Luận văn Nghiên cứu sử dụng nấm lecanicillium kí sinh côn trùng để kiểm soát rệp hại rau

c nấm khác, sự sinh bào tử của Lecanicillium chịu ảnh hưởng chủ yếu của một số yếu tố như nguồn cơ chất, nguồn carbon và nitơ bổ sung, chất khoáng, nhiệt độ, độ ẩm, độ thoáng khí và ánh sáng. 1.5 Ảnh hưởng của môi trường lên sự sinh bào tử của nấm Lecanicillium 1.5.1 Nguồn carbon Cùng với nitơ, chất khoáng và nước, carbon là một trong bốn yếu tố không thể thiếu đối với mọi loài nấm cũng như vi sinh vật. Tuy nhiên, nồng độ carbon trong môi trường quá cao cũng có thể ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật. Gao và cộng sự (2009) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ carbon trong môi trường lên sự sinh bào tử của một số chủng nấm. Kết quả cho thấy, nồng độ carbon tốt nhất cho khả năng sinh bảo tử của chủng nấm Lecanicillium lecanii CA-1-G và M. anisopliae RS-4-1 là 4 g/l, Paecilomyces lilacinus IPC-P là 1 g/l, Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Trường Đại học KHTN 20 P. lilacinus M-14 là 2 g/l, Metarhizium anisopliae SQZ-1-21 là 16 g/l, Trichoderma viride TV-1 là 2 g/l [27]. Trong thực tế, nguồn carbon được sử dụng có thể là glucose, lactose, bột ngô, bột gạo, bột mì. Trong trường hợp nguồn carbon là bột ngũ cốc thì ngoài khả năng cung cấp cacbon, chúng còn cung cấp cả nitơ, chất khoáng và giữ luôn vai trò là giá thể. Shi và cộng sự (2009) đã dùng bột ngô, cám mì là nguồn carbon để sản xuất bào tử nấm Verticillium lecanii [74]. Feng và cộng sự (2000) đã dùng gạo và cám gạo để sản xuất bào tử nấm V. lecanii [26]. Pham và cộng sự (2010) đã sử dụng gạo làm nguồn carbon để sản xuất bào tử nấm Beauveria bassiana [62]. 1.5.2 Nguồn nitơ Nitơ được cung cấp từ nhiều nguồn khác nhau như muối ammonium, muối nitrate, peptone, cao nấm men, bột đậu tương hay chitin. Nguồn nitơ nào phù hợp cho sự sinh bào tử tùy thuộc vào từng chủng nấm. Nồng độ nitơ tối ưu cho sự sinh bào tử của nấm còn phụ thuộc vào tỉ lệ của nó so với cacbon. Trong nghiên cứu về sự ảnh hưởng của tỉ lệ C:N lên sự sinh bào tử của một số chủng nấm, Gao và cộng sự (2009) đã chỉ ra rằng tỉ lệ C:N phù hợp cho chủng nấm Lecanicillium lecanii CA-1-G, Paecilomyces lilacinus IPC-P và Metarhizium anisopliae RS-4-1 là 5:1, P. lilacinus M-14 và Trichoderma viride TV-1 là 10:1, M. anisopliae SQZ-1-21 là 80:1 [27]. Tuy nhiên, trong môi trường có nguồn dinh dưỡng tự nhiên là bột ngũ cốc, peptone, cao nấm men thì rất khó kiểm soát được hàm lượng nitơ cũng như tỉ lệ C:N. Shi và cộng sự (2009) đã dùng cao nấm men, peptone, bột đậu tương làm nguồn carbon để lên men Verticillium lecanii, kết quả là chủng nấm này sinh bào tử cao nhất với nguồn nitơ là cao nấm men [74]. Vu và cộng sự (2008) đã chọn được KNO3 với nồng độ 0,6% làm nguồn nitơ phù hợp cho sự sinh bào tử của Lecanicillium lecanii 41185 [81]. Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Trường Đại học KHTN 21 1.5.3 Nhiệt độ môi trường Dựa vào khoảng nhiệt độ thích nghi, vi sinh vật được chia ra thành 3 nhóm. Nhóm ưa lạnh sinh trưởng tốt ở nhiệt độ dưới 15°C, nhóm ưa ấm sinh trưởng tốt ở 20-37°C, nhóm ưa nhiệt sinh trưởng và phát triển tốt ở trên 50°C. Phần lớn nấm là vi sinh vật ưa ấm, phát triển tốt nhất ở 25-30°C. Nấm Lecanicillium spp. trong nghiên cứu của Kope và cộng sự (2008) sinh trưởng tốt nhất ở 25°C [49]. Chủng L. lecanii 41185 trong nghiên cứu của Vu và cộng sự (2008) sinh bào tử cao nhất ở 25°C [81]. Trong khi trong nghiên cứu của Arevalo và cộng sự (2009), L. psalliotae sinh trưởng tốt nhất ở 30°C [10]. 1.5.4 Độ ẩm không khí và độ ẩm cơ chất Nước là yếu tố không thể thiếu đối với mọi sinh vật nói chung và nấm nói riêng bởi vì tất cả phản ứng sinh hóa ở các cơ thể sống đều diễn ra trong môi trường nước. Nhìn chung, nấm có thể sinh trưởng trong giới hạn độ ẩm khá rộng, nấm sinh trưởng được trên gạo có độ ẩm 20% hay trong môi trường dinh dưỡng lỏng hoàn toàn. Tuy nhiên, mỗi loài nấm đòi hỏi độ ẩm tối ưu khác nhau, trên mỗi loại cơ chất thì độ ẩm tối ưu cho nấm phát triển cũng khác nhau. Theo Vu và cộng sự (2008), chủng L. lecanii 41185 sinh bào tử cao nhất ở độ ẩm không khí 75% và độ ẩm cơ chất 28,5% [81]. Trong nghiên cứu của Shi và cộng sự (2009), Verticillium lecanii được lên men ở độ ẩm không khí 97%, độ ẩm cơ chất là 7 ml nước/2 g bã mía [74]. Trong thí nghiệm của Xu và cộng sự (2011), V. lecanii cũng được lên men ở độ ẩm cơ chất 7 ml nước/2 g bã mía, nhưng độ ẩm không khí là 95% [84]. 1.5.5 Một số yếu tố khác Trong môi trường lên men rắn, nguồn cơ chất tự nhiên như bột gạo, bột ngô, bột đậu tương, lõi ngô ngoài khả năng cung cấp các chất dinh dưỡng (cacbon, nitơ, khoáng), chúng còn ảnh hưởng đến sự sinh bào tử của Lecanicillium vì mỗi nguồn cơ chất sẽ tạo độ thoáng khí, khả năng trao đổi nhiệt cho môi trường lên men khác nhau. Trong nghiên cứu của Shi và cộng sự (2009), Verticillium lecanii sinh bào tử Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Trường Đại học KHTN 22 trên cơ chất bã mía tốt hơn trên cơ chất cám mì [74]. Từ nhiều nguồn cơ chất như cám mì, gạo, trấu, than bùn, gạo trộn cám gạo, gạo trộn bột mì, gạo trộn gạo tấm, Vu và cộng sự (2008) đã chọn được gạo là nguồn cơ chất tốt nhất để lên men Lecanicillium sản xuất bào tử [81]. Mặc dù chất khoáng có mặt khá đầy đủ trong các môi trường giàu hay môi trường tự nhiên nhưng tùy thuộc vào thành phần môi trường mà hàm lượng chất khoáng khác nhau và có thể không tối ưu cho việc sinh bào tử của Lecanicillium. Trong nghiên cứu của Vu và cộng sự (2008), chủng L. lecanii 41185 sinh bào tử cao nhất khi môi trường được bổ sung 0,6% KNO3 và 0,02% MgSO4 [81]. Chủng V. lecanii trong nghiên cứu của Shi và cộng sự (2009) lại sinh bào tử cao nhất khi môi trường được bổ sung 0,163% KH2PO4, 0,0325% K2HPO4 và 0,0325% MgSO4 [74]. Một số yếu tố khác cũng ảnh hưởng đến sự sinh bào tử của nấm Lecanicillium như pH, độ thoáng khí hay ánh sáng. Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Trường Đại học KHTN 23 2 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị 2.1.1 Chủng giống và plasmid Bảy chủng nấm Lecanicillium L18, L43, L85, 85k, 485, 8514 và L1185 do Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học, Viện KH và CN Việt Nam cung cấp. Chủng E. coli DH5α (Invitrongen, Mỹ) được sử dụng để nhân plasmid. Plasmid pJET1.2/blunt (Fermentas, Litva) kích thước 2974 bp, có T7 promoter, gene kháng kháng sinh ampicillin (Ampr). Rệp hại rau lấy trên rau cải ngoài đồng ruộng sau đó được nuôi trên cải thảo trong phòng thí nghiệm. Dựa trên các đặc điểm hình thái và cây chủ, rệp này bước đầu được nhận định thuộc loài Myzus persicae. 