Luận văn Nghiên cứu thiết lập hệ thống nuôi cấy tế bào dạng huyền phù cây dừa cạn ( catharanthus roseus l.) của Việt Nam

loại bioreactor và thể tích khí có ảnh hƣởng đáng kể đến sự phát triển của rễ tơ và nồng độ của ajmalicine, và kết luận rằng bioreactor tạo bong bóng kết hợp với polyurethane đã cải thiện đáng kể sinh khối rễ tơ khô (15,4 lần trong 30 ngày nuôi cấy) và nồng độ ajmalicine tăng 3,4 lần so với hệ thống nuôi cấy sử dụng que trống quay thông thƣờng. Hầu hết các nghiên cứu so sánh nuôi cấy rễ tơ với nuôi cấy tế bào, mô sẹo và chồi trong việc sản xuất các chất thứ cấp đã cho thấy nuôi cấy rễ tơ có nhiều lợi thế nhƣng quan trọng nhất là sự ổn định di truyền và khả năng sản xuất các chất thứ cấp ở nồng độ cao [18, 37, 38]. 1.3. Nuôi cấy mô cây dừa cạn để tăng cƣờng sản xuất các hợp chất terpene indole alkaloid (TIA) Việc sản xuất các hợp chất TIA sử dụng nuôi cấy mô cây dừa cạn là một công nghệ đƣợc các nhà nghiên cứu đặc biệt quan tâm. Một trong những vấn đề có tính quyết định trƣớc khi tiến hành nuôi cấy mô với mục đích sản xuất chất thứ cấp là lựa chọn giống dừa cạn thích hợp, có khả năng sinh tổng hợp TIA cao. Mặc dù có nhiều nghiên cứu dựa trên phân tích phổ HPLC cho thấy các giống khác nhau có hàm lƣợng hợp chất TIA là nhƣ nhau, nhƣng một vài dòng tế bào dừa cạn có khả năng sản xuất TIA cao hơn. Trên thực tế, việc chọn lọc các giai đoạn phát triển của một dòng tế bào tổng hợp và tích lũy đƣợc TIA phụ thuộc vào việc chọn lọc các vật liệu ban đầu cho nuôi cấy (loại, kích thƣớc, tuổi) và điều kiện nuôi cấy (dinh dƣỡng, chất kích thích sinh trƣởng, pH, nhiệt độ, ánh sáng). Thêm vào đó, việc sàng lọc các tế bào trong quá trình cấy chuyển cũng giúp chọn ra đƣợc các dòng tế bào có năng suất cao, mặc dù các dòng này thƣờng không ổn định và có xu hƣớng giảm khả năng sinh tổng hợp sau nhiều chu trình cấy chuyển [39, 40, 41]. Mannonen và cs [42] đã sử dụng các phƣơng pháp giữ lạnh, các chất bảo vệ và quá trình làm lạnh và giải lạnh khác nhau. Dầu khoáng đã đƣợc dùng để 24 bảo quản tế bào trƣớc khi bắt đầu chu trình phát triển tế bào trong môi trƣờng mới [43]. Ngoài ra, nhiều nghiên cứu đã đƣợc tiến hành sử dụng nuôi cấy cây nguyên vẹn, chồi, mô sẹo và tế bào đã cho thấy việc sản xuất hợp chất TIA phụ thuộc vào cả quá trình biệt hóa và hình thành cơ quan [44]. Endo và cs [45] quan sát đƣợc mô hình sản xuất TIA ở trong nuôi cấy rễ và chồi của cây dừa cạn là giống nhƣ trong cây hoàn chỉnh. Tuy nhiên, nhiều loại TIA không thể đƣợc tổng hợp trong tế bào nuôi cấy vì việc điều khiển kích hoạt con đƣờng sinh tổng hợp là đặc hiệu mô và giai đoạn phát triển. Shukla và cs [46] quan sát thấy hàm lƣợng vindoline và catharanthine đƣợc tăng cƣờng trong cây dừa cạn nuôi cấy khi mức độ biệt hóa của tế bào tăng lên. Tuy nhiên, những hợp chất này chỉ đƣợc phát hiện trong điều kiện có chất kích hoạt, hàm lƣợng catharanthine và vindoline cao nhất có đƣợc trong chồi (0.0039% và 0.0013% dwt - trọng lƣợng khô) so với trong mô sẹo (0.00019% và 0.00015%). Thành phần môi trƣờng nuôi cấy cùng nhƣ điều kiện môi trƣờng và việc bổ sung các hợp chất nhất định đã cho