Luận văn Nghiên cứu thành phần aglycon của loài thực vật tri mẫu

GC) [21]. Ngoài ra, cũng có một số tài liệu đề cập đến việc phân lập aglycon này từ loài Tri mẫu và thử nghiệm hoạt tính sinh học như hoạt tính bảo vệ tế bào, cải thiện trí nhớ, ức chế tế bào ung thư và hạ đường huyết [45], [46], [47], [51]. O CH3 CH3 CH3 O CH3 OH (44) Gần đây, một số nghiên cứu đã đề cập đến việc tối ưu hóa cấu trúc của sarsasapogenin nhằm nâng cao hoạt tính của aglycon này. Trong báo cáo gần đây nhất vào năm 2016, Che và các cộng sự [18] đã phân lập được sarsasapogenin từ loài Tri mẫu và tiến hành bán tổng hợp được 9 dẫn xuất trong đó dẫn xuất (48), (49), (53), (54) và (55) có khả năng ức chế Aβ42 trên tế bào N2A-APPswe tốt hơn so với sarsasapogenin. 22 2 2 23 Năm 2012, Peng và cộng sự [34] đã tổng hợp 8 hợp chất dạng este ở vị trí cacbon số 3 từ sarsasapogenin bằng các phản ứng este hóa. Đồng thời nhóm nghiên cứu này cũng thử khả năng chống lão hóa thông qua sự ức chế của nó với enzym β-gal. Nhận thấy chất (56), (57), (61), (63) có khả năng chống lão hóa tốt. O O OH CH3 CH3 CH3 CH3 O O R CH3 CH3 CH3 CH3 (56) R=HSO4 - (60) R=C6H5COO - (57) R=HCOO - (61) R=C15H31COO - (58) R=CH3COO - (62) R= Cl - (59) R=C2H5COO - (63) R=Br - Nhận xét: Như vậy từ thành phần aglycon trong loài Tri mẫu có thể bán tổng hợp ra nhiều dẫn xuất mới có hoạt tính sinh học tốt hơn và có giá trị thức tiễn. Đến nay chỉ có một số công trình phân lập aglycon sarsasapogenin để nghiên cứu hoạt tính sinh học và bán tổng hợp khung cacbon này. Còn các khung aglycon khác hiện nay chưa có báo cáo nào về việc phân lập chúng dưới dạng tinh khiết và xác định cấu trúc hóa học, bán tổng hợp và thử hoạt tính sinh học. 1.3.3. Các hợp chất phenolic Trong loài Tri mẫu, ngoài thành phần chính là các saponin và sapogenin thì còn có các hợp chất phenolic, cũng có khá nhiều công trình nghiên cứu về hợp chất này. Năm 2005, Tsukamoto và các cộng sự [43] đã phân tách từ loài Tri mẫu ở Nhật Bản bốn hợp chất phenolic: 2,6,4-trihydroxy-4-methoxybenzophenone 24 (64), 7-hydroxy-3-(4-hydroxybenzyl)chroman (65), broussonin B (66) và nyasol (cis-hinokiresinol) (67). OH OH O OCH 3 OH O OH OH (64) (65) OHH3CO OH CH2 OH OH (66) (67) Năm 2008, nhóm nghiên cứu của Qin [36] đã phân lập được magiferin (68) và neomagiferin (69) từ lá loài Tri mẫu. Magiferin và neomagiferin ở dạng bột màu vàng. O OH R2 OH R1O O OH (68): R1=H, R2=Glu (69): R1=Glu, R2=Glu Năm 2009, Youn và các cộng sự [49] đã phân lập được 6 hợp chất phenolic từ rễ Tri mẫu là 7,4'-dihydroxy homoisoflavonoid (70); (2S)-7,4'- 25 dihydroxy-5-methoxyflavaone (71) cùng với 4,4'-dihydroxychalcon (72), 2'-O- methylphlorethin (73); 1,3-bis-di-phydroxyphenyl-4-penten-1-one (74) và 2,4'- dihydroxy-4-metoxybenzophenon (75). Trong đó hợp chất (70)-(73) được phân lập lần đầu tiên từ loài thực vật này. OOH O OH OH O O OH (70) (71) OH O OH OH O OH OCH 3 (72) (73) OH CH2 O OH OH OH O O (74) (75) Nhận xét: Các hợp chất phenolic chủ yếu có bộ khung cacbon: C6-C3-C6, C6-C4-C6, C6-C5-C6. Các dẫn xuất nyasol và isoflavonoid chiếm tỷ lệ lớn. 1.4. Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học loài Tri Mẫu 1.4.1. Hoạt tính sinh học của các saponin Như đã trình bày ở trên, trong loài thực vật Tri mẫu, thành phần hóa học chủ yếu là các saponin, các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của loài này cũng định hướng theo tác dụng sinh học của loại hợp chất đó. Trong đó, đáng chú ý 26 hơn cả là tác dụng bảo vệ tế bào, cải thiện trí nhớ trên chuột thực nghiệm, tác dụng ức chế tế bào ung thư và tác dụng hạ đường huyết. 1.4.1.1. Tác dụng bảo vệ tế bào và cải thiện trí nhớ Năm 2005, Liu và các cộng sự [33] nghiên cứu ảnh hưởng của timosaponin đến khả năng cải thiện trí nhớ trên chuột thực nghiệm với tác nhân gây tổn thương là Aβ. Aβ có thể gây suy giảm trí nhớ ở chuột một cách trầm trọng, nó làm hạ thấp hoạt động SOD và khả năng chống oxy hóa cũng như tăng mức độ MDA. So sánh giữa những con chuột bình thường với những con chuột được tác động bởi timosaponin thì thấy những con chuột sau khi được xử lí với hợp chất (12), (16), (36) thì hoạt động SOD và khả năng oxy hóa được nâng cao đồng thời mức độ MDA giảm. Từ đó cho thấy các timosaponin có thể nâng cao đáng kể năng lực trí nhớ ở chuột thí nghiệm. Trong nghiên cứu gần đây nhất năm 2016, Che và các cộng sự [18] cũng đã chỉ ra khả năng ức chế Aβ42 trên tế bào N2A-APPswe của các hợp chất saponin. Các giá trị IC50 (μM) được ghi nhận như sau: hợp chất TA III (1): IC50 = 2.3±0.2, TA1: IC50 = 6.1±2.8, TA IV: IC50 = 4.2±1.2, timosaponin B1: IC50 > 100, hợp chất (12) > 100. Kết quả trên cho thấy khả năng ức chế Aβ42 trên tế bào N2A-APPswe của các saponin tương đối tốt, nhất là hợp chất (1). Một nghiên cứu khác của Dong và các cộng sự (2009) đã chỉ ra hợp chất (1) có khả năng ức chế enzym acetyl cholinesterase (một tác nhân gây bệnh Alzheimer) để cải thiện trí nhớ. Cơ chế của quá trình bảo vệ tế bào não của chất này có thể được giải thích bằng sự chống viêm của nó. Nó cũng thể hiện khả năng ức chế sự truyền dẫn tín hiệu NF-kB trong tế bào BV-2 và trong tế bào não SK-N-SH trên mô hình chuột thực nghiệm, đây là một trong những thành tố có ảnh hưởng lớn đến sự mất trí nhớ [7]. Ngoài ra, dịch chiết tổng số của loài thực vật Tri mẫu được Jung và các cộng sự đưa ra kết quả nghiên cứu về khả năng bảo vệ tế bào não vào năm 2007 [32]. 27 Sự thiếu máu cục bộ xảy ra khi bị tắc ở động mạch não phải. Dịch chiết tổng số của loài thực vật Tri mẫu ức chế đáng kể sự xâm nhập bạch cầu của các mô não thiếu máu cục bộ, điều này được xác định dựa trên hoạt động của enzym MPO. MPO đã giảm đáng kể khi dùng dịch chiết từ loài Tri mẫu trong vùng thể vân và vỏ não. Những phát hiện này đóng một vai trò rất quan trọng trong việc điều trị chấn thương não do thiếu máu cục bộ gây ra, và dự đoán loài Tri mẫu có thể là một loại thảo dược chính được sử dụng để bảo vệ tế bào não sau khi bị tổn thương do thiếu máu cục bộ [32]. 