2.1.2 Hóa chất Các hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết: Agarose từ Rockland (Mỹ); Tween 80, chloroform/isoamyl aclohol (24:1) của Merck (Đức); Ethidium bromide, T4 ligase, Taq polymerase, protease K, RNase, enzyme giới hạn của Fermentas (Litva); mồi của Invitrogen (Mỹ), ampicillin của Mekopha (Việt Nam). Các hóa chất khác để pha môi trường: Peptone của Merck; cao nấm men của Difco (Mỹ); NaNO3, KNO3, NH4NO3, (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4, MgSO4, KH2PO4 của Trung Quốc; glucose của Việt Nam. Một số vật liệu cần thiết khác như cải thảo, khoai tây, gạo, ngô, cám gạo, lõi ngô, bã mía được mua và thu thập tại khu vực Hà Nội. Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Trường Đại học KHTN 24 2.1.3 Dung dịch và đệm Bảng 2.1. Các dung dịch và đệm Dung dịch Thành phần, nồng độ Dung dịch phá tế bào 100 mM Tris, 100 mM EDTA, 2% SDS, pH 8 Dung dịch protease K 20 μg/ml protease K Dung dịch RNase 10 μg/ml RNase Đệm tra mẫu DNA 5x 0,09% (w/v) Brommophenol Blue; 0,09% (w/v) xylene xyanol (FF); 60% (v/v) glycerol Đệm TBE 10x 108 g Tris base; 55 g boric acid; 40 ml 0,5 M EDTA pH 8 Đệm TE 100 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA; pH 8,0 Sol I 50 mM glucose; 25 mM Tris-HCl; 10 mM EDTA; pH 8 Sol II 0,2 N NaOH; 1% SDS Sol III 60% potassium acetate; 11,5% (v/v) acid acetic 2.1.4 Môi trường nuôi cấy Môi trường PD (potato dextrose) (g/l): 20, khoai tây, đun sôi cách thủy 2 giờ thu dịch chiết; 10, glucose; 5,7 KNO3. Môi trường PDA (potato dextrose agar): môi trường PD được bổ sung 20 (g/l) agar. Môi trường LB (Luria-Bertani) (g/l): 10, peptone; 5, cao nấm men; 10, NaCl; pH 7,5. Môi trường rắn được bổ sung 20 agar. Môi trường chọn lọc khuẩn lạc mang plasmid được bổ sung 100 g/ml ampicillin. 2.1.5 Thiết bị Các thiết bị được sử dụng thuộc phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện KH và CN Việt Nam (bảng 2.2). Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Trường Đại học KHTN 25 Bảng 2.2. Các thiết bị Tên thiết bị Hãng sản xuất Bể ổn nhiệt Trung Quốc Box cấy LB-1234 Việt Nam Box cấy vi sinh vật clean bench TTCG công nghệ, Việt Nam Buồng đếm hồng cầu Hirschmann (Đức) Cân phân tích AB 240 Sartorius (Thụy Sỹ) Hệ thống chụp ảnh gel-doc Pharmacia (Thụy Điển) Hệ thống điện di ngang Mupid α (Nhật Bản) Kính hiển vi quang học Trung Quốc Lò vi sóng SamSung (Hàn Quốc) Máy chuẩn pH tự động 718 Stat Titrino Metrohm (Thụy Sỹ) Máy lắc nuôi cấy Certomat HK (Đức) Máy li tâm lạnh Mikro 22R Hettich (Đức) Máy PCR Mastercycler personal Eppendorf (Đức) Máy quang phổ UV-2500 LaboMed Inc (Mỹ) Nồi khử trùng ES-315 Tomy (Nhật Bản) Tủ lạnh 4C, -20C, -80C Toshiba, Sanyo (Nhật bản) 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Sàng lọc chủng nấm có độc lực diệt rệp cao Bảy chủng nấm Lecanicillium L18, L43, L85, 85k, 485, 8514 và L1185 được nuôi cấy 7-10 