thấy có khả năng tăng cƣờng năng suất TIA trong nuôi cấy mô dừa cạn, đôi khi tăng cao một cách bất ngờ. Ví dụ nhƣ, ion nitrate và/hoặc phosphate của môi trƣờng bị giảm hoặc loại bỏ dẫn đến giảm đáng kế tốc độ phát triển của tế bào nhƣng lại tăng tích lũy TIA [47]. Trong một nghiên cứu khác, việc bổ sung KCl (4 g/L) không những không kìm hãm tế bào phát triển tế bào mà còn giúp làm tăng khả năng sản xuât ajmalicine và serpentine gấp 3 lần so với nuôi cấy mô sẹo [48]. Tƣơng tự, khi bổ sung NaCl (1,7 g/L) đã tăng lƣợng catharanthine (khoảng 90%), trong khi với nồng độ KCl tƣơng tự thì làm tăng hàm lƣợng catharanthine lên đến 300%. Đặc biệt, nồng độ NaCl cao (2,9 g/L) có tác dụng làm tăng hàm lƣợng vindoline, catharanthine, vinblastine và vincristine trong cây mầm của dừa cạn [49]. Hàm lƣợng TIA cao nhất thu đƣợc khi bổ sung mannitol 25 250 mM (4 đến 5 lần cao hơn so với đối chứng) vào môi trƣờng nuôi cấy khối mô sẹo [50]. Nồng độ nguồn carbon cũng là một yếu tố quan trọng khác cho quá trình sinh tổng hợp TIA. Schlatmann và cs [51] cho rằng có mặt của nồng độ glucose thấp liên quan đến mức độ sản xuất ajmalicine cao. Zhao và cs [52] quan sát thấy nồng độ ajmalicine, serpentine và catharanthine (hàm lƣợng alkaloid tổng số cao hơn 43 mg/L) tăng lên khi nồng độ sucrose trong môi trƣờng nuôi cấy callus tăng lên. Tƣơng tự, Jung và cs [53] cũng thu đƣợc nồng độ catharanthine cao khi nguồn carbon source đƣợc thay đổi (fructose thay sucrose) trong nuôi cấy rễ tơ. Nhiều tác giả đã chỉ rõ rằng việc sản xuất ajmalicine bị thấp đáng kể khi mật độ nuôi cấy tế bào dừa cạn thấp mặc dù hàm lƣợng catharanthine là nhƣ nhau ở cả mật độ nuôi cấy tế bào thấp và cao [54]. Việc cố định của tế bào thực vật cung cấp khả năng chiu đƣợc lực tác động của quá trình lắc và có thể giúp làm tăng hàm lƣợng TIA, đặc biệt khi sử dụng mật độ tế bào nuôi cấy cao. Một số chất mang đã đƣợc sử dụng để cố định tế bào dừa cạn [55]. Nồng độ tổng hợp và nồng độ tiết của hợp chất ajmalicine ra môi trƣờng tăng lên đáng kể khi tế bào dừa cạn đƣợc cố định bằng alginate canxi [56]. Tƣơng tự, Lee và Shuler [57] đã quan sát thấy mật độ nuôi cấy cao và tế bào đƣợc cố định trên các hạt alginate cũng tạo ra nồng độ ajmalicine cao (120 mg/L). Về tác dụng của các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật, 2,4-D ức chế sản xuất TIA [52], ngay cả khi các tiền chất nhƣ loganin và tryptamine, đƣợc thêm vào môi trƣờng nuôi cấy [58]. Việc bổ sung ethylene cũng gây ức chế sản xuất ajmalicine [59]. Tuy nhiên, sự kết hợp của BAP hoặc kinetin với IAA dẫn đến tăng cƣờng sản xuất TIA (hàm lƣợng alkaloid tổng số đạt trên 45 mg/L). Satdive và cs [60] đã cho thấy hàm lƣợng ajmalicine tăng cao (trên 0,85 g/L) đƣợc giải phóng ra môi trƣờng nuôi cấy chồi dừa cạn với sự có mặt của BAP cao (8,90 mM) và nồng độ IAA thấp (2,85 mM). Nếu sử dụng nồng 26 IAA cao (11,42 mM) và BAP thấp (2,22 mM) thì tổng hợp ajmalicine cũng tăng cao (trên 0,40 g/L) trong các chồi. Ngoài ra, quá trình sinh tổng hợp các TIA đƣợc cải thiện khi mô sẹo dừa cạn đƣợc xử lý với BAP, IAA và ánh sáng, đặc biệt là vindoline chiếm 0,19 mg/g DW và serpentine chiếm 0,53 mg/g DW, đều tăng so với mô sẹo không tiếp xúc với ánh sáng [52]. 