1.4.1.2. Tác dụng ức chế tế bào ung thư Năm 2001, Takeda và các cộng sự [41] đã đưa ra một nghiên cứu quan trọng và đáng chú ý về khả năng ức chế sự tăng trưởng và kích thích sự chết của tế bào tự hủy từ loại thảo dược Tri mẫu ở các dòng tế bào ung thư dạ dày. Sau khi kết thúc quá trình nghiên cứu, họ kết luận rằng loài Tri Mẫu có khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư dạ dày MKN45 và Kato-III và có thể gây ra quá trình tự chết của tế bào này. Đến năm 2008, Che và các cộng sự [40] đã chỉ ra hợp chất (1) có tiềm năng là một tác nhân chống ung thư HeLa. Bên cạnh đó chất này cũng thể hiện khả năng ức chế nhiều tế bào ung thư như: ung thư biểu bì (SUNE-1), ung thư gan (HepG2), ung thư vú (MCF-7) với các giá trị IC50 dao động từ 8.5 - 10.1 (μmol/l). 1.4.1.3. Tác dụng hạ đường huyết Một chế phẩm cổ truyền được bào chế từ thân rễ Tri mẫu được thử nghiệm trên chuột nhắt KK-Ay (chuột mắc một típ đái tháo đường không phụ thuộc insulin). Chế phẩm này (1700 mg/kg), làm giảm đường máu ở chuột nhắt KK-Ay từ 557 ± 17 xuống 383 ± 36 (mg/1000 ml) trong vòng 7h sau khi cho uống một liều thuốc (P < 0,001). Thuốc cũng làm giảm đường máu và làm tăng sự dung nạp glucose trong vòng 5 tuần sau khi cho uống những lều lặp lại trên chuột nhắt KK - Ay [1]. 28 Năm 2004, Hoa và các cộng sự đã chứng minh dịch chiết ethanol của Tri mẫu có tác dụng kích thích sự tiết insulin của đảo tụy ở chuột bình thường và chuột đái tháo đường ở nồng độ 2,4 và 8 (mg/ml) [10]. 1.4.1.4. Một số hoạt tính sinh học khác Các hợp chất saponin được phân lập từ các dịch chiết ethanol và dịch chiết nước từ phần rễ Tri mẫu có khả năng chống enteroviruts 71(EV71) gây bệnh tay chân miệng, điều này được đưa ra trong nghiên cứu của Liu và cộng sự năm 2014. Trong số các saponin, hợp chất timosaponin B-II (12) có chỉ số IC50 (4,3 ± 2,1 mM, SI = 92,9), chất đối chứng là ribavirin (IC50 = 361,7 ± 104,6 mM, SI = 2,4). So sánh 2 hợp chất này thì thấy hợp chất (12) có SI cao hơn gấp 40 lần so với chất đối chứng [19]. Trong báo cáo của Meng và các cộng sự [16] được công bố năm 2000 cho thấy timosaponin E1 (16) và E2 (17) được phân lập từ loài Tri Mẫu có tác dụng chống oxi hóa, gây ảnh hưởng đến gốc superoxide trong bạch cầu của con người. Hợp chất (16) và (17) ức chế đáng kể N-formyl-methionyl-leucyl- phenylalanine (FMLP) - tác nhân gây ra gốc superoxide. Ngoài ra, protein tyrosine kinase tham gia vào gốc superoxide cũng giảm đáng kể trong bạch cầu của con người khi dùng hợp chất (16), (17). Anemarsaponin B (ASB) (2) thể hiện khả năng chống viêm tiềm tàng. Kết quả nghiên cứu cho thấy tác dụng chống viêm của ASB trong LPS ở đại thực bào RAW 264,7 có sự liên kết với sự ức chế hoạt động của enzym NF- kB thông qua con đường kích hoạt p38 MAP.[15] Ngoài ra, các saponin của loài Tri mẫu điều trị hiệu quả sự loãng xương ở chuột thông qua sự hình thành xương nhưng không ức chế sự tái hấp thu xương [31] và còn có tác dụng chống oxi hóa.