Luận văn Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số giống ngô (Zea mays L.)

chúng đặc trưng cho loài. SSR gồm 2 - 5 nucleotide lặp lại nhiều lần. Ví dụ: (AT)n, (AG)n, (AGTC)n. SSR nằm rải rác trong hệ gen của thực vật bậc cao. Đoạn mồi được thiết kế dựa trên vùng bảo thủ ở hai đầu của đoạn SSR. Số lần lặp lại nhiều lần làm cho các phân đoạn DNA được nhân có độ dài ngắn khác nhau. Các trình tự lặp lại thường có ở vùng dị nhiễm sắc trên mỗi nhiễm sắc thể. Chúng có vai trò điều hoà hoạt động của các gen, góp phần làm tăng tính ổn định cơ học của nhiễm sắc thể trong phân bào, nó có thể mang thông tin di truyền liên quan đến sự xác định giới tính ở cả động vật và thực vật. Do sự khác nhau về số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại mà số đơn vị lặp lại xuất hiện sự đa hình về độ dài của SSR được nhân bản. Mức độ đa hình được xác định sau khi điện di sản phẩm trên gel agarose và gel polyacrylamide. SSR được phân tích trên nhờ PCR nên chỉ cần đòi hỏi một lượng mẫu DNA rất nhỏ. SSR là công cụ hữu ích trong phân tích hệ gen và chọn giống cây trồng vì đây là chỉ thị đồng trội có khả năng phát hiện tính đa hình rất cao. Trong thực tế chỉ thị này đã được sử dụng nghiên cứu một số tính trạng liên quan đến năng suất, bệnh dại, xác định giới tính, phân tích quan hệ di truyền, lập bản đồ gen…Song nhược điểm của chỉ thị này là sự phức tạp trong thiết kế mồi và đánh giá thiết kế mồi cao. Kỹ thuật SSR được Qi-lun Yao và cs (2007) sử dụng để xác định khoảng cách di truyền của 54 giống ngô từ Tây Nam Trung Quốc dựa trên 42 cặp mồi SSR, tổng số alelle thu được là 256, trung bình mỗi locus có 6,1 alelle [44]. Legesse B.W. và cs (2007) cũng sử kỹ thuật này để nghiên cứu mức độ đa dạng di truyền và đánh giá cấu trúc gen của các dòng ngô lai cận huyết. Kết quả thu được 104 alelle với khoảng cách di truyền xác định được từ 0,28 đến 0,73, giá trị PIC là 0,58 [35]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 Sharopova N. và cs (2002) đã sử dụng kỹ thuật SSR để lập bản đồ di truyền đối với các giống ngô nhằm phân lập, chỉ rõ các đặc điểm của chúng [46]. 1.2.1.4. Bản đồ QTL (Quantiative Trait loci) Bản đồ các locut tính trạng số lượng (QTL) xác định mối liên kết giữa các phân tử với một tính trạng hình thái đang được quan tâm. Qua biểu đồ QTL có thể xác định được những vùng nhiễm sắc thể có liên quan đến một trạng thái. Để lập bản đồ QTL, cần tiến hành: (1) Xác định cặp lai; (2) Lai và tạo quần thể cho bản đồ; (3) Theo dõi sự phân ly của các chỉ thị trong quần thể; (4) Xử lý thống kê và lập bản đồ. Lập bản đồ QTL nhằm xác định vị trí, hiệu quả gen và hoạt động của các locus liên quan trong tương tác gen và tương tác QTL với môi trường, từ đó chọn lọc nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử (MAS-Marker Assisted Selection). Kỹ thuật QTL cũng được Zhu J. và cs (2005) sử dụng để lập bản đồ cho cây ngô với mục đích nhận dạng, định lượng trạng thái locus, điều hoà độ dài của rễ phụ, xác định mức độ mềm dẻo của rễ nguyên thuỷ, xác định 6 bản đồ QTL có liên quan tới 53,1% các biến đổi phospho ở hạt [53]. 