ngày trên đĩa môi trường PDA ở 27-30°C, bào tử được thu trong dung dịch Tween 80 (0,05%) và được điều chỉnh về mật độ 3×108/ml. Lá cải thảo tươi, kích thước 10-15×20-25 cm, không bị bệnh, không bị rách được giữ tươi bằng cách đặt phần cuống lá vào đĩa agar-nước sau đó được đặt vào hộp nhựa trong suốt và cho phép không khí lưu thông dễ dàng. 40 con rệp khỏe mạnh, kích thước trung bình được thả lên mặt trên lá cải. Một ngày sau, rệp bò xuống mặt dưới lá, 30 con rệp khỏe mạnh được giữ lại, những con khác bị nhặt bỏ. Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Trường Đại học KHTN 26 20 ml dịch bào tử (mật độ 3×108/ml trong dung dịch 0,05% Tween 80 được phun đều dưới dạng sương cách 30 cm lên hai mặt lá (mẫu thí nghiệm). Dung dịch 0,05% Tween 80 được sử dụng để phun lên mẫu đối chứng. Số rệp chết và sống sót được đếm qua từng ngày cho đến ngày thứ 7, ngày phun được tính là ngày 0. Nhiệt độ và độ ẩm không khí được duy trì trong thời gian thí nghiệm lần lượt là 21-25°C và 75-80%. Thí nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần. Hình 2.1. Lá cải có rệp sau khi được phun dịch bào tử nấm Độc lực gây chết rệp của bào tử nấm được đánh giá theo phương pháp của Abbott (1925) [4]: + LT50 (Lethal Time) là thời gian cần thiết để bào tử nấm gây chết 50% số lượng rệp. Giá trị LT50 càng nhỏ thì độc lực của bào tử nấm đối với rệp càng mạnh. + Độc lực gây chết rệp của bào tử nấm được tính theo công thức: Kết quả sau đó được xử lí bằng phần mềm Microsoft office excel và phần mềm thống kê SAS. Khả năng gây chết rệp của bào tử nấm (%) Phần trăm (%) rệp sống sót ở lô thí nghiệm Phần trăm (%) rệp sống sót ở lô đối chứng = 1 – Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Trường Đại học KHTN 27 2.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử Tách chiết DNA tổng số: Nấm 485 được nuôi cấy 96 giờ trong môi trường PDA ở 30C, lắc 150 vòng/phút. Dịch nuôi được ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút. Tủa sợi nấm được nghiền nhẹ trong nitơ lỏng rồi bổ sung 600 µl đệm phá tế bào, lắc nhẹ, bổ sung tiếp 65 µl dung dịch lysozyme, ủ 37°C trong 45 phút. Hỗn hợp sau đó được bổ sung 5 µl dung dịch protease K, ủ 2-3 giờ ở 56°C. Bổ sung chloroform/isoamyl alcohol (24:1) với tỷ lệ 1:1 và ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C. 500 µl dịch nổi được chuyển sang ống eppendorf mới và bổ sung isopropanol theo tỷ lệ 1:1, để ở -20°C trong 2 giờ. Tủa sau khi ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C được làm khô dưới ánh sáng đèn sợi đốt và được bổ sung 500 µl ethanol 70% để rửa DNA, loại muối và isopropanol. Sau khi ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, tủa được làm khô và hòa trong 40 µl đệm TE và bảo quản ở -20°C. Khuếch đại gene bằng PCR: Để khuếch đại đoạn gene 28S rRNA từ chủng nấm 485, cặp mồi NL1-F (5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3') và NL4-R (5'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3') được sử dụng. Nhiệt độ gắn mồi của cặp NL1 và NL4 là 50°C. Hỗn hợp phản ứng PCR gồm: 1 µl mồi mỗi loại; 2 µl dNTP; 1,5 µl MgCl2 25 mM; 2,5 µl đệm PCR 10x; 0,25 µl Taq; 1 µl khuôn DNA và bổ sung H2O cất tiêm