan của muối rất cao, sự kết tủa không phụ thuộc vào nhiệt độ, không làm biến tính enzyme, enzyme thu đƣợc có hoạt tính cao hơn so với các enzyme thu đƣợc bằng phƣơng pháp sử dụng dung môi hữu cơ. Tuy nhiên, khi sử dụng muối trung tính cũng có nhƣợc điểm là lƣợng dung dịch dùng gấp 5 ÷ 6 lần dịch chiết enzyme và không thể tái thu hồi đƣợc dung môi. Để đảm bảo chế phẩm enzyme thu đƣợc không mất hoạt tính nhanh, ngƣời ta thƣờng sấy khô chế phẩm enzyme đến một độ ẩm thấp. Độ ẩm cần đạt sau khi kết thúc quá trình sấy thƣờng nhỏ hơn 10 %. Để đảm bảo hoạt tính enzyme không thay đổi, ta thƣờng sấy enzyme ở nhiệt độ 38 ÷ 40oC. Ở nhiệt độ này phần lớn enzyme ít bị biến đổi. Trong trƣờng hợp sấy ở nhiệt độ cao quá 40oC, enzyme rất dễ bị biến tính (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004). 2.4.5 Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng tổng hợp PME 2.4.5.1 Ảnh hưởng của loại nguyên liệu Thành phần môi trƣờng là yếu tố cơ bản nhất quyết định khả năng sinh PME cũng nhƣ các enzyme khác tƣ̀ vi sinh vâṭ . Trong đó , thành phần pectin giữ vai trò rất quan troṇg (Patil, 2006). Hàm lƣợng pectin cao đƣơc̣ biế t đến nhƣ nguồn cơ chất thích hợp cho việc sản xuất pectinase nguồn gốc vi sinh . Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 19 2.4.5.2 Độ ẩm Độ ẩm cao ảnh hƣởng đến độ thoáng khí, thấp quá sẽ kìm hãm sự sinh trƣởng và phát triển của nấm sợi cũng nhƣ khả năng tạo enzyme. Theo Nguyễn Đức Lƣợng (2004) trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối thích của môi trƣờng là 58 ÷ 60% và phải giữ cho độ ẩm của môi trƣờng ổn định trong quá trình nuôi. Độ ẩm tăng quá 70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn độ ẩm thấp hơn 50  55% thì sẽ kiềm hãm sự sinh trƣởng và phát triển của vi sinh vật cũng nhƣ tạo enzyme (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004). Khi nuôi cấy trong điều kiện không đƣợc vô trùng tuyệt đối thì độ ẩm môi trƣờng sau khi cấy giống không đƣợc vƣợt quá 60%, vì cao hơn sẽ dễ bị nhiễm khuẩn. 2.4.5.3 Nhiệt độ nuôi Nhiệt độ cao quá hoặc thấp quá đều ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của nấm mốc, kéo theo sự giảm hoạt lực của enzyme. Nấm mốc Aspergillus niger phát triển thích hợp ở nhiệt độ 30oC (Schmitz, 2002). 2.4.5.4 Thời gian nuôi Thời gian nuôi để thu đƣợc lƣợng enzyme lớn thƣờng đƣợc xác định bằng thực nghiệm. Sự tạo bào tử là hiện tƣợng không mong muốn vì thƣờng làm giảm hoạt tính enzyme. Đối với nấm sợi Aspergillus niger, sự tạo enzyme cực đại thƣờng kết thúc khi nấm bắt đầu sinh đính bào tử (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004). 2.4.5.5 pH Khi nuôi cấy bằng phƣơng pháp bề mặt thƣờng ít ảnh hƣởng do môi trƣờng có dung dịch đệm cao và hàm ẩm thấp, pH không thay đổi trong quá trình nuôi. Tuy nhiên, pH ban đầu của môi trƣờng có ảnh hƣởng không nhỏ đến sự phát triển của nấm sợi và sự tạo thành enzyme. pH tối thích của enzyme có nguồn gốc vi sinh vật trong khoảng 4,5 ÷ 5,5 (Trần Xuân Ngạch, 2007). 