1.2.1. 5. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Kỹ thuật RAPD là kỹ thuật phân tích sự đa hình các phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên, do hai nhóm nghiên cứu của Williams và CS (1990) [52] và Welsh và McClelland (1991) đồng thời xây dựng [51]. Đây là một kỹ thuật phát hiện chỉ thị di truyền dựa trên phản ứng chuỗi polymerase (PCR) [27]. PCR là một công cụ hữu hiệu cho việc phân tích hệ gen thực vật, vì nó có khả năng tạo ra một lượng lớn các trình tự DNA đặc hiệu từ bất kỳ cơ thể nào. Hiện nay PCR được xem là phương pháp nhanh, chính xác, tương đối đơn giản để đánh giá sinh vật chuyển gen, phân tích nhanh chóng sự biến dị di truyền ở phạm vi quần thể và giữa các cá thể. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 Sự hạn chế lớn nhất của kỹ thuật này là phải dựa trên một trình tự DNA đặc hiệu. Tuy nhiên, hạn chế này đã được các nhà sinh học phân tử cải tiến, khắc phục đó là kỹ thuật PCR sử dụng đoạn mồi ngẫu nhiên hay còn gọi là kỹ thuật RAPD [34]. Các thành phần cần thiết để tiến hành phản ứng RAPD bao gồm: - DNA khuôn (DNA template) với nồng độ 5 - 50 ng trong 25µl. - Đoạn mồi (primer): Chỉ sử dụng một mồi đó là một oligonucleotide có trật tự nucleotide ngẫu nhiên và có chiều dài khoảng 10 nucleotide. - DNA polymerase: Hoạt động của DNA-polymerase phụ thuộc vào Mg 2+, nồng độ dNTP, pH, nhiệt độ biến tính DNA. DNA-polymerase thường dùng là Taq-polymerase. - Bốn loại deoxyribonucleotide triphotphat (dNTP). - Ion Mg2+ và dung dịch đệm. Phản ứng RAPD được tiến hành qua các giai đoạn giống như PCR: - Giai đoạn biến tính DNA: Ở nhiệt độ 950 C trong 30 - 60 giây làm cho hai mạch khuôn tách nhau. - Giai đoạn tiếp mồi: Khi hạ nhiệt độ xuống 32 - 400 C, mồi tiếp hợp và bám vào sợi DNA khuôn. - Giai đoạn tổng hợp: Nhiệt độ được nâng lên 720 C thì các đoạn mồi đã bắt cặp với các mạch đơn sẽ được kéo dài với sự tham gia của Taq- polymerase. Sau một chu kỳ gồm ba giai đoạn như trên, một phân đoạn DNA khuôn được nhân lên thành hai, các đoạn DNA được nhân bản trong mỗi chu kỳ lại được coi là DNA khuôn cho mỗi chu kỳ nhân bản tiếp theo. Vậy sau k chu kỳ nhân bản sẽ tạo ra 2k các đoạn DNA giống đoạn DNA khuôn ban đầu. RAPD có thể thực hiện từ 40 - 45 chu kỳ. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 Kỹ thuật RAPD có ưu điểm ở chỗ sử dụng các mồi ngẫu nhiên dài 10 nucleotide, quá trình nhân bản DNA là ngẫu nhiên. Đoạn mồi này có thể bám vào bất kỳ vị trí nào có trình tự nucleotide bổ sung trên phân tử DNA hệ gen. Với đặc điểm là ngắn nên xác suất đoạn mồi có được điểm gắn trên phân tử DNA khuôn là rất lớn. Tùy vào nhóm, loài thực vật hay vi sinh vật mà các đoạn mồi ngẫu nhiên được thiết kế chuyên dụng. Theo lý thuyết, số lượng các đoạn DNA được nhân bản phụ thuộc vào độ dài, vị trí của các đoạn mồi, kích thước và cấu trúc DNA genome. Thông thường mỗi đoạn mồi ngẫu nhiên sẽ tạo ra từ 2 - 10 sản phẩm nhân bản. Kết quả là sau khi điện di sản phẩm RAPD sẽ phát hiện được sự khác nhau trong phổ các phân đoạn DNA được nhân bản. Sự khác