1.4. Những thách thức trong sản xuất chất thứ cấp in vitro Hiện nay, một trong số những hạn chế đối với việc sản xuất chất thứ cấp in vitro là năng suất sinh khối còn thấp, dẫn đến hàm lƣợng chất trao đổi thứ cấp không cao. Bên cạnh đó, chi phí sản xuất trong điều kiện in vitro cao hơn, đòi hỏi kỹ thuật và công nghệ kiểm soát điều kiện môi trƣờng kèm theo nhu cầu lao động có chuyên môn [9], vì thế các hệ thống nuôi cấy quy mô lớn, mang lại lợi nhuận trong việc sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính mới chỉ có đƣợc ở một số lƣợng ít các loài cây thuốc. Hầu hết vẫn là các nghiên cứu và tìm hiểu ảnh hƣởng của các yếu tố khác nhau đối với quá trình nuôi cấy. Giống nhƣ các ứng dụng nuôi cấy mô thực vật khác, sản xuất các chất thứ cấp ở quy mô lớn in vitro có thể mang lại lợi ích thiết thực với sản xuất các chất hiếm và có giá trị cao. Mặc dù vậy, môi trƣờng đƣợc kiểm soát chặt chẽ trong nuôi cây mô tế bào thực vật, có thể dễ dàng tăng công suất không phụ thuộc vào mùa vụ sẽ rất hữu ích cho việc sản xuất các chất trao đổi thứ cấp có giá trị. Cây dừa cạn là nguồn cung cấp tự nhiên một số hợp chất thứ cấp có giá trị y học và việc nuôi cấy mô dừa cạn là cần thiết để phát triển ổn định sinh khối, tăng cƣờng khả năng tổng hợp chất thứ cấp trong điều kiện an toàn sinh học. Việc nuôi cấy mô tế bào dừa cạn cũng nhƣ các cây dùng làm thuốc đã đƣợc tiến hành, tuy nhiên kết quả là khác nhau giữa các nghiên cứu, phù thuộc vào giống, vùng trồng và nhiều điều kiện nuôi cấy khác nhau. Vì thế trong khuôn khổ luận văn này, các giống đã thích ứng với điều kiện Việt Nam sẽ đƣợc nghiên cứu nhằm phát triển hệ thống nuôi cây tế bào in vitro đặc thù giống. 27 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1. Các giống thực vật nghiên cứu Mẫu dừa cạn QN02 và H01 thu tại Quảng Ninh và Huế, chi tiết về mẫu đƣợc thể hiện trong Bảng 2.1) Bảng 2.1: Thông tin ký hiệu mẫu dừa cạn TT Ký hiệu Tên khoa học Nơi thu 1 QN02 Catharanthus roseus var. ocellatus Cô Tô – Quảng Ninh 2 H01 Catharanthus roseus var. roseus Lăng Cô – Thừa Thiên Huế 2.1.2. Các môi trường dùng cho nghiên cứu Bảng 2.2: Thành phần các môi trƣờng nuôi cấy mô Môi trƣờng Thành phần Nảy mầm hạt (MS) 4,3 g/L MS + 30 g/L sucrose + 8 g/L agar + 103,1 mg/L vitamin MS, pH = 5,8 Môi trƣờng nhân chồi (CT1) 4,3 g/L MS + 30 g/L sucrose + 8 g/L agar + 103,1 mg/L vitamin MS + 1 mg/L BAP + 0,2 mg/L NAA, pH = 5,6 Cảm ứng tạo mô sẹo(CT2) 4,3 g/L MS + 30 g/L sucrose + 8 g/L agar + 103,1 mg/L vitamin MS + A, pH = 5,8 Chất điều hòa sinh trƣởng: IAA (0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 mg/L); NAA (0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 mg/L); 2,4D (0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 mg/L) Nhân nhanh mô sẹo trên MT đặc (CT3) 4,3 g/L MS + 30 g/L sucrose + 103,1 mg/L vitamin MS + 1- 1,5-2 mg/L 2,4-D+ 1,6 mg/L kinetin + 8 g/L agar, pH = 5,8 Nhân nhanh mô sẹo trên MT lỏng (CT4) 4,3 g/L MS + 30 g/L sucrose + 103,1 mg/L vitamin MS + 2,4- D + 1,6 mg/L kinetin, pH = 5,8 28 