2.5 MỘT SỐ KẾT QUẢ ĐÃ NGHIÊN CỨU Sun Zhong-Tao (2008) đã nghiên cứu sản xuất pectinase từ hai dòng Aspergillus niger đã đƣợc phân lập trên cơ chất bã táo (apple pomace). Nghiên cứu sản xuất PME từ Curvularia inaequalis trên cơ chất vỏ cam trong môi trƣờng rắn cũng đã đƣợc Afifi et al. (2002) nghiên cứu. Nhìn chung, đăc̣ điểm thành phần cơ chất giàu pectin và điều kiêṇ môi trƣờng là yếu tố chi phối maṇh đến hiêụ quả lên men sinh PME tƣ̀ vi sinh vâṭ. Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 20 Với thành phần pectin trong haṭ hƣớng dƣơng là 21,36%, Patil và Dayanand (2006) đã xác nhận tính khả thi của việc sử dụng hạt hƣớng dƣơng trong sản xuất PME từ Aspergillus niger cho cả hai trƣờng hơp̣ lên men rắn và lên men chìm . PME đã đƣợc phân lập bằng việc lên men các dòng Aspergillus (Polizeli, 1991), đặc biệt là Aspergillus niger đã đƣợc khảo sát khá chi tiết với hai phƣơng thức lên men chìm và lên men nổi (Joshi et at., 2006) trên nhiều loại cơ chất khác nhau (Schmitz, 2002). Theo Trần Xuân Ngạch (2007), PME nấm mốc có nhiệt độ hoạt động tối thích trong khoảng từ 30 – 45oC và bị vô hoạt ở 55  62oC và đƣợc hoạt hóa bởi Ca2+ và Mg2+. Phƣơng pháp trích ly PME cũng đƣợc nghiên cứu (Contreras–Esquivel, 1999). Kết quả cho thấy dung dịch NaCl 0,5% và 0,1% đƣợc sử dụng trích ly PME từ vỏ quả chanh (Mexico lime) và vỏ quả lê (prickly pear) cho hiệu quả trích ly cao nhất. Sử dụng bã táo (apple pomace) nhƣ nguồn cơ chất cho sự phát triển của A. niger sinh PME cũng đã đƣợc chứng minh bởi Joshi (2005). Nghiên cứu của Joshi (2006) về việc sản xuất pectin methylesterase (PME) từ Aspergillus niger trên cơ chất bã táo cho thấy, nhiêṭ đô ̣ủ 25oC, điều kiêṇ pH phản ƣ́ng 4,0 và thời gian ủ là 96 giờ là điều kiêṇ tối ƣu cho viêc̣ lên men sinh PME ở cả môi trƣờng rắn (SSF) và cả môi trƣờng chìm (SmF). Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 21 CHƢƠNG 3 PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 PHƢƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM 3.1.1 Thời gian địa điểm Địa điểm: Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng - Trƣờng Đại học Cần Thơ . Thời gian thực hiện: từ ngày 02/02/2009 đến ngày 05/05/2009. 3.1.2 Dụng cụ - hóa chất 3.1.2.1 Dụng cụ - thiết bị ­ Máy xay sinh tố ­ Máy đo độ ẩm nhanh AD 50 MX ­ Máy đo quang phổ Spectrophotometer (CECIL, UK) ­ Tủ cấy, tủ ủ ­ Pipetman 1mL ­ Thiết bị thanh trùng ­ Máy khuấy từ ­ Bếp gia nhiệt ­ pH kế ­ Dụng cụ thủy tinh thông thƣờng ­ Một số dụng cụ khác 3.1.2.2 Hóa chất ­ NaCl 0,25M ­ Cồn 96° ­ Bromocresol green ­ Amonium sulfate (NH4)2SO4 ­ Pectin táo, DE 70 ÷ 75% (Fluka). 3.1.3 Nguyên liệu táo Táo ta quả tròn, đƣợc mua ở chợ Xuân Khánh để dùng cho các thí nghiệm. Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 22 3.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1 Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu Táo sau khi ép lấy nƣớc, phần bã còn lại đƣợc sấy khô một phần (10 ÷ 11% ẩm). Sau đó, bã đƣợc tách loại nƣớc ở nhiệt độ 60  1 oC đến khi độ ẩm còn 4  1%, trong khoảng 3 ÷ 4 giờ. Bã táo khô đƣợc nghiền thành bột và đóng gói trong bao PE để sử dụng cho các thí nghiệm. 