nhau đó gọi là tính đa hình. Hiện tượng đa hình các đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên xuất hiện là do có sự biến đổi trình tự nucleotide tại vị trí các đoạn mồi liên kết. Sản phẩm khuếch đại được phân tích bằng điện di trên gel agarose hoặc polyacrylamide và có thể quan sát được sau khi gel được nhuộm bằng hoá chất đặc trưng. Vì vậy, tính đa hình thường được nhận ra do sự có mặt hay vắng mặt của một sản phẩm nhân bản [49]. Trong những năm gần đây, kỹ thuật RAPD được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy, RAPD là một phương pháp có hiệu quả trong việc xác định kiểu gen, phân tích quần thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền và lập bản đồ di truyền [3]. Phương pháp này còn được ứng dụng trong việc đánh giá bộ gen của giống và khả năng phân tích. Kỹ thuật RAPD còn dùng để nhận biết, phân loại các giống cây trồng khác nhau như chuối, lúa mì, đu đủ, đậu tương...và phát hiện, bảo tồn sự đa dạng di truyền đặc biệt là các loài quí hiếm hay một số giống thực vật địa phương. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 1.2.2. Nghiên cứu sự đa dạng di truyền ở thực vật bằng kỹ thuật RAPD Hiện nay, kỹ thuật RAPD đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu và xác định quan hệ di truyền ở thực vật. Kỹ thuật RAPD cũng được ứng dụng trong việc đánh giá đa dạng di truyền giữa các loài và trong phạm vi một loài phân tích và đánh giá hệ gen thực vật nhằm xác định những thay đổi của các dòng chọn lọc ở mức độ phân tử [40], [41]. Phương pháp này còn được ứng dụng trong việc đánh giá bộ gen của giống và khả năng phân tích mối quan hệ di truyền giữa các loài, nhóm các cá thể cùng một loài [11]. Muthusamy S. và cs (2008) sử dụng kỹ thuật RAPD với 74 mồi ngẫu nhiên và kỹ thuật ISSR với 37 cặp mồi để nghiên cứu quan hệ di truyền của 10 giống đậu gạo thu được 987 băng DNA (trong đó có 719 băng đa hình) từ kỹ thuật RAPD và 479 băng DNA (trong đó có 296 băng đa hình) từ kỹ thuật ISSR, mức độ đa hình RAPD là 70,3%, mức độ đa hình ISSR là 60,79% [39]. Afzal và cs (2004) nghiên cứu tính đa hình của tập đoàn giống đậu xanh nhằm chọn tạo giống đậu xanh có năng suất cao và chịu bệnh đốm vòng do virus. Các tác giả đã sử dụng 21 giống đậu xanh với 34 mồi ngẫu nhiên và thu được tổng số 204 phân đoạn DNA được nhân bản [23]. Moretzohn và CS đã nghiên cứu sự đa dạng di truyền của lạc và mối quan hệ với dạng dại của chúng trên cơ sở phân tích các vùng siêu biến của hệ gen [38]. Đánh giá tính đa dạng của một số giống lạc trong tập đoàn giống chống chịu bệnh gỉ sắt Yiwu Chen và cs (2006) đã sử dụng 11 mồi ngẫu nhiên, tác giả đã nhận được 109 phân đoạn DNA, trong đó có 66 phân đoạn đa hình, chiếm 60,6%. Điều này cho thấy, trong phạm vi của mỗi phản ứng RAPD giữa 33 giống lạc nghiên cứu khác nhau về cấu trúc DNA, mức sai khác từ 4% đến 18%. Kết quả phân tích DNA cho thấy các giống lạc ở cùng một vùng địa lý, sinh thái được tập trung thành từng nhóm, giữa các giống chống chịu bệnh gỉ sắt của tập đoàn giống ICRISAT và các giống năng suất