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Khử trùng và nảy mầm hạt Để thu cây làm vật liệu nuôi cấy ban đầu, hạt của các giống dừa cạn đƣợc thu từ quả dừa cạn đƣợc trồng ngoài tự nhiên và đƣợc khử trùng bằng khí theo phƣơng pháp của Clough và Bent [61]. Trƣớc hết bình đựng hạt đƣợc đƣa vào bình hút ẩm (desicator) và khí chlorin đƣợc tạo ra bằng cách bổ sung 3 mL HCl đậm đặc vào 100 mL dung dịch javen đƣợc đặt sẵn. Sau đó, ngay lập tức đậy chặt bình hút ẩm và khử trùng trong 4 giờ. Hạt sau khi đƣợc khử trùng đƣợc chuyển sang tủ cấy và để trong 2-3 giờ để loại hết khí chlorin. Hạt sau khi đƣợc khử trùng có thể đƣợc dùng ngay hoặc bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh khoảng 1-2 tuần. Hạt sạch đƣợc đặt riêng rẽ trên môi trƣờng gieo hạt - MS. Khả năng nảy mầm của 2 giống nghiên cứu đƣợc đánh giá sau 3 tuần. 2.2.2. Tạo nguồn vật liệu bằng phương pháp nhân nhanh chồi in vitro Sau khi hạt nảy mầm 3 tuần, trƣớc hết chồi mầm bao gồm đoạn thân trên hai lá mầm đƣợc chuyển sang môi trƣờng nhân chồi (CT1). Khi chồi phát triển đến giai đoạn có hai lóng thân thì đoạn thân chứa nách lá đƣợc cấy chuyển tiếp sang môi trƣờng CT1 mới để tạo chồi nách sau khi cắt bỏ lá. Các chồi nách có chiều cao khoảng 1,5 cm tiếp tục đƣợc tách ra và chuyển sang môi trƣờng CT1 mới. Quy trình này thực hiện liên tục để tạo nguyên liệu phục vụ thí nghiệm tạo mô sẹo. 2.2.3. Thí nghiệm cảm ứng tạo mô sẹo từ đoạn thân dừa cạn 2.2.3.1. Tối ưu hóa loại và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo mô sẹo Các chồi đơn có chiều cao từ 2 - 3 cm, có ít nhất 3 lóng đƣợc sử dụng để làm nguyên liệu tạo mô sẹo. Các đoạn thân không chứa đỉnh chổi và nách lá, đƣợc cắt thành các đoạn kích thƣớc 0,3-0,7 cm và đặt nằm ngang trên môi trƣờng tạo mô sẹo cơ bản CT2 (Bảng 2.2) có bổ sung các chất điều hòa sinh 29 trƣởng IAA, NAA và 2,4-D ở các dải nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2 và 2,5 mg/L. Mẫu đối chứng là mẫu đặt trên môi trƣờng CT2 không bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng. Kết quả thí nghiệm đƣợc tổng kết sau 7, 14, 21 và 28 ngày nuôi cấy dựa vào hình thái và tỷ lệ phát sinh mô sẹo. Mỗi công thức thí nghiệm tiến hành trên 30 đoạn thân, thí nghiệm lặp lại 3 lần. 2.2.3.2. Đánh giá ảnh hưởng của ví trí và kích thước đoạn thân đến khả năng hình thành mô sẹo Lóng thân đƣợc cắt thành đoạn có kích thƣớc 0,5 cm ở ba vị trí trên thân cây nhƣ hình 2.1 và đặt nằm ngang trên môi trƣờng CT2 có bổ sung các chất điều hòa sinh trƣởng đã đƣợc tối ƣu ở thí nghiệm 2.2.3.1. Kết quả thí nghiệm đƣợc tổng kết sau 4 tuần nuôi cấy dựa vào hình thái và tỷ lệ phát sinh mô sẹo. Mỗi công thức thí nghiệm tiến hành trên 10 đoạn thân, thí nghiệm lặp lại 3 lần. Hình 2.1. Lựa chọn đoạn thân trong thí nghiệm cảm ứng tạo mô sẹo 2.2.3.3. Tối ưu hóa kích thước đoạn thân Các lóng đoạn thân dừa cạn đƣợc cắt thành 3 loại kích thƣớc 0,3; 0,5 và 0,7 cm, đặt nằm ngang trên môi trƣờng CT2 có bổ sung các chất điều hòa sinh trƣởng thích hợp. Sau 2 tuần nuôi cấy, đánh giá loại kích thƣớc đoạn thân Đoạn 1 Đoạn 2 Đoạn 3 30 tối ƣu dựa vào hình thái và tỷ lệ phát sinh mô