3.2.2 Phƣơng pháp xử lý số liệu Số liệu đƣợc xử lý bằng việc sử dụng phần mềm Statgraphic Plus 4.0. Sử dụng phƣơng pháp phân tích phƣơng sai (ANOVA) để đƣa ra kết luận về sự sai biệt giữa các giá trị trung bình các nghiệm thức. Các số trung bình đƣợc so sánh bằng phƣơng pháp LSD. 3.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 3.3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng giữa tỉ lệ pha loãng của cơ chất và nƣớc đến khả năng tổng hợp PME của A.niger 3.3.1.1 Mục đích Xác định cơ chất thích hợp và tỷ lệ pha loãng sử dụng cho việc trích ly PME có hoạt tính cao nhất. 3.3.1.2 Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí một nhân tố và ba lần lặp lại. Nhân tố A: tỉ lệ pha loãng của cơ chất và nƣớc. A1 = 1: 2 A2 = 1: 3 A3 = 1: 4 A4 = 1: 5 A5 = 1: 6 Số nghiệm thức: 5 Số mẫu thí nghiệm: 5 x 3 = 15 mẫu 3.3.1.3 Tiến hành thí nghiệm Cân 5 g bột táo cho vào bình nón 100 mL, thêm nƣớc với các tỉ lệ khác nhau (1: 2, 1: 3, 1: 4, 1: 5 và 1: 6) sau đó thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. Làm mát, cho 2 mL huyền phù bào tử với mật số cố định là 103 cfu/mL vào mỗi bình cấy và ủ ở Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 23 nhiệt độ phòng trong thời gian 96 giờ. Đo độ ẩm đạt đƣợc của mỗi bình để làm thông số theo dõi. Tỉ lệ bột táo và nƣớc cho enzyme PME có hoạt tính cao nhất sẽ đƣợc chọn sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Hình 9: Sơ đồ thí nghiệm ảnh hƣởng giữa tỉ lệ pha loãng của cơ chất và nƣớc đến khả năng tổng hợp PME của nấm mốc 3.3.1.4 Chỉ tiêu theo dõi Độ ẩm môi trƣờng và hoạt tính của PME (U/mL) tƣơng ƣ́ng với tƣ̀ng nghiêṃ thƣ́c thí nghiệm. 3.3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của thời gian ủ đến khả năng tổng hợp PME của nấm mốc Aspergillus niger 3.3.2.1 Mục đích Xác định thời gian ủ thích hợp cho nấm mốc phát triển sinh tổng hợp PME đạt hiệu suất và hoạt tính cao nhất. Môi trƣờng Pha loãng Làm nguội Nuôi cấy vi sinh vật Thu nhận enzyme Aspergillus niger Ủ Đo hoạt tính enzyme pectinmethylesterase Thanh trùng A1 A2 A3 A4 A5 Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 24 3.3.2.2 Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí có một nhân tố và ba lần lặp lại. Nhân tố B: Thời gian ủ ( giờ) B1= 48 giờ B2= 72 giờ B3= 96 giờ B4=120 giờ B5= 144 giờ Số nghiệm thức: 5 Số mẫu thí nghiệm: 5 x 3 = 15 mẫu 3.3.2.3 Tiến hành thí nghiệm Cân 5 g bột táo cho vào bình nón 100 mL, thêm nƣớc theo tỉ lệ tối thích ở thí nghiệm trên. Sau đó tiến hành thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. Làm mát các bình này sau khi thanh trùng, kế đến cho 2 mL huyền phù bào tử (103 cfu/mL) vào mỗi bình. Các bình cấy đƣợc ủ ở nhiệt độ phòng. Tiến hành đo hoạt tính ở các mức thời gian khảo sát. Chọn thời gian tối ƣu nhất sử dụng cho các thí nghiệm sau. Hình 10: Sơ đồ thí nghiệm ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng tổng hợp PME của nấm mốc Môi trƣờng Pha loãng Làm nguội Thanh trùng Thu nhận enzyme Đo hoạt tính enzyme pectinmethylesterase Aspergillus niger Nuôi cấy vi sinh vật Ủ B1 B2 B3 B4 B5 Luâṇ văn