Luận văn Nghiên cứu, xác định một số đặc điểm dịch tễ của hội chứng tiêu chảy và sự nhiễm khuẩn E.coli ở trâu nuôi tại Bảo Yên - Lào Cai và biện pháp phòng trị bệnh

độc tố đƣợc coi là một kháng nguyên hoàn toàn và có tính đặc hiệu cao đối với các chủng của mỗi Serotype. Hiện nay, khi nghiên cứu về độc tố do E.coli sinh ra thì ngƣời ta thƣờng chú ý đến hai lớp độc tố đƣờng ruột đó là: - Độc tố chịu nhiệt (ST = Heat – Stable – Toxin): Độc tố này chịu đƣợc nhiệt độ 100 0 C trong 15 phút sử lý. Độc tố ST đƣợc chia thành hai nhóm STa và STb dựa trên tính hoà tan trong Methanol và hoạt Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 tính sinh học (Robichaud và cộng sự, 1987 [92]). Cả STa và STb đều có vai trò gây ỉa chảy cho các chủng E.coli gây bệnh ở gia súc, gia cầm và trẻ sơ sinh. STa kích thích hệ thống men Guanylate cyclase có mặt trên các tế bào biểu mô ruột vật chủ chuyển GTP thành cGMP. cGMP hoạt hóa 86 – Kpa protein kinase dẫn đến Phosphoryl hóa Phosphatiglycilinositol, hình thành Diaxyglyxerol, inositol 1,4,5 triphosphate, từ đó kích hoạt men C – kinase. Ba sản phẩm trên gây tăng hàm lƣợng Ca ++ bên trong tế bào, Ca ++ ngăn cản quá trình hấp thu Na + , Cl - nƣớc từ trong xoang ruột vào tế bào, đồng thời kích thích thải Na + , Cl - từ tế bào vào xoang ruột, hiện tƣợng này gây nên tiêu chảy. STb là một protein có tính kháng nguyên yếu, có phân tử lƣợng gần 5000Dalton, STb kích thích vòng nucleotit phân tiết dịch độc lập ở ruột. STb hoạt động ở ruột non lợn, nhƣng không hoạt động ở ruột non chuột, bê và bị vô hoạt bởi Trypsin (Fairbrotherb J.M, 1992 [69]). - Độc tố không chịu nhiệt (LT = Heat – Labile – Toxin): Độc tố này bị vô hoạt ở nhiệt độ 60 o C trong 15 phút (Guerrant, 1975 [72]). Độc tố LT có trọng lƣợng phân tử cao, nó gồm 5 nhóm B có khả năng bám dính lên bề mặt biểu bì của bề mặt ruột và một nhóm A có hoạt tính sinh học cao. Chỉ có các chủng E.coli gây bệnh cho ngƣời và lợn là có khả năng sản sinh LT, còn ở gia cầm và các loài khác không có khả năng. Độc tố kích thích tế bào niêm mạc ruột làm sản sinh Prostaglandin làm tăng cƣờng sản xuất 3,5 Adenozin – Monophotphat, làm thay đổi quá trình trao đổi nƣớc và chất điện giải. Kết quả là niêm mạc ruột bị xung huyết, tăng tính thấm của thành mạnh, từ đó nƣớc và chất điện giải thấm qua thành mạch vào trong ruột gây ỉa chảy. Độc tố không chịu nhiệt thực hiện quá trình gây bệnh chậm nhƣng kéo dài từ 18 – 24 giờ, đôi khi kéo dài từ 36 – 48 giờ. Theo Đặng Xuân Bình và cộng sự (2004) [4] khi xác định khả năng sản sinh độc tố của 96 chủng E.coli phân lập đƣợc từ phân và bệnh phẩm của lợn con từ sơ sinh đến 35 ngày tuổi cho thấy số chủng sản sinh ST chiếm tỷ lệ 87,5%, LT chiếm 50,0%, LT + ST chiếm tỷ lệ là 31,25%. Cả hai loại độc tố ST và LT đều bền vững ở nhiệt độ âm, thậm chí cả ở (- 20 o C). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 Độc tố tế bào Verotoxin: Konowalchuck và cộng sự (1977) [82], đã phát hiện một loại độc tố hoạt động trong môi trƣờng nuôi cấy tế bào Vero, đƣợc sản sinh ra bởi vi khuẩn E.coli gây bệnh tiêu chảy ở ngƣời và gây bệnh phù đầu ở lợn con. Ảnh hƣởng gây bệnh ở tế bào của độc tố Vero rất khác so với ảnh hƣởng của độc tố đƣờng ruột không chịu nhiệt cổ điển của nhóm vi khuẩn E.coli gây bệnh đƣờng ruột. Độc tố Vero (VTs) hay Shiga (SLTS) là thuật ngữ đƣợc sử dụng trƣớc đây. Gần đây các nhà khoa học đã đề nghị sử dụng tên độc tố Shiga (Stx) cho tất cả những độc tố tế bào này. Stx sản sinh bởi E.coli bao gồm 2 nhóm: Stx1 và Stx2. 1.2.7. Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn E.coli Khả năng gây bệnh của vi khuẩn đƣờng ruột tạo ra hội chứng tiêu chảy, viêm ruột đã trở thành mối lo ngại cho sức khoẻ ở ngƣời nói riêng và ở động vật nói chung trên toàn thế giới. Trong đó, vai trò gây bệnh của E.coli là rất lớn, nó có khả năng gây ra bệnh cho tất cả các động vật máu nóng. E.coli luôn luôn tồn tại trong đƣờng tiêu hoá của gia súc, gia cầm. Nhƣng dƣới ảnh hƣởng của một số yếu tố nhất định, các chủng E.coli gây bệnh trỗi dậy gây bệnh, gây ra hội chứng ỉa chảy và nhiễm trùng huyết ở gia súc non hoặc bệnh đƣờng hô hấp của gia cầm và các chủng khác không gây bệnh có thể trở thành căn bệnh cơ hội khi điều kiện cho phép. Vi khuẩn E.coli sau khi đƣợc sản sinh ra nhiều trong cơ thể động vật, chúng nhờ kháng nguyên bám dính để bám dính đƣợc vào lớp tế bào biểu mô nhung mao ruột. Sau đó vi khuẩn xâm nhập vào trong lớp tế bào biểu mô và phá hủy lớp tế bào này gây ra viêm ruột. Tại đây vi khuẩn sản sinh độc tố đƣờng ruột, tác động vào quá trình trao đổi muối, nƣớc ở ruột, làm cho nƣớc và chất điện giải không đƣợc hấp thu từ ruột vào cơ thể, ngƣợc lại thẩm xuất từ cơ thể vào ruột. Nƣớc tập trung vào ruột làm cho ruột căng lên, sức căng của ruột và quá trình viêm ruột kích thích vào hệ thần kinh thực vật ở ruột tạo nên những cơn nhu động ruột đẩy mạnh nƣớc và phân ra ngoài, gây nên tiêu chảy. Sau đó vi khuẩn E.coli tiếp tục xâm nhập vào hệ thống mạch quản gây hiện tƣợng dung huyết, phá vỡ hồng cầu gây thiếu máu, làm tăng tính thấm thành mạch, nƣớc từ trong mạch quản thẩm xuất ra và tích tụ trong các mô bào gây phù. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 1.3. Bệnh tiêu chảy do vi khuẩn E.coli gây ra ở trâu Bệnh tiêu chảy do vi khuẩn E.coli gây ra ở trâu là một thể bệnh rất hay gặp, E.coli thƣờng là nguyên nhân gây bệnh nguyên phát ở trâu, và từ đó tạo ra những phản ứng stress hoặc nhiễm trùng kế phát các bệnh khác. Thời gian nung bệnh thƣờng từ 12 – 18 giờ sau khi nhiễm bi khuẩn từ nền chuồng, vú mẹ, nƣớc uống. Bệnh thƣờng xảy ra ở các đàn có mật độ chăn nuôi cao hoặc ở các đàn lớn, nơi mầm bệnh lan truyền trong chuồng trại, nơi sinh sống. Ngƣời ta gọi Colibacillosis là một bệnh đƣờng ruột của ngựa, trâu, bò, cừu, lợn và gia cầm do vi khuẩn E.coli gây ra (Radostits O.M và cộng sự 1994 [91]) 1.3.1. Triệu chứng Nghé bị xù lông, ỉa chảy, phân trắng, vàng, có mùi hôi thối, gầy yếu nhanh chóng, các đầu xƣơng hông nhô ra, mắt trũng sâu, run rẩy, đi đứng siêu vẹo. Do bị mất nƣớc nên trọng lƣợng cơ thể giảm, cơ vùng bụng run rẩy, nhão, không còn trƣơng lực. Triệu chứng chủ yếu của bệnh tiêu chảy ở trâu do E.coli cũng nhƣ triệu chứng tiêu chảy do các