sẹo của từng lô thí nghiệm. Mỗi lô thí nghiệm đƣợc tiến hành với 10 đoạn thân có kích thƣớc nhƣ nhau, thí nghiệm lặp lại 3 lần. 2.2.3.4. So sánh khả năng tạo mô sẹo giữa các giống dừa cạn thu thập tại Việt Nam Các chồi đơn có chiều cao từ 2 - 3 cm và có ít nhất 3 lóng của giống dừa cạn trắng và đỏ đƣợc sử dụng để làm nguyên liệu tạo mô sẹo. Đoạn thân đã đƣợc lựa chọn trong thí nghiệm 2.2.3.2 đƣợc cắt đồng đều thành các đoạn kích thƣớc đã đƣợc tối ƣu ở thí nghiệm 2.2.3.3, đặt nằm ngang trên môi trƣờng CT2 có bổ sung các chất điều hòa sinh trƣởng đã đƣợc tối ƣu ở thí nghiệm 2.2.3.1. 2.2.4. Tối ưu hóa môi trường nhân nhanh mô sẹo dừa cạn Các cụm tế bào mô sẹo kích thƣớc 2 x 2 mm2 hình thành trên môi trƣờng CT2 từ đoạn thân đƣợc chuyển sang môi trƣờng nhân mô sẹo CT3 có bổ sung 2,4D ở các nồng độ 1,0; 1,5 và 2,0 mg/L và 1,6 mg/L kinetin. Trọng lƣợng tế bào nuôi cấy ban đầu đƣợc tính bằng hiệu số trọng lƣợng thu đƣợc giữa bình môi trƣờng trƣớc và sau khi mô đƣợc chuyển vào môi trƣờng. Tốc độ phát triển của mô sẹo đƣợc xác định sau 30 ngày dựa vào khối lƣợng (tính bằng mg) mô sẹo thu đƣợc trên mỗi bình. Mỗi công thức đƣợc tiến hành trên 30 cụm mô sẹo và đƣợc lặp lại 3 lần. 2.2.5. Phát triển điều kiện nuôi cấy tế bào huyền phù cây dừa cạn Cụm tế bào dừa cạn kích thƣớc 5 x 5 mm2 phát triển tốt trên môi trƣờng CT3 đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng lỏng CT4 để tạo tế bào huyền phù. Nuôi cấy tế bào huyền phù đƣợc tiến hành trong bình thủy tinh tam giác 250 mL có chứa 100 mL môi trƣờng. Sinh khối tế bào đƣa vào nuôi cấy khoảng 150 mg trọng lƣợng tƣơi. Bình tam giác đƣợc đặt trong máy lắc với tốc độ 120 vpm ở 27oC ± 1oC trong tối. Cấy chuyển đƣợc tiến hành 3 tuần/ lần cho khi các dung dịch tế bào huyền phù có màu trắng đục. 31 Các thí nghiệm đƣợc bố trí theo khối ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần, mỗi lần 10 bình tam giác. Mỗi thời điểm thống kê tế bào từ một bình tam giác đƣợc thu nhận bằng cách lọc qua hai lớp vải microcloth và cân trọng lƣợng tƣơi của tế bào dừa cạn thu đƣợc. 2.2.6. Đánh giá ảnh hưởng của ánh sáng và nhiệt độ lên sự phát triển của tế bào huyền phù dừa cạn Để đánh giá ảnh hƣởng của ánh sáng và nhiệt độ lên tốc độ phát triển của tế bào dạng huyền phù, bình nuôi cấy huyền phù dừa cạn đƣợc đặt trong các điều kiện nhiệt độ 15, 20, 25, 30 và 35oC ; và trong điều kiện tối và sáng của phòng nuôi. Tốc độ phát triển sinh khối tế bào đƣợc đánh giá sau mỗi 7 ngày trong vòng 21 ngày thông qua trọng lƣợng tƣơi của tế bào. 2.2.7. Tách chiết và định lượng alkaloid tổng số Quy trình tách chiết đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của Mishra và cs [62]. Nghiền 20 mg callus khô với 10 ml metanol sử dụng chày cối sứ. Hỗn hợp để trong bình tam giác 100 ml và lắc ở tốc độ 25 - 50 v/p để trộn đều mẫu trong dung môi. Hỗn hợp sau đó đƣợc ly tâm ở tốc độ 3000 rmp trong 10 phút và thu đƣợc khoảng 9,0 ml dung dịch phía trên. Dung dịch đƣợc ly tâm lại 2-3 lần nữa cho đến khi dịch trong. Lấy khoảng 7-8 ml dịch và giữ trong cốc 25 ml và để cho khô ở nhiệt độ phòng. Sau khi dung môi bay hơi hoàn toàn (~12 