lên tổng thể tích 25 µl. Phản ứng được thực hiện ở điều kiện: 95°C/4 phút, 35 chu kỳ (95°C/1 phút; 53°C/1 phút; 72°C/1 phút); 72°C/10 phút. Gắn sản phẩm PCR vào pJET1.2: Ủ hỗn hợp gồm 5 µl đệm 2x; 1,5 µl sản phẩm PCR; 0,5 µl enzyme blunting; 2,5 µl H2O ở 70°C trong 15 phút. Bổ sung 0,5 µl pJET1.2 và 0,5 µl T4 DNA ligase rồi ủ qua đêm ở 22°C. Biến nạp plasmid: Plasmid được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5 theo phương pháp sốc nhiệt và hóa học. Nguyên lý của phương pháp là E. coli được xử lý bằng CaCl2 giúp DNA dễ dàng bám dính vào màng tế bào, khi sốc nhiệt, các lỗ màng tế bào mở rộng làm các chuỗi DNA đi vào dễ dàng. Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Trường Đại học KHTN 28 Chuẩn bị tế bào khả biến: Khuẩn lạc E. coli được nuôi trong 2 ml LB lỏng, lắc 200 vòng/phút ở 37°C qua đêm. Nuôi lắc tiếp giống 1% ở 37°C trong 2-3 giờ đạt OD600nm 0,4-0,7. Dịch nuôi cấy để lạnh 30 phút cho ổn định rồi ly tâm thu tế bào 5000 vòng/phút trong 5 phút. Tế bào được ủ lần 1 với dung dịch 0,1 M CaCl2 trong 1 giờ, ly tâm thu tế bào. Rửa lần 2 với dung dịch 0,1 M CaCl2 trong 20 phút. Tế bào đã qua xử lý được hòa trong 100 l dung dịch 0,1 M CaCl2 để chuẩn bị biến nạp. Các thao tác được thực hiện ở điều kiện 4°C. Biến nạp plasmid vào E. coli: tế bào khả biến tươi hoặc lấy từ -80°C đã để 30 phút trong đá. Hút 40 µl dịch tế bào khả biến và 5 µl dung dịch nối ghép gene vào một ống eppendorf mới, đảo nhẹ nhàng rồi ủ trong đá 30 phút. Sau đó, hỗn hợp được sốc nhiệt 42°C trong 45 giây, lấy mẫu ra và đặt 5 phút trong đá. Bổ sung 250 µl môi trường LB lỏng và nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37°C trong 1 giờ. Cấy trải 100 µl dịch nuôi trên đĩa LB bổ sung ampicilin (100 µg/ml). Ủ ở 37°C qua đêm. Tách chiết plasmid: Mỗi khuẩn lạc đã được biến nạp mọc trên đĩa thạch được nhặt cấy vào 1,5 ml môi trường LB chứa ampicillin (100 µg/ml), nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37°C qua đêm. Tủa tế bào thu được sau khi ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút được bổ sung 150 µl Sol I rồi lắc rung 30 giây tạo thành dịch đồng nhất. Ủ dịch 15-20 phút ở nhiệt độ phòng, bổ sung 150 µl Sol II rồi đảo nhẹ, tiếp tục bổ sung 150 µl Sol III vào hỗn hợp và đảo nhẹ. Hỗn hợp được bổ sung 450 µl chloroform/isoamyl alcohol 24:1, lắc nhẹ và ly tâm 12500 vòng/phút trong 10 phút. 450 µl pha trên được hút sang ống eppendorf mới, bổ sung 320 µl isopropanol, lắc nhẹ và ủ 5 phút ở -80°C để tủa plasmid. Tủa plasmid thu được sau khi ly tâm 12500 vòng/phút trong 5 phút được rửa bằng 500 µl ethanol 70% ở 4°C để loại muối và isopropanol, làm khô trong không khí ở nhiệt độ phòng. Tủa plasmid được hòa trong đệm TE pH 8 hoặc nước khử ion vô trùng và điện di kiểm tra sản phẩm tách plasmid rồi bảo quản ở -20°C. Cắt plasmid bằng enzyme giới hạn: Để kiểm tra dòng plasmid lựa chọn có mang sản phẩm mong muốn hay không, plasmid tái tổ hợp từ các khuẩn lạc được cắt bằng cặp enzyme giới hạn XhoI và XbaI qua đêm ở 37C. Hỗn hợp phản ứng Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Trường Đại học KHTN 29 gồm 3 µl DNA plasmid tái tổ hợp; 0,5 µl enzyme giới hạn mỗi