nguyên nhân khác đó là hiện tƣợng tiêu chảy. Phân thƣờng từ nhão cho đến toàn nƣớc, màu của phân chuyển từ vàng sang trắng, trong phân có lẫn những vết máu, phân có mùi hôi thối. Thân nhiệt thƣờng bình thƣờng hoặc cao hơn một chút nhƣng vào giai đoạn cuối hay hạ xuống dƣới mức bình thƣờng, bê nghé có thể bỏ bú, không uống nƣớc, đôi khi có chƣớng bụng. Ở những trâu bị thể nhẹ có thể qua khỏi sau một vài ngày không cần điều trị, nhƣng khoảng 15 – 20% nghé bị bệnh ngày một nặng hơn, suy sụp hoàn toàn, nhiễm độc huyết dẫn đến chết nếu không điều trị tích cực (Phạm Sỹ Lăng, 1999 [23]). 1.3.2. Bệnh tích Do đặc điểm gây bệnh của E.coli là vi khuẩn chỉ tác động chủ yếu ở đƣờng tiêu hoá cho nên khi bê nghé chết thƣờng xác gầy, bẩn, lông xù, bê bết phân, hông lõm, niêm mạc nhợt nhạt. Bệnh tích chủ yếu là viêm ruột cata, dung huyết màng treo ruột. Dạ dày chứa sữa đông vón, không tiêu, màu trắng hoặc xám trắng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 Ruột non căng phồng, chứa đầy hơi với những đám xuất huyết ở trên thành ruột. Có thể có biến chứng viêm phổi, viêm màng phổi và viêm phúc mạc. 1.3.3. Chẩn đoán Việc chuẩn đoán bệnh tiêu chảy trâu do E.coli gây ra rất phức tạp bởi vì những triệu chứng, bệnh tích xuất hiện tƣơng tự nhƣ bệnh tiêu chảy do các nguyên nhân vi khuẩn khác, các loại đơn bào và virus, hơn nữa vi khuẩn E.coli thƣờng gây bệnh kết hợp với các mầm bệnh khác. Việc nuôi cấy phân lập vi khuẩn từ phân trâu bị bệnh cũng rất dễ dàng nhƣng phải tiến hành xác định xem đó có phải là E.coli gây bệnh hay là E.coli cộng sinh. Vì vậy sau khi phân lập vi khuẩn E.coli phải xác định các yếu tố gây bệnh nhƣ K99, Enterotoxin đồng thời xác định thêm các loại mầm bệnh khác nhƣ Rotavirut, Coronavirut, Salmonella, nhƣng có thể phân biệt qua PH của phân vì nếu tiêu chảy do E.coli gây ra thƣờng PH của phân nghiêng về bazơ, còn nếu tiêu chảy do Rotavirut, Coronavirut phân thƣờng nghiêng về axit. Chẩn đoán lâm sàng dựa vào triệu chứng ỉa chảy, phân màu trắng hoặc vàng nhạt, gầy yếu. Dựa vào bệnh tích ở ruột nhƣ ruột căng phồng chứa đầy hơi, thành ruột mỏng. Chẩn đoán vi khuẩn học nuôi cấy mầm bệnh trên các môi trƣờng thạch để quan sát sự phát triển của vi khuẩn E.coli. Giám định bằng phản ứng ngƣng kết trên phiến kính và trong ống nghiệm. Theo Nguyễn Nhƣ Thanh và cộng sự (1997) [51] cho biết: trong môi trƣờng có xitrat natri, E.coli không sử dụng đƣợc nguồn cacbon này nên không mọc, Aerogenes sử dụng đƣợc nguồn cacbon này nên mọc tốt, môi trƣờng trở nên xanh lơ. 1.3.4. Phòng bệnh Chƣơng trình phòng bệnh E.coli cho vật nuôi nói chung thì ta cần phải chú trọng đến sự giảm tỷ lệ ô nhiễm E.coli độc ở môi trƣờng xung quanh bằng chế độ vệ sinh, tiêu độc tốt. Luôn luôn kiểm soát hàm lƣợng vi khuẩn E.coli trong nƣớc, thức ăn theo đúng tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm, nƣớc uống. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 Duy trì điều kiện chăn nuôi thích hợp, đồng thời đảm bảo mức độ miễn dịch cao. Vì hầu hết các vi khuẩn E.coli gây bệnh chỉ có một số Serotype nhất định, do đó có thể thanh toán mầm bệnh này trong từng cơ sở. Chuồng trại phải luôn thông thoáng để các khí độc nhƣ: NH4, H2S…không gây độc cho cơ thể gia súc. Hạn chế tối đa các tác nhân gây stress, sự thiếu hụt vitamin mà đặc biệt là vitamin A, B. Định kỳ kiểm tra vi khuẩn bằng bằng phƣơng pháp kháng sinh đồ để xác định hiện tƣợng kháng thuốc. Phòng bệnh bằng vắc xin: Do vi khuẩn E.coli có rất nhiều tuýp kháng nguyên nên việc chế vắc xin và kháng nguyên là rất phức tạp. Ngƣời ta thƣờng chế vắc xin đa giá, cũng có thể chế vắc xin tại chỗ. Đối với bê, nghé do sự tiến triển sớm và nhanh của bệnh nên việc áp dụng vắc xin ít có ý nghĩa (Nguyễn Nhƣ Thanh và cộng sự, 1997 [51]) 1.3.5. Điều trị Nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Nhiên và cộng sự (2000) [37] cho thấy hầu hết các chủng của vi khuẩn E.coli phân lập đƣợc từ gia súc tiêu chảy đều có khả năng kháng lại nhiều loại kháng sinh nhƣ: Chloramphenicol, Sulfadimethoxine,…Trong đó có nhiều chủng lại mẫn cảm mạnh với Amikacin hoặc một số kháng sinh mới. Qua theo dõi tính kháng thuốc của E.coli trong một số năm gần đây ta thấy một số loại kháng sinh nhƣ Neomycin, Tetracyclin có tính mẫn cảm cao với E.coli. Ngoài ra ta cũng có thể sử dụng một số loại kháng sinh mới nhƣ: Cephalosporin, Gentamycin, Belcomycin, Septotrim, Colistin, Trimethoprim,… Ngoài việc sử dụng kháng sinh thì ta cần dùng các chất bổ sung thêm nƣớc và điện giải cho con vật. Nguyên lý điều trị bệnh tiêu chảy bê nghé do E.coli gây ra giống nhƣ điều trị các bệnh tiêu chảy do các nguyên nhân khác. Các kháng sinh thƣờng dùng để điều trị, tiêu diệt vi khuẩn E.coli gồm: Tetracylin, Neomycin, Colistin, Sulphamid, Trimethoprim, Nitrofetral dazan và Ampicillin có thể cho uống, trộn thức ăn hoặc tiêm. Nhƣng tốt nhất trƣớc khi dùng kháng sinh điều trị nên làm kháng sinh đồ để loại trừ khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn, một Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 loại kháng sinh không nên dùng diều trị quá 3 ngày. Để điều trị triệu chứng ngoài các dung dịch đã nêu trên có thể dùng: 113,6g Sodium chloride (NaCl) +50,3g Potassium chlorite (KCl) +108,9 Sodium bicarbonate (NaHCO3) + 535g Glucose + 232g Glycerin thành hỗn hợp, rồi lấy 38,2g hỗn hợp này hoà tan vào 1 lít nƣớc đun sôi để nguội cho bê nghé uống hoặc bú nếu bê nghé không tự uống và bú đƣợc thì dùng ống thông đƣa vào dạ dày (Phạm Sỹ Lăng, Lê Văn Tạo, 2002 [24]). 1.4. Tình hình nghiên cứu ở trong và ngoài nƣớc 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước Qua kết quả nghiên cứu vai trò gây bệnh của vi khuẩn E.coli trong bệnh tiêu chảy của bê nghé, Trƣơng Quang và cộng sự (2006) [44], cho biết: so sánh các yếu tố gây bệnh của E.coli phân lập từ phân bê nghé bị tiêu chảy với phân bê nghé không bị tiêu chảy cũng thấy thay đổi đáng kể: tỷ lệ các chủng mang kháng nguyên bám dính tăng gấp 3,4 và 2,9 lần. Khả năng dung huyết gấp 2,1 và 2,77 lần. Khả năng sản sinh độc tố đƣờng ruột gấp 6,93 và 3,69 lần. Độc lực giết chuột cũng tăng gấp 2 – 3 lần. Vũ Khắc Hùng và cộng sự (2007) [21], đã phân lập 237 mẫu phân trâu và 126 mẫu phân bò khỏe mạnh tại