trong Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 nước không nằm trong cùng một nhánh. Vì thế có thể lựa chọn các cặp bố mẹ mong muốn để phục vụ cho công tác lai giống [28]. Chu Hoàng Mậu và cs (2002) đã sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên để so sánh hệ gen của các đậu tương đột biến bằng kỹ thuật RAPD cho thấy ba đoạn mồi có biểu hiện đa hình và 6 dòng đậu tương đột biến có mức độ sai khác về bộ gen [14]. Võ Thị Thương Lan và cs (1999), nghiên cứu tính đa dạng di truyền của loài rong câu biển đã cho thấy tổng số có 46 băng rõ nét được nhân ngẫu nhiên với 3 mồi (OPA4, PA10, OPL12) và đã phát hiện được sự sai khác về mặt di truyền ngay trong một loài rong câu sinh trưởng trong các điều kiện khác nhau [10]. Để đánh giá sự thay đổi di truyền của các dòng lúa tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước, Đinh Thị Phòng và cs (2001) đã sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên để chỉ ra sự sai khác ở mức độ phân tử giữa các đối tượng này [15]. Nguyễn Thị Tâm (2003) sử dụng 5 mồi ngẫu nhiên để phân tích tính đa hình DNA trong bộ gen của dòng lúa được chọn lọc kết quả các dòng có sự sai khác ở mức độ phân tử, trong đó dòng HR128 có hệ số sai khác với giống gốc là lớn nhất [16]. Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2003) nghiên cứu đa dạng di truyền của một số giống đậu xanh cho thấy trong 5 mồi ngẫu nhiên chỉ có 3 mồi RA31, RA45, RA46 cho kết quả đa hình, hệ số tương đồng giữa các giống dao động từ 0,41- 0,80 [17]. Kỹ thuật RAPD còn là một công cụ rất có hiệu quả trong việc tìm ra các chỉ thị phân tử để phân biệt các giống hay các loài khác nhau. Raina và cs (2001) đã sử dụng chỉ thị RAPD – SSR để phân tích sự đa dạng hệ gen và xác định mối quan hệ họ hàng giữa các giống lạc trồng và lạc dại [45]. Kỹ thuật RAPD được sử dụng rộng rãi trong những năm gần đây để phân tích di truyền hệ thống sinh học. Nó là phương pháp hiệu quả trong việc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 xác định kiểu gen, phân tích quần thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền và lập bản đồ di truyền. 1.2.3. Tình hình nghiên cứu sự đa dạng di truyền của ngô bằng kỹ thuật RAPD Vasconcelos M.J.V.D và cs (2008) sử dụng kỹ thuật RAPD với 47 mồi ngẫu nhiên đã nhân được 221 băng DNA trong đó có 130 băng biểu hiện đa hình [50]. Souza S.G.H.D. và cs (2008) xác định quan hệ di truyền của 16 dòng ngô lai với sử dụng 22 mồi RAPD khuếch đại được 265 băng DNA và 16 cặp mồi SSR khuếch đại được 75 băng DNA, 16 dòng ngô được chia thành 3 nhóm [47]. Okumus A. (2007), 17 giống ngô của Turkey được sử dụng nghiên cứu với 14 mồi RAPD thu được 125 băng đa hình (chiếm 89%), hệ số sai khác giữa các giống ngô từ 0,08-0,2 [42]. Abdel - Mawgood A.L. và cs (2006) đã sử dụng một số các chỉ thị phân tử RAPD, SSR, 18S rRNA gen …để kiểm tra các dòng ngô, trong đó có ba giống ngô tự nhiên (L1, L2, L3) và hai giống lai F1 bắt nguồn từ họ H1 và H2. Hai trong 5 mồi RAPD sử dụng nghiên cứu biểu hiện tính đa hình, một trong những mồi cho đa hình đã xác định được con lai H2 từ hai dòng thuần. Đối