[48] 1.4.2. Hoạt tính sinh học của các aglycon Trong loài Tri mẫu có nhiều khung aglycon, nhưng aglycon sarsasapogenin (44) là khung cơ bản nhất của loài thực vật này. Đến nay chỉ có một số công trình 29 phân lập aglycon này để nghiên cứu hoạt tính sinh học. Hoạt tính sinh học điển hình nhất của khung aglycon này là khả năng bảo vệ tế bào não để nâng cao khả năng trí nhớ và ức chế tế bào ung thư. 1.4.2.1. Tác dụng bảo vệ tế bào Năm 2005, Hu và các cộng sự [13] đã thử khả năng nâng cao trí nhớ của khung aglycon này trên chuột thực nghiệm với tác nhân gây tổn thương là amyloid β-peptide, kết quả cho thấy nhóm thực nghiệm với chất này có thể cải thiện khả năng nhớ và học tập, với nhóm đối chứng là tacrin. Năm 2010, cũng nhóm nghiên cứu này đã chứng minh sự ảnh hưởng của aglycon này đến vai trò của phần kết nối vòng AMP (CREB) đối với độ dầy đặc của thụ thể M1 trên tế bào CHOm1 trong quá trình trình già đi, nó có khả năng nâng cao độ dầy đặc của thụ thể M1 tốt cho các CREB và phosphor- CREB để chống lại quá trình lão hóa [12]. Năm 2011, Wang và các cộng sự [45] đã chứng minh sự ảnh hưởng của sarsasapogenin đến sự phát triển theo hình cây của tế bào thần kinh vỏ não, kết quả cho thấy chất này có khả năng làm tăng sự phát triển của các tế bào thần kinh hình cây trên vỏ não với các nồng độ khác nhau thông qua con đường kích thích PI3K/Akt/mTOR. Điều này rất tốt cho việc bảo vệ tế bào và kích thích sự ghi nhớ. Đến năm 2012, Yue [51] và cộng sự đã nghiên cứu thực nghiệm và chứng minh rằng sarsasapogenin có thể bảo vệ tế bào thần kinh vỏ não bởi sự tác động gây tổn thương của axit glutamic, kết quả cũng cho thấy chất này có khả năng bảo vệ tế bào này thông qua con đường kích hoạt sự truyền dẫn thông tin của PI3K/Akt/mTOR và làm tăng hoạt tính của protein caspase-3 và μ-calpain. Trong nghiên cứu gần đây nhất năm 2016, Che và các cộng sự [18] cũng đã chỉ ra khả năng ức chế Aβ42 trên tế bào N2A-APPswe của các hợp chất aglycon. Các giá trị IC50 (μM) được ghi nhận như sau: hợp chất sarsasapogenin (44): IC50 = 53.0±9.0; các hợp chất được bán tổng hợp từ (44) là (48), (49), (53), (54), (55) có giá trị IC50 lần lượt là: 6.5±2.1, 27.0±8.0, 7.2±2.2, 9.3±3.5, 7.3±4.0. Còn các hợp chất aglycon khác như: tigogenin, smilagenin có giá trị 30 IC50 > 100. Kết quả trên cho thấy khả năng ức chế Aβ42 trên tế bào N2A- APPswe của các aglycon tương đối tốt, nhất là các dẫn xuất được bán tổng hợp từ chất sarsasapogenin. 1.4.2.2. Tác dụng ức chế tế bào ung thư Năm 2005, Trouillas và cộng sự đã chứng minh khả năng ức chế tế bào ung thư xương người 1547 của aglycon sarsasapogenin thông qua việc gây ra sự chết của tế bào này dựa vào chu trình khép kín của tế bào trong pha G2/M. [44] Năm 2008, Ni và cộng sự [30] chứng minh vai trò cần cho sự sống trong việc gây chết tế bào ung thư HepG2 và HeLa. Kết quả cho thấy rằng, sarsasapogenin thúc đẩy phản ứng oxy hóa (ROS) ti thể xảy ra sớm giúp kích hoạt quá trình tự chết của tế bào và cytochrome C được giải phóng nhiều hơn, từ đó bước đầu kết luận sarsasapogenin có khả năng gây ra quá trình tự chết tế bào HepG2. Bao và cộng sự [5] cũng đã chỉ ra sự phụ thuộc của nồng độ và thời gian vào khả năng sống được của tế bào HepG2. Năm 2013, Shen và cộng sự [39] đã cho rằng sarsasapogenin có thể ức chế khối u trong các thực nghiệm in vitro, và cũng có thể ức chế tế bào ung thư HeLa gây ra bởi các quá trình oxi hóa stress. 