các tỉnh miền trung để kiểm tra tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E.coli sản sinh độc tố Shiga (STEC – Shiga toxin – producing E.coli), kết quả cho thấy: 27% trâu và 23% bò đƣợc kiểm tra mang STEC. Trong số 93 chủng STEC phân lập từ trâu và bò, 17 chủng mang gen stx1, 55 chủng mang đồng thời 2 gen stx1 và stx2. Tuy nhiên có 2 chủng mang gen stx1 nhƣng không gây độc cho tế bào Vero. Cũng trong 93 chủng trên có 68 chủng (73%) mang gen ehxA, 65 chủng (70%) mang gen saa. Những chủng E.coli đƣợc phân lập từ bê nghé có khả năng làm chết chuột khi gây nhiễm cho thỏ bằng cách đƣa trực tiếp canh trùng vào ruột non đã làm thỏ tiêu chảy trong thời gian từ 24 – 30 giờ, và giết thỏ trong vòng 36 giờ sau gây nhiễm (Nguyễn Văn Quang và cộng sự, 2002 [42]). Tác giả Phạm Thị Hồng Ngân (1999) [34], khi nghiên cứu khả năng sản sinh độc tố của các chủng E.coli phân lập đƣợc từ bê nghé khỏe mạnh và bị tiêu chảy thấy: Ở bê, nghé khỏe mạnh có một tỷ lệ nhất định các chủng E.coli Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 có khả năng sản sinh độc tố ruột (bê khỏe: 6,1%, nghé khỏe: 10,3%). Còn ở bê, nghé tiêu chảy thì tỷ lệ tăng lên (bê tiêu chảy: 27,8%, nghé tiêu chảy: 23,6%). Phạm Khắc Hiếu (1997) [19], cho thấy có 5% số chủng vi khuẩn E.coli phân lập đƣợc kháng lại 7 loại kháng sinh, 25% số chủng kháng lại 4 loại kháng sinh thƣờng dùng. Vi khuẩn E.coli là tác nhân quan trọng trong các bệnh nhiễm khuẩn đƣờng tiêu hoá. Nó là một vi khuẩn chiếm nhiều nhất trong các loại vi khuẩn hiếu khí trong đƣờng tiêu hoá của động vật (Bộ môn vi sinh vật trƣờng Đại Học Y Khoa Hà Nội, 1993 [5]). Chúng xuất hiện rất sớm trong đƣờng tiêu hoá của ngƣời và động vật sơ sinh. Khi mới sinh động vật không có E.coli trong ruột, nhƣng chỉ sau đẻ vài giờ đã có bình thƣờng . Để hạn chế nguyên nhân gây bệnh do vi khuẩn E.coli cho gia súc và gia cầm thì nhiều nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu vắc xin E.coli để phòng bệnh. Nguyễn Thị Nội (1985) [38], đã dùng các chủng EC3, EC25, EC36, EC236 của Hungari mang kháng nguyên K88 để sản xuất vắc xin theo phƣơng pháp cải tiến đã có hiệu quả cao trong phòng bệnh lợn con ỉa phân trắng. Lê Văn Tạo và các cộng sự, 1990, đã nghiên cứu yếu tố gây bệnh K88, Enterotoxin Hemolyse của các chủng E.coli gây bệnh ở lợn để chọn giống vi khuẩn chế vắc xin cho uống. Ở lợn và gia cầm, hiện đã có rất nhiều nhà khoa học nghiên cứu về bệnh E.coli để định chủng và chế vắc xin phòng bệnh. Còn ở trâu, bò cũng đã có một số nhà khoa học quan tâm nghiên cứu về bệnh, nhƣng để định Type huyết thanh, tìm các chủng gây bệnh chế vắc xin phòng bệnh thì chƣa thực sự đƣợc quan tâm nhiều lắm. Đó có lẽ là một tổn thất rất lớn đối với ngành chăn nuôi trâu bò ở nƣớc ta - khi mà ngành chăn nuôi trâu bò đang phát triển mạnh mẽ không ngừng thì kéo theo nó là tình hình bệnh E.coli cũng phát triển theo, điều đó đòi hỏi các nhà khoa học trong nƣớc cần phải quan tâm nhiều hơn nữa. 1.4.2. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài Trên thế giới từ lâu đã có rất nhiều nhà khoa học đi sâu nghiên cứu về vi khuẩn E.coli đặc biệt là trong những thập kỷ 60, 70 và những năm gần đây. Năm 1976 – Smith H.W và cộng sự [96] đã đề nghị: Khi lựa chọn giống vi khuẩn E.coli để sản xuất vắc xin phòng bệnh thì cần quan tâm đến các yếu tố gây bệnh mà vi khuẩn tiếp nhận đƣợc trong quá trình phát triển Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 cá thể, từ đó đi đến khẳng định vai trò gây bệnh của E.coli và đi sâu nghiên cứu những yếu tố gây bệnh của nó. Theo Sokol (1991) [98], sở dĩ vi khuẩn E.coli từ vai trò cộng sinh thƣờng trực trong đƣờng ruột đã trở thành vi khuẩn gây bệnh, vì trong quá trình sống của cá thể, vi khuẩn tiếp nhận đƣợc các yếu tố gây bệnh mà theo ông đó là yếu tố dung huyết (Hly), yếu tố cạnh tranh (Colv), yếu tố bám dính (K88, K99), yếu tố độc tố đƣờng ruột (Enterotoxin), yếu tố kháng kháng sinh. Các yếu tố gây bệnh này không đƣợc di truyền qua ADN của Chromosome mà di truyền bằng ADN nằm ngoài Romosome gọi là Plasmid, qua hiện tƣợng trao đổi bằng di truyền, bằng tiết hợp, chính những yếu tố di truyền này đã giúp cho vi khuẩn bám dính vào tế bào nhung mao ruột, xâm nhập vào thành ruột. Từ đây vi khuẩn thực hiện quá trình gây bệnh là sản sinh độc tố phá huỷ tế bào niêm mạc ruột gây bại huyết, dung huyết. Linggood (1982) [83] đã nghiên cứu về khả năng dung huyết của vi khuẩn E.coli và cho rằng đây là yếu tố độc lực quan trọng của vi khuẩn. Jones và cộng sự (1983) [77], đã nghiên cứu các loại khoáng nguyên bám dính mà E.coli có khả năng sản sinh gồm: F7, 987P, K88ab, K99. . . đồng thời tìm ra khối lƣợng phân tử, điểm đẳng điện cho từng loài. Dejonge (1984) [65], đã nghiên cứu về độc tố của vi khuẩn E.coli và cho rằng: E.coli sản sinh một số độc tố khác nhau nhƣ độc tố chịu nhiệt có bản chất là Peptit là nguyên nhân gây tiêu chảy, ngoài ra còn có Cytoxin, LTs, LTII2, LTIIb. Những độc tố này không bị trung hoà bởi kháng thể kháng độc tố Type. Faibrother (1992) [69], đã nghiên cứu và đặt tên các chủng E.coli theo những yếu tố gây bệnh mà chúng có khả năng sản sinh ra. Wilson J.M và cộng sự (1994) [101], khi phân lập trên bê, nghé bị tiêu chảy tai một số trang trại ở Canada cho thấy tỷ lệ nhiễm của bê dƣới 2 tuần tuổi với chủng Verotoxigenic E.coli là 17,80%, trên 2 tuần tuổi tới 3 tháng tuổi là 37,20%. Janke B.H và cộng sự (1989) [75], cho thấy vai trò của Adherence enteropathogenic E.coli là những nguyên nhân cơ bản và gây chết với tỷ lệ cao ở bê, nghé. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 Chƣơng 2 ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng, địa điểm, thời gian nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Trâu nuôi tại huyện Bảo Yên, tỉnh Lào Cai. 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu Địa điểm nghiên cứu: Các trang trại và hộ gia đình chăn nuôi trâu tại một số xã của huyện Bảo Yên, tỉnh Lào Cai. Địa điểm xét nghiệm: Phòng thí nghiệm Khoa Chăn nuôi thú y, Trƣờng Đại học Nông lâm Thái Nguyên. 2.1.3. Thời gian nghiên cứu Từ tháng 09/2007 – 09/2008. 