giờ), chất chiết còn lại đƣợc hòa tan lại trong 2 ml metanol (trộn trong 1 giờ và đậy cốc bằng đĩa petri). Dung dịch chiết đƣợc đƣợc chuyển vào các ống eppendoft 2,0 ml để cho những phân tích tiếp theo. Alkaloid tổng số đƣợc ƣớc lƣợng theo dựa trên quy trình của Sreevidya và Mehrotra [63] có cải tiến. Đƣa pH của 1 mL dịch chiết methanol về 2– 2.5 (sử dụng giấy đo pH) bằng HCl loãng. Thêm 400 μL dung dịch Dragendorff’s (DR) (chuẩn bị bằng cách trộn một thể tích bằng nhau của hai dung dịch mẹ là i) dung dịch 0.8g bismuth nitrate pentahydrate trong 40 mL nƣớc cất và 10 mL glacial acetic acid, và ii) dung dịch 8,0g potassium iodide 32 trong 20 ml nƣớc cất) và thu cặn bằng cách ly tâm 5000 v/p trong 10 phút. Bảo đảm lấy hết phần kết tủa bằng cách thêm 400 μL dung dịch. Loại bỏ phần dịch và rửa kết tủa hai lần với metanol. Dịch lọc đƣợc loại bỏ và cặn sau đó đƣợc xử lý với 400 μL disodium sulfide (1% trong nƣớc cất hai lần - DDW). Kết tủa màu nâu đen thu đƣợc sau khi ly tâm 5000 v/p trong 10 phút. Kết thúc phản ứng đã đƣợc kiểm tra bằng cách thêm 2 giọt disodium sulfide và ly tâm lại. Phần cặn đƣợc hòa tan trong axit nitric đậm đặc 400μL bằng cách làm ấm nhẹ. Dung dịch đƣợc thêm 1,6 mL nƣớc cất hai lần (DDW) để có đƣợc hỗn hợp cuối cùng là 2 mL. Lấy 1 mL hỗn hợp trên trộn với 5 mL dung dịch thiourea (3% trong DDW). Độ hấp thụ đƣợc đo ở bƣớc sóng 435 nm so với mẫu trống chứa axit nitric và thiourea. Lƣợng bismuth có trong dung dịch đƣợc tính bằng cách nhân các giá trị độ hấp thụ với hệ số lấy hệ số pha loãng phù hợp để xem xét. Hệ số đƣợc tính toán từ biểu đồ chuẩn bismuth nitrate pentahydrate (Bi (NO3)3.5H2O) đƣợc hiển thị dƣới dạng giá trị không đổi cho các nồng độ khác nhau. 33 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu tạo mô sẹo phù hợp cho việc nuôi cấy tế bào huyền phù từ các vật liệu ban đầu khác nhau của hai giống dừa cạn 3.1.1 Đánh giá khả năng nảy mầm hạt dừa cạn trong điều kiện in vitro Một trăm (100) hạt của mỗi giống dừa cạn H01 và QN02 đƣợc khử trùng và gieo trên môi trƣờng cơ bản MS (Bảng 2.1). Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Sau 1 tuần gieo hạt, tỷ lệ hạt dừa cạn H01 nảy mầm đạt 54,7%, cao hơn so với hạt dừa cạn QN02 (43,5%), tuy nhiên cây mầm dừa cạn QN02 cao và mập hơn cây mầm dừa cạn H01. Chiều dài trung bình của thân mầm của dừa cạn trắng là 3,3 cm, chiều dài rễ trung bình là 2,9 cm. Trong khi chiều dài trung bình của thân mầm của dừa cạn đỏ là 1,9 cm, chiều dài rễ trung bình là 1,2 cm (Hình 3.1). A B Hình 3.1. Hạt dừa cạn nảy mầm sau 1 tuần gieo hạt. (A) QN02; (B) H01 3.1.2. Đánh giá khả năng nhân chồi in vitro của dừa cạn Sau khi hạt nảy mầm 3 tuần, đoạn thân mầm phần trên hai lá mầm đƣợc cắt chuyển sang môi trƣờng nhân chồi (CT1). Khi chồi kéo dài xuất hiện hai lóng, cắt phần lóng có nách lá, loại bỏ phần lá và chuyển sang môi trƣờng CT1 mới để tạo chồi nách, phần đỉnh chồi tiếp tục chuyển sang môi trƣờng CT1 mới để kéo dài chồi (Hình 3.2 A, D). Sau 6 tuần phát triển, các chồi nách phát triển thành cụm chồi (Hình 3.2 B, E). Các chồi nách đơn dài 1,5 cm tiếp tục đƣợc tách ra và chuyển sang môi