với 18S rRNA thì không phát hiện được các băng đa hình [22]. Asif M. và cs (2006) đã tiến hành phân tích DNA cho 6 giống ngô lai bằng cách sử dụng các mồi ngẫu nhiên để khuếch đại đa hình DNA bằng kỹ thuật RAPD. Tác giả đã sử dụng 40 mồi ngẫu nhiên, trong đó có OPR – 03, OPR – 11 và OPR- 06 đã cho đa hình. Kết quả đã kiểm tra được 3 trong rất nhiều giống ngô lai và cũng phân biệt được nguồn gốc của một số giống ngô lai. Tác giả đã kết luận RAPD là một công cụ hữu hiệu để phát hiện sự tinh khiết của giống lai nhằm nâng cao hiệu quả trong trồng trọt và chăn nuôi [25]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 Valdemar P. C. và cs (2004) nghiên cứu khoảng cách di truyền của 81 giống ngô trong đó có 79 thuộc vùng bắc Châu Âu và 2 giống cải tiến. Sử dụng kỹ thuật RAPD với 32 mồi được khuếch đại, cao nhất là 255 chỉ thị mà có 184 băng DNA (chiếm khoảng 72,2%) là đa hình. Dựa trên những chỉ thị RAPD, việc lập một phả hệ sử dụng phương pháp UPGMA. Tỷ lệ kiểu di truyền tương tự nhau từ 0,78 đến 0,91. Nhóm số liệu phân tử tập hợp thành 2 nhóm chính, mà màu sắc hạt có tương quan với nhau [40]. Naureen Z. và cs (2005) nghiên cứu đa hình của 30 chủng vi khuẩn ở rễ ngô nhằm chọn tạo giống ngô cho năng suất cao và tách dòng vi khuẩn rhizo rễ ngô. Các tác giả đã sử dụng 30 mồi oligonucleotide, kết quả sự đa dạng di truyền đạt mức đáng kể với khoảng cách di truyền 2 – 16% [41]. Amorime. P. và cs (2003) đã sử dụng các chỉ thị phân tử RAPD và SSR để chọn lọc 13 giống ngô đường. Trong đó, sử dụng 50 mồi RAPD tạo được 104 băng (chiếm 72,2%), còn sự phân tích SSR đánh giá 7 locus với 42 alen đạt giá trị PEC từ 0,5 đến 0,89. Ước tính sự tương đồng di truyền đối với mồi RAPD là 0,79, còn chỉ thị SSR là 0,49 [24]. Osipova E.S. và cs (2001) nghiên cứu sự khác nhau di truyền học giữa dòng ngô A188 và dòng soma bắt nguồn từ A188, được đánh giá qua sự phân tích của kỹ thuật RAPD. Sử dụng 15 mồi trong số 17 mồi decanucleotie, từng mồi cho sự khuếch đại đạt từ 2 – 17 phân đoạn dài 200 – 2000 bp. Mô hình RAPD không khác giữa những các cá thể của dòng A188, biểu hiện tính đồng nhất về di truyền học cao. Sự khác nhau giữa dòng ban đầu và dòng soma cao từ 64 – 72%. Căn cứ vào sự phân ly di truyền dòng soma chia làm 2 nhóm. Sự phân biệt những nhóm dòng soma này phù hợp với nguồn gốc của chúng [43]. Bauer I (2005) nghiên cứu đặc tính trưởng thành sớm của ngô lai thu được bằng cách đánh dấu protein và RAPD. Khi sử dụng mồi RAPD cho thấy tỉ lệ đa hình cao hơn đánh dấu protein [26]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 Ở Việt Nam, Bùi Mạnh Cường và cs (2002) đã tiến hành nghiên cứu sự đa hình di truyền của một số giống ngô và xác định được một số cặp lai ưu tú có khả năng cho ưu thế lai cao [5]. Ngô Hữu Tình và cs (2002), nghiên cứu khoảng cách di truyền của các cặp lai và nhóm ưu thế lai ở một giống ngô, kết quả tuyển được 7/28 cặp lai cho năng suất cao[19]. Ngô Việt Anh (2005) đã sử dụng kỹ thuật RAPD với 5 mồi ngẫu nhiên đã nhận được 150 phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên từ hệ gen của 7 giống ngô nếp địa phương. Cả 5 mồi sử dụng trong nghiên cứu đều biểu hiện tính đa dạng và có 16 phân đoạn DNA đa hình chiếm 51,6% [1]. 