2.2. Vật liệu dùng trong nghiên cứu 2.2.1. Mẫu bệnh phẩm Phân trâu tiêu chảy và phân trâu bình thƣờng tại các trang trại và hộ gia đình chăn nuôi trâu tại một số xã của huyện Bảo Yên, tỉnh Lào Cai. 2.2.2. Động vật thí nghiệm Chuột bạch: 18 – 20 gam/con, khỏe mạnh. 2.2.3. Hóa chất, môi trường thí nghiệm Các loại môi trƣờng dùng để nuôi cấy, phân lập vi khuẩn E.coli: thạch thƣờng, thạch MacConkey, thạch XLD, thạch máu, thạch Kligler, Nutrient broth, môi trƣờng BHI, dung dịch Kovac, thuốc nhuộm Gram, các loại giấy tẩm kháng sinh, các loại môi trƣờng đƣờng: Glucoze, Lactoze, Mannitol, Sorbitol,…. Kháng huyết thanh chuẩn định type kháng nguyên O đa giá và đơn giá, kháng huyết thanh K88 và K99 chuẩn. 2.2.4. Máy móc, thiết bị Buồng cấy vô trùng, nồi hấp ƣớt, tủ ấm, máy li tâm,… 2.3. Nội dung nghiên cứu 2.3.1. Một số đặc điểm dịch tễ của hội chứng tiêu chảy ở trâu tại huyện Bảo Yên, tỉnh Lào Cai. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 2.3.2. Nuôi cấy, phân lập và xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E.coli ở trâu tại huyện Bảo Yên, tỉnh Lào Cai. 2.3.3. Xác định đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn E.coli đã phân lập được. 2.3.4. Xác định số lượng vi khuẩn E.coli trong phân trâu. 2.3.5. Xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E.coli phân lập được. 2.3.6. Kiểm tra độc lực vi khuẩn E.coli phân lập được ở trâu tại huyện Bảo Yên, tỉnh Lào Cai. 2.3.7. Kiểm tra khả năng mẫn cảm của các chủng E.coli phân lập được với một số loại kháng sinh. 2.3.8. Xác định một số phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy ở trâu. 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ Sử dụng phƣơng pháp nghiên cứu dịch tễ mô tả, dịch tễ học thống kê, dịch tễ học phân tích, cụ thể nhƣ sau: - Lập biểu mẫu điều tra. - Điều tra theo phƣơng pháp thống kê ngẫu nhiên, điều tra 6 xã trong huyện Bảo Yên, tỉnh Lào Cai. - Trực tiếp điều tra qua chẩn đoán lâm sàng. - Phỏng vấn chủ hộ chăn nuôi về những thông tin cần thiết. - Phƣơng pháp điều tra trâu bị tiêu chảy theo đàn và theo cá thể. - Phƣơng pháp điều tra trâu bị tiêu chảy theo quy mô đàn nuôi: từ 1 – 3 trâu, từ 3 – 5 trâu và trên 5 trâu. - Điều tra trâu bị tiêu chảy theo các mùa Xuân, Hè, Thu, Đông. 2.4.2. Phương pháp lấy mẫu Mẫu phân: Dùng tăm bông vô trùng lấy phân trực tiếp từ trực tràng hoặc lấy 3 – 5g phân ngay sau khi trâu thải ra rồi đựng trong túi nilon vô trùng, giữ trong thùng bảo ôn và mang nhanh về phòng thí nghiệm. Trên mỗi mẫu đều ghi đầy đủ các thông tin liên quan đến trâu đƣợc lấy mẫu (địa điểm, mùa vụ, tuổi, trạng thái phân, quy mô đàn). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 2.4.3. Phương pháp phân lập và giám định vi khuẩn Sơ đồ phân lập vi khuẩn E.coli (Theo Carter G. R, 1995 [61]) 2.4.4. Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn Sử dụng phƣơng pháp Kock, mẫu phân đƣợc pha loãng ở nồng độ b, cấy 0,2ml vào thạch đặc rồi đếm số khuẩn lạc (CFU) bằng máy đếm (trích theo Nguyễn Bá Hiên, 2001 [18]). Số lƣợng vi khuẩn (X) trong 1gr phân đƣợc tính theo công thức: X = 5.a.b Trong đó: a: là số lƣợng CFU trung bình trên một đĩa petri b: là nồng độ pha loãng mẫu hệ số 5 vì cấy 0,2ml Môi trƣờng thạch MacConkey, thạch XLD Giám định vi khuẩn E.coli Đếm số khuẩn lạc Thạch máu Phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính Phát hiện các yếu tố gây bệnh Xác định serotype kháng nguyên O Thử kháng sinh đồ Mẫu phân, bệnh phẩm từ trâu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 2.4.5. Phương pháp xác định đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn E.coli , xác định số lƣợng và giám định đặc tính sinh vật hoá học củ E.coli theo Quinn.P.J và cộng sự (1994) [90]: Các phản ứng sinh vật hóa học dùng để xác định phân biệt vi khuẩn E.coli nhƣ: - Phản ứng sinh Indol - Phản ứng lên men sinh hơi đƣờng - Phản ứng sinh H2S - Khả năng di động 2.4.6. Xác định serotype kháng nguyên O vi khuẩn E.coli bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính Sau khi kiểm tra các đặc tính sinh vật hóa học của các chủng E.coli phân lập đƣợc, chúng tôi tiến hành xác định serotype bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính. ẩn E.coli poly O, H bằ . Vì kháng nguyên O của vi khuẩn E.coli có rất nhiều serotype bởi vậy ngƣời ta thƣờng sản xuất các nhóm kháng huyết thanh O, mỗi nhóm gồm một số serotype, đồng thời cùng đƣợc sản xuất các kháng huyết thanh đơn giá. Muốn xác định serotype vi khuẩn E.coli phải tiến hành xác định nhóm với kháng huyết thanh nhóm, sau đó mới xác định serotype với kháng huyết thanh đơn giá thuộc nhóm kháng huyết thanh đa giá đã ngƣng kết. * Cách tiến hành Trên một phiến kính sạch, nhỏ hai giọt nƣớc muối sinh lý ở 2 đầu. Dùng que cấy vô trùng lấy một khuẩn lạc E.coli cần xác định serotype mọc trên thạch máu, rồi hòa tan vào hai giọt nƣớc muối sinh lý ở hai đầu của phiến kính. Dùng que cấy vô trùng lấy kháng huyết thanh đa giá nhóm, rồi trộn đều vào một bên huyễn dịch vi khuẩn. Còn huyễn dịch vi khuẩn bên kia không trộn huyết thanh đa giá nhóm (đối chứng âm). Để yên từ 1 – 2 phút ở nhiệt độ phòng rồi đọc kết quả phản ứng: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 - Phản ứng dƣơng tính: khi trong giọt huyễn dịch kháng huyết thanh và vi khuẩn có những hạt ngƣng kết, mức độ ngƣng kết đƣợc đánh giá từ + đến ++++. - Phản ứng âm tính: phần huyễn dịch kháng huyết thanh và vi khuẩn vẫn đục đều, không có những hạt ngƣng kết xuất hiện và giống nhƣ bên đối chứng âm. Chọn những khuẩn lạc có ngƣng kết với kháng huyết thanh đa giá nhóm, tiến hành làm ngƣng kết với từng kháng huyết thanh đơn giá thuộc hóm nhƣ đã tiến hành với nhóm đa giá. Nếu một vi khuẩn ngƣng kết chéo với nhiều nhóm, hoặc nhiều kháng thể đơn giá thì phải pha loãng kháng huyết thanh thành các độ pha loãng khác nhau theo cấp số 2 (1/2,1/4, 1/8,…..1/64), rồi làm phản ứng với từng độ pha loãng. Serotype nào ngƣng kết ở hiệu giá pha loãng kháng huyết thanh cao nhất đó là serotype của vi khuẩn. 2.4.7. Kiểm tra độc lực của vi khuẩn E.coli được phân lập trên chuột bạch Để xác định độc lực của vi khuẩn E.coli gây bệnh trên trâu, có thể thực hiện bằng phƣơng pháp tiêm truyền qua động vật thí nghiệm là chuột bạch khỏe mạnh và vô trùng. Các bƣớc tiến hành nhƣ sau: Bƣớc 1: Vi khuẩn E.coli thuần từ môi trƣờng giữ giống đƣợc cấy chuyển vào môi trƣờng