trƣờng CT1 mới. Sau 3 tuần phát triển, các chồi mới hình thành 3-4 lóng (Hình 3.2 C, F), các lóng thân đƣợc sử 34 dụng để thiết kế thí nghiệm tạo mô sẹo. A B C D E F Hình 3.2. Một số hình ảnh thí nghiệm nhân chồi dừa cạn tạo nguyên liệu cho thí nghiệm tạo mô sẹo. Dừa cạn QN02: A. Chồi nách phát triển sau 1 tuần cấy chuyển đoạn lóng thân chứa nách lá trên môi trường CT1; B. Cụm chồi nách phát triển từ lóng thân sau 6 tuần phát triển trên môi trường CT1; C. Các chồi đơn được tách từ cụm chồi sau 3 tuần phát triển trên môi trường CT1; Dừa cạn H01: D. Chồi nách phát triển sau 1 tuần cấy chuyển đoạn lóng thân chứa nách lá trên môi trường CT1; E. Cụm chồi nách phát triển từ lóng thân sau 6 tuần phát triển trên môi trường CT1; F. Các chồi đơn được tách từ cụm chồi sau 3 tuần phát triển trên môi trường CT1 Kết quả cho thấy dừa cạn H01 có tốc độ phát triển nhanh hơn dừa cạn QN02. Sau 3 tuần tách các chồi đơn từ cụm chồi sang môi trƣờng CT1 mới, dừa cạn QN02 có chiều cao thân trung bình là 3,5 cm và có 3,4 lóng thân, dừa cạn H01 có chiều cao thân trung bình là 4,1 cm và có 3,8 lóng thân. Về mặt 35 hình thái chồi của giống dừa cạn QN02 có thân mảnh hơn, bản lá nhỏ hơn so với chồi của giống dừa cạn H01. 3.1.3. Nghiên cứu cảm ứng tạo mô sẹo từ các vật liệu nuôi cấy in vitro Các chồi đơn có chiều cao từ 2 - 3 cm, có ít nhất 3 lóng đƣợc sử dụng để làm nguyên liệu tạo mô sẹo. Các đoạn lóng thân không chứa đỉnh chồi và nách lá, đƣợc cắt thành các đoạn nhỏ khoảng 0,3- 0,7 cm đặt nằm ngang trên môi trƣờng CT2 có bổ sung các chất điều hòa sinh trƣởng IAA, NAA và 2,4- D ở các dải nồng độ 0,5; 1; 1,5; 2 và 2,5 mg/L. Mẫu đối chứng là mẫu đặt trên môi trƣờng MS. Mỗi thí nghiệm đƣợc thực hiện 30 mẫu/ 1 công thức và lặp lại 3 lần. Số liệu phát sinh mô sẹo đƣợc thu thập ở các mốc thời gian 7, 14, 21 và 28 ngày. Kết quả chi tiết đƣợc thể hiện tỏng bảng 3.1. Các mẫu đoạn thân đặt trên môi trƣờng đối chứng MS đều không tạo mô sẹo trong vòng 28 ngày. Mẫu đoạn thân dừa cạn H01 bị thâm nâu và chết sau 28 ngày đặt trên môi trƣờng MS, trong khi mẫu QN02 bị chết 50%. Trên môi trƣờng bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng IAA ở các nồng độ 0,5 -2,5 mg/L, đoạn lóng thân dừa cạn H01 và QN02 chỉ sần hai đầu mép cắt, không tạo mô sẹo, đến ngày thứ 21 nhiều mẫu có dấu hiệu bị thâm đen và chết dần (Bảng 3.1, Hình 3.3). A B Hình 3.3. Hình ảnh mô sẹo dừa cạn QN02 (A) và H01 (B) sau 4 tuần phát triển trên môi trƣờng CT2 có các nồng độ thử nghiệm 1,5 mg/L IAA 36 Bảng 3.1. Tỷ lệ tạo mô sẹo của các đoạn lóng thân lên môi trƣờng CT2 Chất kích thích sinh trƣởng (mg/L) Dừa cạn QN02 (ngày) Dừa cạn H01 (ngày) 7 14 21 28 Ghi chú 7 14 21 28 Ghi chú 0 0 0 0 0 50% số mẫu bị chết sau 28 ngày 0 0 0 0 Mẫu bị chết sau 28 ngày IAA 0,5 0 0 0 0 Mẫu chỉ sần hai đầu vết cắt, không tạo mô sẹo, đến ngày thứ 21 có dấu hiệu bị thâm đen và chết dần 0 0 0 0 Mẫu chỉ sần hai đầu vết cắt, không tạo mô sẹo, đến ngày thứ 21 có dấu hiệu bị thâm đen và chết dần 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1,5 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 2,5 0 0 0 0 0 0 0 0 NAA 0,5 0 0 0 