loại; 2 µl đệm Tango Y+ và bổ sung nước cất tiêm đến 10 µl. Sản phẩm cắt được điện di trên gel 0,8% agarose để kiểm tra. Đọc trình tự nucleotide: Sau khi plasmid tái tổ hợp được tinh sạch, đoạn DNA chèn vào plasmid được đọc trình tự nucleotide theo nguyên lý Sanger cải tiến dựa trên các dideoxy. DNA polymerase xúc tác gắn các dideoxynucleotide vào đầu 3'-OH mạch đơn DNA đang tổng hợp, quá trình tổng hợp sẽ dừng lại khi gặp dideoxynucleotide đánh dấu huỳnh quang không có nhóm 3'-OH. Kết quả là hỗn hợp sản phẩm sau phản ứng bao gồm các polynucleotide có kích thước hơn kém nhau một nucleotide và được phát hiện bằng mẫu dò huỳnh quang trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer. Vector pJET1.2 được gắn hai trình tự mồi xuôi và mồi ngược M13 (-20) để đọc trình tự phân đoạn chèn DNA ngoại lai. Kết quả đọc trình tự được phân tích, xử lý bằng phần mềm DNAStar để so sánh trình tự nucleotide, tính khoảng cách di truyền và xây dựng cây phân loại. 2.2.3 Xác định ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên sự sinh bào tử của chủng nấm 485 Chủng nấm 485 được nuôi cấy trên môi trường PDA ở 27-30°C trong 7-10 ngày, sau đó một miếng nấm trên đĩa thạch (1×1 cm) được cấy vào bình nón chứa 100 ml môi trường PD lỏng và được nuôi lắc 150 vòng/phút ở 27-30°C. Sau 4 ngày, dịch nuôi có mật độ bào tử 3-5×108/ml được cấy vào các bình nón 250 ml chứa cơ chất theo tỉ lệ 1 ml/10 g cơ chất. Sau khi lên men 10 ngày ở 27-30°C trong điều kiện tĩnh, bào tử được thu trong dung dịch 0,05% Tween 80 và được đếm dưới kính hiển vi quang học (độ phóng đại 640 lần) sử dụng buồng đếm hồng cầu. Các thí nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần. Kết quả được xử lí bằng phần mềm Microsoft office excel và phần mềm thống kê SAS. Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Trường Đại học KHTN 30 Ảnh hưởng của nguồn cơ chất: Tám cơ chất khác nhau đã được khảo sát: gạo, bột gạo, cám gạo, bột ngô, hỗn hợp bột lõi ngô/bột gạo (1:1, w/w), hỗn hợp bột lõi ngô/bột ngô (1:1, w/w), hỗn hợp bột bã mía/bột gạo (1:1, w/w) và hỗn hợp bột bã mía/bột ngô (1:1, w/w). Khối lượng cơ chất là 10 g/bình và các loại môi trường được bổ sung lượng nước lần lượt là 4; 4; 6; 4; 6; 6; 10 và 10 ml/bình. Ảnh hưởng của tỉ lệ các thành phần cơ chất: Thành phần bột lõi ngô và bột ngô đã được khảo sát ở các tỉ lệ 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7 và 2:8 (w/w). Khối lượng cơ chất là 10 g/bình, nước được bổ sung bằng 60% cơ chất. Ảnh hưởng của độ dày cơ chất: Sự sinh bào tử của chủng nấm 485 đã được khảo sát ở các độ dày cơ chất: 9; 11; 13; 15; 17,5; 20; 22,5; 25; 27,5 và 30 mm (tương đương với 6; 8; 10; 12; 14; 16; 18; 20; 22 và 24 g/bình). Với cơ chất là bột lõi ngô/bột ngô (1:1, w/w), nước được bổ sung bằng 60% cơ chất. Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất: Nước được bổ sung vào cơ chất theo các tỉ lệ 40; 50; 60; 70; 80; 90; 100 và 110% (so với khối lượng cơ chất) để đánh giá ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất lên sự sinh bào tử của chủng nấm. Với 10 g cơ chất bột lõi ngô/bột ngô (1:1, w/w) trong mỗi bình. Ảnh hưởng của nhiệt độ: Sự sinh bào tử của chủng nấm 485 đã được khảo sát ở 25; 28; 30 và 37°C. Với 10 g cơ chất bột lõi ngô/bột ngô (1:1, w/w) trong mỗi bình, nước được bổ sung bằng 60% cơ chất. Ảnh hưởng của một số nguồn nitơ vô cơ: Ảnh hưởng của năm nguồn nitơ khác nhau lên sự sinh bào tử của 485 đã được khảo sát: NaNO3; KNO3; NH4NO3; (NH4)2SO4; (NH4)2HPO4. Nguồn nitơ được bổ sung tương đương 0,1 mol N/1000 g cơ chất. Với 10 g cơ chất bột lõi ngô/bột ngô (1:1, w/w) trong mỗi bình, nước được bổ sung bằng 70% cơ chất. Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4: Để đánh giá ảnh hưởng của (NH4)2SO4 ở các nồng độ khác nhau lên sự sinh bào tử của chủng nấm 485, sáu nồng độ (NH4)2SO4 tương đương: 0; 0,02; 0,05; 0,10; 0,20 và 0,50 mol N/1000 g cơ Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Trường Đại học KHTN 31 chất đã được khảo sát. Với 10 g cơ chất bột lõi ngô/bột ngô (1:1, w/w) trong mỗi bình, nước được bổ sung bằng 70% cơ chất. Ảnh hưởng của nồng độ MgSO4: Để đánh giá ảnh hưởng của MgSO4 lên sự sinh bào tử của 485, sáu nồng độ: 0; 0,020; 0,030; 0,035; 0,040 và 0,050% (so với khối lượng cơ chất) đã được khảo sát. Với 22 g cơ chất bột lõi ngô/bột ngô (1:1, w/w) trong mỗi bình, nước được bổ sung bằng 70% cơ chất, bổ sung (NH4)2SO4 theo tỉ lệ 0,1 mol N/1000 g cơ chất. Ảnh hưởng của nồng độ KH2PO4: Sáu nồng độ: 0; 0,10; 0,15; 0,20; 0,25 và 0,30% (so với khối lượng cơ chất) đã được khảo sát để đánh giá ảnh hưởng của KH2PO4 lên sự sinh bào tử của 485. Với 22 g cơ chất bột lõi ngô/bột ngô (1:1, w/w) trong mỗi bình, nước được bổ sung bằng 70% cơ chất, bổ sung (NH4)2SO4 theo tỉ lệ 0,1 mol N/1000 g cơ chất. Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng: Trong thí nghiệm này, chủng 485 được lên men ở các điều kiện đã được tối ưu (30 ± 1°C, thành phần môi trường trong mỗi bình lên men: 22 g cơ chất bột lõi ngô/bột ngô (1:1, w/w), nước bằng 70% cơ chất, (NH4)2SO4 theo tỉ lệ 0,1 mol N/1000 g cơ chất, MgSO4 bằng 0,035% cơ chất, KH2PO4 bằng 0,1% cơ chất). Để đánh giá ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng lên sự sinh bào tử, chủng nấm được lên men ở ba chế độ chiếu sáng 0 giờ/ngày, 12 giờ/ngày và 24 giờ/ngày. Ảnh hưởng của thời gian lên men: Trong thí nghiệm này, chủng 485 được lên men ở các điều kiện đã được tối ưu (30 ± 1°C với chế độ chiếu sáng 12 giờ/ngày, thành phần môi trường trong mỗi bình lên men: 22 g cơ chất bột lõi ngô/bột ngô (1:1, w/w), nước bằng 70% cơ chất, (NH4)2SO4 theo tỉ lệ 0,1 mol N/1000 g cơ chất, MgSO4 bằng 0,035% cơ chất, KH2PO4 bằng 0,1% cơ chất). Để tìm thời gian lên men tối ưu cho sản xuất bào tử, chủng 485 đã được lên men và thu bào tử sau 6; 8; 10; 12 và 14 ngày. Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Trường Đại học KHTN 32 3 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Sàng lọc chủng nấm có độc lực cao Mỗi chủng nấm có độc lực khác nhau đối với từng loài rệp và trong từng điều kiện môi trường khác nhau. Dịch bào tử của bảy chủng nấm Lecanicillium spp. được phun lên rệp cải ở 21-25°C và độ ẩm không khí 75-80%, số lượng rệp cải sống sót được theo dõi sau bảy ngày phun. Kết quả chỉ có hai chủng 85k và 485 có khả năng diệt được 50% rệp trong thời