1.3. NHẬN XÉT CHUNG Trong những năm gần đây phương hướng sản xuất ngô ở nước ta là cần tăng cường diện tích trồng ngô lai năng xuất cao trên cơ sở ứng dụng các thành tựu khoa học kỹ thuật nhằm tăng năng suất để đạt và vượt mức trung bình của thế giới. Tuy nhiên, trong thực tế sản xuất ngô Việt Nam vẫn phải nhập nội rất nhiều các giống ngô mà vẫn có những mùa bị thất thu do giống không đảm bảo chất lượng. Vì vậy, việc nghiên cứu hóa sinh hạt ngô nhằm tìm ra các giống ngô có năng suất cao, chất lượng tốt và ổn định là góp phần chọn được các giống có năng suất và chất lượng ổn định. Những công trình đánh giá sự di truyền của cây ngô ở nước ta còn ít. Sự đa dạng di truyền sẽ chỉ ra được mức độ sai khác giữa các giống ngô nghiên cứu ở mức độ phân tử đồng thời giải thích được tính đa dạng nguồn gen của cây ngô. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1. Vật liệu thực vật Sử dụng 14 giống ngô làm vật liệu nghiên cứu. Nguồn gốc, đặc điểm nơi thu mẫu được trình bày ở bảng 2.1. Bảng 2.1. Danh sách 14 giống ngô nghiên cứu STT Giống Nguồn gốc Đặc điểm nơi thu mẫu 1 TL Trà Lĩnh – Cao Bằng Địa hình cao 2 VN Lâu Thượng – Võ Nhai Địa hình cao 3 CB Phục Hoà – Cao Bằng Địa hình cao 4 SLO Bản Lầm – Sơn La Địa hình cao 5 T26 Sông Bằng – Cao Bằng Địa hình cao 6 SL Bản Đen – Sơn La Địa hình cao 7 SLV Bản Cóc – Sơn La Địa hình cao 8 TQ Hàm Yên – Tuyên Quang Địa hình cao 9 ÔL Phú Lương – Thái Nguyên Địa hình cao 10 ĐP Phú Bình – Thái Nguyên Trung du 11 LC Than Uyên – Lai Châu Địa hình cao 12 SLT Bản Cóc – Sơn La Địa hình cao 13 YB Văn Chấn – Yên Bái Địa hình cao 14 T4 Quyết Thắng – Thái Nguyên Trung du 2.1.2. Hoá chất Sử dụng các loại hoá chất tinh khiết nhập từ các nước Mỹ, Trung Quốc, Đức, Anh, Thụy Điển như: Tris, EDTA, CTAB, taq – polymerase, agarose, buffer PCR, MgCl2, dNTPs, NaCl, sorbitol, NaH2PO4.2H2O… và các hoá chất thông dụng khác. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 2.1.3. Thiết bị Nồi hấp khử trùng (Sturdy - Tai Wan); Lò vi sóng (Sharp); Máy soi gen tia UV (Weatea - USA); Nguồn điện di DNA (USA); Máy li tâm (Hettich – Germary); Máy lắc nhuộm DNA (UK); Cân điện tử; Máy khuấy trộn Vortex; Máy đo pH (Mettler Toledo); Bể ổn nhiệt; Tủ sấy (Memmert); Tủ cấy vô trùng; Tủ lạnh sâu -20oC, -80oC (Sanyo, Nhật Bản); Máy PCR (Applied Biosystems- Mỹ); Máy quang phổ (Thermo Electron). Và một số thiết bị khác như: ống eppendorf, đầu côn, pipet man, ống PCR… 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phƣơng pháp hóa sinh 2.2.1.1 Xác định hàm lƣợng lipid Hàm lượng lipid được xác định trên hệ thống bán tự động Soxhlet của hãng Gerhardt, gồm có: bình cầu, trụ chiết, ống sinh hàn. Dựa vào tính chất hoà tan của dung môi hữu cơ để chiết lipid, dung môi hữu cơ được sử dụng là petroleum ether. 