0 Mẫu chủ yếu chỉ sần hai đầu vết cắt và tạo rễ 0 0 0 0 Mẫu chủ yếu chỉ sần hai đầu vết cắt và tạo rễ 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1,5 0 0 3,3 3,3 0 0 2,2 2,2 2 0 0 2,2 2,2 0 0 0 0 2,5 0 0 0 0 0 0 0 0 2,4D 0,5 16,7 46,3 83 83 Mô sẹo hầu nhƣ chỉ phát sinh 1 phía, cứng 10,3 33,3 70,7 83,7 Mô sẹo hầu nhƣ chỉ phát sinh 1 phía, cứng 1 53 90,3 93 100 Mô sẹo tơi xốp 48,3 93,3 93,3 100 Mô sẹo tơi xốp 1,5 58,7 97,7 100 100 Mô sẹo tơi xốp, phát triển nhanh 68,7 97 97 100 Mô sẹo tơi xốp, phát triển nhanh 2 65,3 97,3 100 100 Mô sẹo tơi xốp 73,3 97 97 100 Mô sẹo tơi xốp 2,5 70 86,7 77,7 68,9 Đến tuần thứ 3, mô sẹo có xu hƣớng bị thâm 70,7 93,3 94,5 100 Mô sẹo tơi xốp, bắt đầu bị thâm đen ở tuần thứ 4 Trên môi trƣờng bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng NAA ở các nồng độ 0,5 -2,5 mg/L, đoạn lóng thân dừa cạn H01 và QN02 chỉ sần hai đầu mép cắt và ra rễ, tạo mô sẹo ít. Sau 3 tuần cấy chuyển, dừa cạn QN02 phát sinh mô sẹo ở môi trƣờng có bổ sung 1,5 mg/L NAA là 3,3%, ở môi trƣờng có bổ sung 2 mg/L NAA là 2,2%. Dừa cạn H01 cũng phát sinh mô sẹo sau 3 tuần 37 cấy chuyển ở môi trƣờng bổ sung 1,5 mg/L NAA ở tỷ lệ thấp 2,2% (Bảng 3.1, Hình 3.4). A B Hình 3.4. Hình ảnh mô sẹo dừa cạn QN02 (A) và H01 (B) sau 4 tuần phát triển trên môi trƣờng CT2 có các nồng độ thử nghiệm 1,5 mg/L NAA Trên môi trƣờng bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng 2,4-D, đoạn thân dừa cạn phát triển tốt hơn hẳn ở môi trƣờng bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng IAA và NAA. Ở cả hai giống dừa cạn QN02 và H01 mô sẹo phát triển tốt ở trên môi trƣờng chứa 2,4-D ở trong khoảng nồng độ 1-2 mg/L. Sau 4 tuần cấy chuyển sang 3 công thức môi trƣờng này, 100% các mảnh đoạn thân đều phát sinh mô sẹo ở cả hai giống cây. Ở công thức môi trƣờng CT2 bổ sung 1,5 mg/L 2,4D mô sẹo phát triển với tốc độ nhanh hơn hẳn các môi trƣờng khác, mô sẹo trắng, tơi xốp. Môi trƣờng chứa nồng độ 2,4-D cao mặc dù phát sinh mô sẹo sớm, nhƣng không tăng sinh mô sẹo nhiều mà bị nâu hóa mô sẹo dần (Hình 3.5, 3.6). Khả năng phát sinh mô sẹo ở hai giống dừa cạn QN01 và H01 tƣơng tự nhau, ở nồng độ thấp 0,5 mg/L 2,4-D, mô sẹo hình thành chậm, tỷ lệ phát sinh mô sẹo tăng khi tăng nồng độ 2,4-D, đến ngƣỡng cao 2,5 mg/L 2,4- D tế bào có xu hƣớng bị nâu hóa và chết (Bảng 3.1). Ở công thức nghiệm 1,5 mg/L tế bào mô sẹo phát triển bắt đầu từ hai đầu mép cắt, sau đó lan tỏa nhanh trên toàn đoạn thân, tế bào mới trắng, tơi xốp. Môi trƣờng CT2 có nồng độ 2,4-D đƣợc lựa chọn làm công thức phát sinh mô sẹo dừa cạn cho các thí nghiệm tiếp theo. 38 Hình 3.5. Mô sẹo dừa cạn H01 sau 4 tuần phát triển trên môi trƣờng CT2 có các nồng độ thử nghiệm 2,4-D khác nhau. A: 0 mg/L; B: 0,5 mg/L; C: 1,0 mg/L; D: 1,5 mg/L; E: 2 mg/L; F: 2,5 mg/L Hình 3.6. Hình ảnh mô sẹo dừa cạn QN02 sau 4 tuần phát triển trên môi trƣờng CT2 có các nồng độ thử nghiệm 2,4-D khác nhau. A: 0 mg/L 2,4D; B: 0,5 mg/L 2,4D; C: 1 mg/L 2,4D; D: 1,5 mg/L 2,4D; E: 2 mg/L 2,4D; F: 2,5 mg/L 2,4D A B C D E F A B C D E F 39 3.1.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của đoạn lóng thân đến khả năn