1.4.2.3. Một số hoạt tính sinh học khác Mục đích nghiên cứu của Wu và các cộng sự [37] đưa ra vào năm 2006 là để tìm ra những ảnh hưởng của sarsasapogenin được phân lập từ loài Tri mẫu đến hoạt động chống trầm cảm ở chuột trong bài kiểm tra có tên là mô hình bơi cưỡng bức (the forced swimming). Bộ dụng cụ là một bình hình trụ được làm bằng polycarbonate (cao 25cm, đường kính 10 cm), nước (24oC) được cho vào bình đến mức 15cm. Chuột thí nghiệm được cho uống sarsasapogenin 60 phút trước khi làm thí nghiệm. Chuột được đặt vào bình và thử nghiệm trong 6 phút. Cho chuột bơi tự do trong 2 phút đầu và từ phút thứ 3, thời gian bất động của chuột được ghi nhận. Kết quả cho thấy khi dùng sarsasapogenin với liều 12.5, 25 và 50 mg/ kg thì giảm thời gian bất động tương ứng với kết quả là 26,6% (P< 0,05), 32,7% 31 (p< 0,05) và 48,7% (p<0,01). Nghiên cứu này chỉ ra khả năng chống trầm cảm tiềm năng của sarsasapogenin từ loài Tri Mẫu dựa vào các dẫn chứng về tâm lí, dược lý, hóa học và các tài liệu về thần kinh. Ngoài ra, sarsasapogenin còn có tác dụng hạ sốt. Phân đoạn saponin từ thân rễ tri mẫu và sản phẩm thủy phân sarsasapogenin cũng như dẫn chất hemisucinyl đều có tác dụng ức chế mạnh trên Na+/K+-ATPase và làm giảm lượng oxy thu nhận trong gan được xử lý với thyroxin. Tác dụng ức chế của dẫn chất hemisucinyl còn mạnh hơn cả tác dụng của ouabain. Sarsasapogenin cũng ức chế Na+/K+-ATPase của hồng cầu người. Tác dụng ức chế chậm và có thể tăng lên do ion natri từ bên ngoài và đối kháng bởi ion rubidi từ bên ngoài. Tác dụng ức chế trên ATPase có thể có liên quan với tác dụng hạ sốt của sarsasapogenin. [1] Kết luận: Như vậy, các chất được phân lập từ loài tri mẫu có rất nhiều hoạt tính quan trọng và thiết thực, trong đó timosaponin A-III và aglycon sarsasapogenin được nghiên cứu nhiều hơn cả, đặc biệt là tác dụng bảo vệ tế bào não, chống tế bào ung thư và hạ đường huyết. 32 Chương 2 THỰC NGHIỆM 2.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là mẫu khô loài Tri mẫu được Viện y học bản địa Việt Nam thu mua và kiểm định. Mẫu được bảo quản cẩn thận trước khi tiến hành nghiên cứu. 2.2. Hóa chất và thiết bị 2.2.1. Hóa chất 2.2.1.1. Hóa chất Các dung môi dùng để ngâm chiết mẫu thực vật đều dùng loại tinh khiết. Dung môi được sử dụng là: etanol, n-hexan, etylaxetat (EA), axeton, clorofom, cacbon tetraclorua và ete dầu đều là các dung môi tinh khiết. Sắc ký bản mỏng phân tích: sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel 60 F254, Merck, có độ dày 0,2 mm. Bản mỏng: được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng ngắn và dài (254; 365 nm), sau đó hiện màu bằng thuốc thử vanilin - H2SO4 (vanilin 1,2 g; MeOH 200 ml; CH3COOH 25 ml; H2SO4 11 ml), hơ nóng trên bếp điện cho đến khi các vệt trên bản mỏng hiện màu rõ nhất. Sắc ký cột thường: sử dụng silicagel cỡ hạt 197-400 mesh (0,040-0,063 mm). Hóa chất khi thủy phân: axit H2SO4, NaOH rắn. 2.2.1.2. Hóa chất dùng để thử hoạt tính sinh học Dimetylsulfoside (DMSO), phosphate buffer 10 mM (pH 6.8), cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG), 20 µl α-glucosidase (0,5U/ml), 120 µl phosphate buffer 100mM (pH 6.8) và 80 µl Na2CO3 0,2M. 2.2.2. Thiết bị Máy cất quay chân không, các thiết bị phụ trợ cho thí nghiệm phân lập chất hữu cơ. 33 Phổ khối lượng ESI-MS được ghi trên máy HP 5989 B-MS với năng lượng bắn phá ở 70 e. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H, 13C-NMR và HMBC đ- ược đo trên máy Bruker 500MHz. Cân phân tích, máy đo OD ELISA Plate Reader (Bio-Rad). 2.3. Phương pháp xử lý mẫu thực vật, chiết tách và xác định cấu trúc các chất phân lập được 2.3.1. Xử lý mẫu thực vật Mẫu rễ loài Tri mẫu sau khi lấy về được sấy khô ở 50oC, chặt nhỏ và tiến hành ngâm chiết trong dung môi. 2.3.2. Chiết tách các chất Mẫu phần rễ của loài Tri mẫu được chặt nhỏ và chiết hồi lưu với etanol ở 70oC. Quay cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn chiết etanol. Thêm nước và axit H2SO4 vào cặn, khuấy đều, đun ở 80oC để thủy phân. Sau khi kết thúc thủy phân, dung dịch được trung hòa bằng NaOH đến môi trường trung tính, lọc và thu được cặn sau thủy phân. Cặn đó chiết lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: clorofom và etylaxetat (EA). Sau đó cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn tổng số. Phân lập cặn tổng số và các cặn ở các phân đoạn bằng phương pháp sắc ký cột trên silicagel với các hệ dung môi thích hợp. 2.3.3. Xác định cấu trúc các chất Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ khối lượng HR-ESI-MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR), phổ hai chiều HMBC và so sánh với tài liệu tham khảo. 2.4. Phương pháp xác định khả năng ức chế enzyme alpha-glucosidase Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của hoạt chất nghiên cứu được thực hiện theo phương pháp của Moradi-Afrapoli F và cộng sự. 34 2.5. Thực nghiệm 2.5.1. Quá trình phân lập các chất từ phần rễ của loài Tri mẫu 2.5.1.1. Chiết xuất cao etanol từ rễ của loài Tri mẫu Mẫu khô (5 kg) sau khi lấy về được đem chặt nhỏ và chiết hồi lưu với etanol 90% ở nhiệt độ 70˚C trong thời gian 3 giờ và lặp lại 3 lần. Cất thu hồi dung môi được cặn chiết etanol (900 gam)và phân bố đều trong lượng nước vừa đủ. 2.5.1.2. Thủy phân cặn chiết etanol từ rễ của loài Tri mẫu Cặn etanol thu được đem thủy phân với axit H2SO4 , đun hồi lưu ở nhiệt độ 80˚C trong 4h, khuấy đều. Sau khi phản ứng kết thúc, dung dịch được trung hòa bằng NaOH đến môi trường trung tính. Lọc lấy phần cặn. Phần cặn được rửa với nước để loại bỏ các muối vô cơ. Phần cặn thu được sau khi thủy phân được nghiền nhỏ và chiết lần lượt với clorofom và etylaxetat (EA). Cất thu hồi dung môi thu được các cao chiết tương ứng có khối lượng là: 50 gam và 70 gam. Quy trình chiết, tách và thủy phân mẫu phần rễ của loài Anemarrhena asphodeloides (Bunge) được nêu trong sơ đồ 2.1 dưới đây. Sơ đồ 2.1: Sơ đồ chiết