2.2.1.2 Xác định hàm lƣợng protein Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Kjeldahl. Nguyên lý: mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4 98% kết hợp với chất xúc tác để chuyển nitơ hữu cơ thành (NH4)2SO4 rồi dùng NaOH để đẩy NH3 ra khỏi muối amoni. NH3 sau khi được giải phóng ra sẽ được cuốn đi bằng dòng hơi nước nóng. Sau khi được làm nguội sẽ hấp thụ vào dung dịch H3BO3 ở trong bình hứng tạo ra muối borat amon có màu xanh trong. Để xác định được lượng amoniac giải phóng ra trong quá trình chưng cất ta đem đi chuẩn độ bằng dung dịch H2SO4 0,1N đến khi dung dịch chuyển sang màu tím nhạt. Từ lượng H2SO4 0,1N tiêu tốn trong quá trình chuẩn độ sẽ tính được lượng protein có trong mẫu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 2.2.1.3. Xác định hàm lƣợng đƣờng tan - Xác định hàm lượng đường theo phương pháp Bertrand được mô tả trong tài liệu của Phạm Thị Trân Châu và cs [4]. - Nguyên tắc: Đường trực tiếp khử oxi của hydroxit đồng ở môi trường kiềm mạnh làm cho nó bị kết tủa dưới dạng đồng hóa trị 1 (Cu2O) có màu đỏ gạch. Số lượng đồng hóa trị 1 tương ứng với số lượng đường khử theo phương trình phản ứng: RCHO + 2Cu(OH)2 → RCOOH + Cu2O + 2H2O Cu +1 + Fe 3+ + H2SO4 → 2CuSO4 + H2O + 2FeSO4 FeSO4 có tính khử oxi tác dụng với KMnO4 do đó dùng KMnO4 để chuẩn độ. Từ số ml KMnO4 0,1N dùng để chuẩn độ sẽ xác định được hàm lượng đường khử. 2.2.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử 2.2.2.1. Phƣơng pháp tách DNA từ lá non của ngô - Quy trình tách chiết và làm sạch DNA tổng số từ lá ngô theo phương pháp của Gawel và cs [31]. Quy trình tách chiết DNA tổng số đƣợc thực hiện theo các bƣớc sau: - Lấy khoảng 200g lá ngô non đã để lạnh ở -850C ở nghiền nhanh trong cối chày sứ có chứa nitơ lỏng. - Bổ sung 0,8ml đệm rửa, li tâm 15 phút, 12000 vòng/ phút, loại bỏ dịch nổi. Bước này làm 2 lần. - Thêm 700µl đệm tách, mix nhẹ, ủ 650C trong 2h, sau đó lấy ra để ở nhiệt độ phòng 5 phút. - Thêm 600µl cloroform:isoamyl alcohol (24:1 ), trộn đều 20 phút - Li tâm 15 phút, 12000 vòng/phút. Hút cẩn thận 500µl dịch trong sang ống eppendorf 1,5 ml mới ( bỏ tủa). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 - Thêm 600µl isopropanol, lắc nhẹ, đặt lên đá (để tủ lạnh qua đêm), chờ có dịch tủa trắng. - Li tâm 5 phút, 13000 vòng/ phút, bỏ dịch, úp xuống giấy cho khô. - Bổ sung 300µl cồn 70%, búng nhẹ. Li tâm 5 phút, 13000 vòng/ phút, loại bỏ cồn (thực hiện 2 lần). - Làm khô DNA. - Hòa tan DNA trong 50 µl nước khử ion. - Kiểm tra chất lượng DNA thu được thông qua điện di trên gel agarose 0,8%. - Xác định hàm lượng và độ tinh sạch của DNA trên máy quang phổ và pha loãng về nồng độ sử dụng 10ng/µl. 2.2.2.2. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng và độ tinh sạch DNA tổng số * Phương pháp quang phổ hấp thụ Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA trên máy quang phổ ở bước sóng  = 260 nm và  = 280 nm. Hàm lượng và độ sạch của DNA trong dung dịch tách chiết được tính theo công thức: Hàm lượng DNA (ng/l) = OD260×50× hệ số pha loãng. Độ sạch DNA = OD260/OD280. Trong đó: OD260: chỉ số đo được ở bước sóng 260 nm OD280: chỉ số đo được ở bước sóng 280 nm Nếu độ sạch DNA = 1,8 - 2,0 thì mẫu được coi là sạch. * Phương pháp điện di DNA tổng số trên gel agarose - Pha agarose 0,8% trong TAE 1X, đun nóng cho tan agarose trong lò vi sóng, để nguội khoảng 60oC; Đổ bản gel và đợi cho khô (khoảng 1 giờ) sau đó tháo lược. - Lấy 5 µl mẫu DNA tách được trộn với 2 µl dye 6X, tra mẫu vào giếng điện di. - Chạy điện di với điện thế 80V trong 30 phút. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 - Lấy bản gel nhuộm ethidium bromide 0,5 µl/ml trong 10 phút, rửa lại bằng nước. - Soi bản gel trên máy soi gen tia UV, chụp ảnh. 2.2.2.3. Phản ứng RAPD Phản ứng RAPD được tiến hành với các mồi ngẫu nhiên theo phương pháp của Foolad và cs (1990) [29]. - Sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên được tổng hợp tại hãng Invitrogen, mỗi mồi dài 10 nucleotide, thông tin về trình tự các mồi sử dụng được trình bày trong bảng 2.2 Phản ứng RAPD được thực hiện trong 20 µl dung dịch với thành phần trong bảng 2.3. Tiến hành nhân bản DNA trong máy PCR với chu trình nhiệt của phản ứng RAPD là 1 chu kì 94oC trong 3 phút; 45 chu kì với nhiệt độ (92 o C trong 30 giây, 36 o C trong 45 giây, 72 o C trong 1 phút); 1 chu kì 72 o C trong 10 phút; lưu giữ ở 4oC. Bảng 2.2. Trình tự các nucleotide của 10 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu STT Tên mồi Trình tự nucleotide 1 M1 5’ AACCGACGGG 3’ 2 M2 5’ GGGGGTCGTT 3’ 3 M3 5’ TACCACCCCG 3’ 4 M4 5’ GGCGGACTGT 3’ 5 M5 5’ TCGGCGATAG 3’ 6 M6 5’ GTGTCTCAGG 3’ 7 M8 5’ GGAAGTCGCC 3’ 8 M9 5’ CCTCCAGTGT 3’ 9 RA159 5’ GTCCACACGG 3’ 10 UBC23 5’ CCCGCCTTCC 3’ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng RAPD STT Thành phần Thể tích (l) 1 H2O khử ion 11,7 2 Buffer PCR 2,0 3 MgCl2 (25 mM) 2,0 4 dNTP (2,5 mM) 1,2 5 Primer (10 mM) 1,6 6 DNA (10 ng/µl ) 1,0 7 Taq-polymerase 0,5 Tổng 20,0 Điện di sản phẩm RAPD Pha agarose 2% trong TAE 1X. Chạy điện di với hiệu điện thế 100V trong 90 phút. Nhuộm bản gel bằng ethidium bromide 0,5 µg/ml trong 15 phút, rửa sạch bằng nước, soi gel trên đèn UV và chụp ảnh. Phân tích số liệu RAPD Dựa trên sự xuất hiện hay không xuất hiện của các phân đoạn DNA khi điện di sản phẩm RAPD của các giống ngô nếp với các đoạn mồi ngẫu nhiên để làm cơ sở cho sự phân tích số liệu theo quy ước: Số 1: xuất hiện phân đoạn DNA, số 0: không xuất hiện các phân đoạn DNA. Các số liệu này được xử lý trên máy vi tính theo chương trình NTSYSpc version 2.0 để xác định quan hệ di truyền của các giống ngô ở mức độ phân tử. 2.2.2.4. Phƣơng pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu Mỗi thí nghiệm được nhắc lại 3 lần. Sử dụng toán thống kê để xác định trị số thống kê như trung bình mẫu ( x ), phương sai (2), độ lệch chuẩn (), và sai số trung bình mẫu ( x S ), với n ≤ 30, α = 0,05. Các số liệu được xử lý trên máy vi tính bằng chương trình Excel [21]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, HÓA SINH HẠT CỦA CÁC GIỐNG NGÔ NGHIÊN CỨU 3.1.1. Đặc điểm hình thái của 14 giống ngô nghiên cứu Hình thái và khối lượng hạt là những đặc tính quan trọng trong chọn giống ngô vì nó liên quan đến chất lượng và năng suất. Kết quả nghiên cứu hình thái và khối lượng 100