gian 5 và 4 ngày. Năm chủng còn lại chưa xác định được thời gian để giết chết 50% rệp (hình 3.2). A B C Hình 3.1. Kết quả phun bào tử nấm lên rệp cải A. mẫu đối chứng; B. mẫu phun bào tử nấm; C. rệp bị chết bởi nấm được chụp qua kính hiển vi quang học Độc lực của các chủng nấm này khá yếu so với các chủng Lecanicillium trong nghiên cứu của Vu và cộng sự (2007). Trong nghiên cứu này, khi phun dịch bào tử có nồng độ 1×107 bào tử/ml (không có khác biệt nhiều so với nồng độ 1×108 bào tử/ml) ở 25°C và độ ẩm không khí 75%, chủng có độc lực mạnh nhất là L. lecanii 41185 có khả năng diệt 50% Myzus persicae và Aphis gossypii chỉ trong Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Trường Đại học KHTN 33 1,6 và 1,4 ngày. Chủng yếu nhất là L. fusisporum 4078 cũng diệt được 50% hai loại rệp trên trong 4,2 và 1,6 ngày [80]. Chủng Verticillium lecanii CS-625 trong nghiên cứu của Kim và cộng sự (2001) cũng diệt được 50% A. gossypii sau 2,7 ngày ở 20°C [47]. Sau 7 ngày phun, chủng 485 có khả năng diệt rệp cải cao nhất với 67 ± 7% rệp bị diệt, tiếp theo là chủng 85k với 57 ± 16% rệp bị diệt. Hai chủng có độc lực diệt rệp khá cao khác là L1185 ( diệt được 47 ± 14% rệp) và L43 (diệt được 46 ± 21% rệp). Chủng L18 hầu như không diệt được rệp, là chủng có độc lực yếu nhất (P < 0,01). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 1 2 3 4 5 6 7 Thời gian sau phun (ngày) T ỉ l ệ rệ p ch ết ( % ) Đối chứng L18 L43 L85 85k 485 8514 41185 Hình 3.2. Độc lực diệt rệp của 7 chủng Lecanicillium spp. Trong nghiên cứu của Kim và cộng sự (2008), chủng L. attenuatum CNU-23 với nồng độ bào tử 108/ml diệt được 80% M. persicae trong điều kiện 25 ± 2°C và độ ẩm 85 ± 5% [46]. Các chủng Lecanicillium trong thí nghiệm của Vu và cộng sự (2007) cũng diệt được 72 đến 100% rệp sau 4 đến 8 ngày phun ở điều kiện 25°C và độ ẩm 75% [80]. Trong phạm vi luận văn này, chủng 485 được chọn để tiếp tục tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. L Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Trường Đại học KHTN 34 3.2 Định tên chủng nấm 485 Chủng 485 được định tên bằng phương pháp đọc và so sánh trình tự gene 28S rRNA với trình tự của các chủng đã được công bố trên GenBank. DNA của chủng 485 sau khi tách chiết được điện di trên gel 0,8% agarose. DNA tổng số đủ độ tinh sạch để tiến hành PCR (hình 3.3A). Sản phẩm PCR trên gel agarose có một băng với kích thước khoảng 600 bp (hình 3.3B), đúng với kích thước của gene 28S rRNA được khuếch đại bởi cặp mồi NL1-F và NL4-R theo lí thuyết. Sản phẩm PCR được gắn trực tiếp vào vector pJET1.2 và được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α. Các dòng plasmid tái tổ hợp (hình 3.3C) được lựa chọn và cắt kiểm tra bằng XhoI và XbaI. Sản phẩm cắt trên gel agarose 0,8% cho hai băng DNA, một băng có kích thước khoảng 3000 bp tương ứng với vector pJET1.2, băng còn lại có kích thước khoảng 600 bp tương ứng với đoạn DNA ngoại lai (hình 3.3D). Hình 3.3. Điện di đồ DNA nhân gene 28S rRNA DNA tổng số (A); sản phẩm PCR (B): M. Marker, 1. sản phẩm PCR; Plasmid (C): ĐC. plasmid không mang gene 28S rRNA, P1, P2. plasmid mang gen 28S rRNA; sản phẩm cắt (D): M. Marker