xuất và thủy phân mẫu phần rễ của loài Anemarrhena asphodeloides (Bunge) - Chặt nhỏ - Chiết trong etanol (90%) Cặn chiết etanol Cặn sau khi thủy phân - Thủy phân với H2SO4 - Trung hòa axit dư với NaOH - Lọc lấy cặn - Nghiền nhỏ - Chiết lần lượt với clorofom, etyl axetat Phần không tan Cao clorofom (50 gam) Cao etyl axetat (70 gam) 5 kg mẫu khô loài Tri Mẫu 35 Các cao chiết của CHCl3, EA được sắc ký bản mỏng với các hệ dung môi EA: CHCl3, n-hexan: axeton, ete dầu : CHCl3. Chúng tôi thấy rằng hai dịch chiết này cho các vết chất tương đương nhau nên đã tiến hành gộp lại được cao tổng số (CHCl3+ EA). 2.5.1.3. Phân lập các chất từ cao tổng Với phần cao chiết vừa gộp ở trên chúng tôi tiến hành phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột. Cao chiết được hòa tan vào lượng vừa đủ etyl axetat và nhỏ từ từ vào 200 g silicagel để tạo hỗn hợp chạy cột, nghiền thành bột mịn để các chất hấp phụ đều trên silicagel. Bột silicagel có tẩm dịch chiết này được sử dụng để đưa lên cột sắc ký. Cột sắc ký được nhồi với lượng silicagel là 1500 g theo phương pháp nhồi khô với dung môi ổn định cột ban đầu là n-hexan 100%. Hệ dung môi rửa giải: n- hexan: axeton với tỉ lệ: 20/1; 10/1 và 5/1 (v/v) thu được 8 phân đoạn. Phân đoạn 1 gồm các ống số 2 đến 3 được gộp lại, được tiến hành sắc ký với hệ dung môi rửa giải là n-hexan: axeton với tỉ lệ lần lượt là 100/1, 50/1và 25/1 (v/v) thu được chất AA2 (9mg) màu trắng vô định hình, có màu vàng khi hiện màu với H2SO4 đặc trên bản mỏng và hơ nóng. Phân đoạn 3, kết tinh lại trong EA thu được chất AA1(1000 mg) là tinh thể không màu. Hai chất rắn này được làm khô và bảo quản trong các lọ đựng mẫu. Phân đoạn 6 gồm các ống số 24 đến 26 được gộp lại, được tiến hành sắc ký với hệ dung môi rửa giải là CCl4: EA với tỉ lệ lần lượt là 5/1, 3/1(v/v) thu được chất AA3 (25 mg) màu trắng vô định hình. Hai chất rắn này được làm khô và bảo quản trong các lọ đựng mẫu. Quy trình phân lập chất từ cao tổng được nêu trong sơ đồ 2.2 dưới đây 36 Sơ đồ 2.2: Sơ đồ phân lập các chất từ cao tổng số - Chạy sắc kí cột silicagel - Hệ dung môi: n-hexan: axeton = 100/1, 50/1,25/1. - Thông cột bằng EA Chất AA2 (9 mg) Chất AA1 (1000 mg) Kết tinh lại trong EA - Chạy sắc kí cột silicagel - Hệ dung môi: CCl4: EA = 5/1, 3/1. -Thông cột bằng EA Chất AA3 (25 mg) - Chạy sắc kí cột silicagel - Hệ dung môi: n-hexan: axeton = 20/1,10/1. 5/1. - Thông cột bằng metanol Cao EA+ CHCl3 (120 g) PĐ 1: ống 2-3 PĐ 2: ống 4 -8 PĐ 4: ống 14-17 PĐ 3: ống 9-13 PĐ 8: ống 29-34 PĐ 7: ống 27-29 PĐ 6: ống 24-26 PĐ 5: ống 18-23 36 37 2.5.2. Dữ kiện phổ của các chất phân lập được 2.5.2.1. Chất AA1 Giá trị phổ cộng hưởng từ hạt nhân của chất AA1 được tiến hành đo trên hệ máy cộng hưởng từ 500 MHz tại khoa Hóa học, Đại học KHTN-ĐHQG trong dung môi CDCl3, chất chuẩn đối chứng là TMS. Kết quả dữ liệu phổ NMR của chất AA1 được tổng hợp ở bảng 2.1 dưới đây: Bảng 2.1. Số liệu phổ NMR của AA1 Ví trí Số liệu đo 13C NMR (ppm) 1H NMR (ppm), J (Hz) 1 29.95 1.53-1.78 (m) 2 27.81 1.16-1.78 (m) 3 67.08 4.04 (1H, s) 4 33.53 1.40-1.67 (m) 5 36.52 2.01 (m) 6 26.56 1.36 (m) 7 26.54 1.40-1.95 (m) 8 35.27 1.78 (m) 9 40.31 1.76 (m) 10 35.27 11 20.90 1.56 (m); 1.67 (m) 12 39.85 1.55 (m); 1.65 (m) 13 40.67 14 56.47 2.03 (m) 15 31.74 2.01 (m) 16 81.02 4.33 (1H, q, J= 7.8 Hz) 17 62.08 2.02 (m) 18 16.50 0.91 (3H, s) 19 23.92 0.69 (3H, s) 20 42.11 2.03 (m) 21 14.34 1.02 (3H, d, J = 7.1 Hz) 22 109.75 23 27.08 1.76-1.83 (m) 24 25.77 1.87 (m) 25 25.94 1.87 (m); 1.89 (m) 26 65.14 3.88 (1H, dd, J = 11.2, 2.7 Hz). 3.23 (1H, d, J = 11.2 Hz) 27 16.05 0.92 (3H, d, J = 6.9 Hz) 38 2.5.2.2. Chất AA2 Giá trị phổ cộng hưởng từ hạt nhân của chất AA2 cũng được tiến hành đo trên hệ máy cộng hưởng từ 500 MHz tại khoa Hóa học, Đại học KHTN_ĐHQG trong dung môi CDCl3, chất chuẩn đối chứng là TMS. Kết quả dữ liệu phổ của chất AA2 được tổng hợp ở bảng 2.2 dưới đây. Bảng 2.2: Số liệu phổ NMR của AA2 Ví trí Số liệu đo 13C NMR (ppm) Một số tín hiệu cộng hưởng quan trọng trên 1H NMR của AA2 (ppm), J (Hz) 1 37.01 2 37.18 2.32 (1H, m, H-2α) 3 213.09 4 42.35 2.69 (1H, dd, J=14.6, 14.0Hz, H-4α) 5 44.24 6 26.55 7 26.04 8 35.20 9 40.85 10 35.03 11 21.02 12 40.13 13 40.68 14 56.28 15 31.71 16 80.88 4.42 (1H, q, J= 7.6 Hz) 17 62.09 18 16.48 1.04(3H, s) 19 22.68 0.79 (3H, s) 20 42.15 21 14.34 1.08 (3H, d, J = 7.1 Hz) 22 109.73 23 27.08 24 25.78 25 25.96 26 65.16 3.95 (1H, dd, J = 11.1, 2.7 Hz). 3.31 (1H, d, J = 11.1 Hz) 27 16.05 1.00 (3H, d, J = 6.9 Hz) 39 2.5.2.3. Chất AA3 Giá trị phổ cộng hưởng từ hạt nhân của chất AA3 được tiến hành đo trên hệ máy cộng hưởng từ 500 MHz tại khoa Hóa học, Đại học KHTN_ĐHQG trong dung môi CDCl3, chất chuẩn đối chứng là TMS. Kết quả dữ liệu phổ của chất AA3 được tổng hợp ở bảng 2.3 dưới đây. Bảng 2.3: Số liệu phổ NMR của AA3 Ví trí Số liệu đo 13C NMR (ppm) 1H NMR (ppm), J (Hz) 1 36.89 1.73-1.78 (m) 2 67.69 3.62 (d, J = 10.5 Hz) 3 69.88 3.94 (1H, s) 4 32.34 1.40-1.67 (m) 5 41.31 2.01 (m) 6 26.56 1.36 (m) 7 25.78 1.40-1.95 (m) 8 35.36 1.78 (m) 9 40.20 1.76 (m) 10 35.46 11 21.07 1.56 (m); 1.67 (m) 12 38.41 1.55 (m); 1.65 (m) 13 40.65 14 56.34 1.78 (m) 15 31.71 2.01 (m) 16 80.96 4.33 (1H, q, J = 7.8 Hz) 17 62.08 2.00 (m) 18 16.49 0.92 (3H, s) 19 23.76 0.77 (3H, s) 20 42.14 2.03 (m) 21 14.34 1.08 (3H, d, J = 7.1 Hz) 22 109.75 23 27.09 1.76-1.83 (m) 24 25.78 1.87 (m) 25 25.96 1.87 (m); 1.89 (m) 26 65.16 3.88 (1H, dd, J = 11.1, 2.7 Hz). 3.23 (1H, d, J = 11.1 Hz) 27 16.05 0.97 (3H, d, J = 6.9 Hz) 40 2.5.3. Xác định khả năng ức chế α-glucosidase Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của hoạt chất nghiên cứu được thực hiện theo phương pháp của Moradi-Afrapoli F và cs. Chuẩn bị mẫu thử và cách xác định giá trị IC50 Chuẩn bị mẫu thử nghiệm Chất thử được hòa tan trong DMSO và pha loãng trong phosphate buffer 10 mM (pH6.8) được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ 1000 g/ml, 200 g/ml; 40g/ml; 8 g/ml; 0.16 g/ml. 20 µl α- glucosidase (0,5U/ml) và 120 µlphosphate buffer 100mM (pH 6.8) được thêm vào mỗi giếng, trộn đều và ủ ở 37oC trong 15 phút. Cơ chất p-nitro