Luận văn Nhân dòng gen Prion (PrP) từ giống bò Hanwoo (Bos Taurus Coreanae) của Hàn Quốc

ệnh của prion. Ngoài ra ngƣời ta còn tìm cách nghiên cứu trên protein của chúng để có thể tìm ra phƣơng thức nhằm xác định bệnh sớm nhất để tránh sự lây lan trên diện rộng có thể xảy ra. Cùng với các nghiên cứu về prion đã và đang đƣợc triển khai trên thế giới, tại phòng thí nghiệm công nghệ di truyền thuộc khoa công nghệ di truyền đại học Sungkyunkwan, Hàn Quốc, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu gen prion của bò Hanwoo (Hàn Quốc). Trong phạm vi đề tài này, nhƣ là bƣớc đầu trong nghiên cứu của chúng tôi về prion, đề tài tiến hành nhân dòng và giải mã trình tự của đoạn gen prion (mã hoá protein prion) nhằm chuẩn bị nguyên liệu cho các nghiên cứu sâu hơn về sau. 1.2. Mục tiêu Tiến hành nhân dòng và giải trình tự gen prion giải mã protein prion ở giống bò Hanwoo (Hàn Quốc). 1.3. Yêu cầu Thiết kế mồi phát hiện gen prion và thực hiện phản ứng PCR Chuyển gen prion vào véc tơ pGEM-T easy, biến nạp véc tơ tái tổ hợp vào vi khuẩn E. coli. Nhân dòng vi khuẩn, thu nhận vector tái tổ hợp và giải trình tự gen 2 CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Prion Prion - đƣợc viết tắt từ thuật ngữ proteinaceous infectious particle (hạt lây nhiễm có bản chất protein) là một tác nhân gây bệnh truyền nhiễm đặc biệt, đƣợc cấu thành từ protein. Bệnh do prion còn đƣợc gọi là các bệnh não dạng xốp truyền nhiễm (Transmissible Spongiform Encephalopathies: TSE) là các bệnh gây thái hóa thần kinh ảnh hƣởng trên cả ngƣời và động vật. Một số bệnh đƣợc liệt kê ở Bảng A.1(Prusiner, 1998). Prion đã đƣợc nghiên cứu cách đây gần một thế kỷ. Vào năm 1930, các nhà khoa học đã nhận thấy tỷ lệ mắc bệnh CJD (Creutzfeldt- Jakob) rất cao ở một số gia đình. Năm 1954 trong khi nghiên cứu bệnh run ngứa trên cừu ở Ireland, Bjorn Sigurdsson đã đƣa ra khái niệm nhiễm vi rút chậm. Sở dĩ nó đƣợc gọi là vi rút chậm vì sau khi lây nhiễm cho vật chủ, các triệu chứng bệnh không biểu hiện nhƣ: không sốt, không có dấu hiệu ung thƣ bạch cầu, không có đáp ứng miễn dịch dịch thể. Ngoài ra khả năng chịu nhiệt và các tác nhân hoá học khác cho thấy rằng prion có bản chất khác bản chất của vi rút. Vào năm 1982, căn cứ vào các nghiên cứu trƣớc đó, Prusiner đã cho rằng có sự tham gia của một loại đại phân tử trong quá trình lây nhiễm và nó có bản chất protein. Trong cùng nghiên cứu đƣợc đăng trên tạp chí Science vào năm 1982, Prusiner đã đặt tên tác nhân này là prion để phân biệt với các tác nhân lây nhiễm từ vi rút và thể vi rút (Prusiner, 1982). Khảo sát trên mRNA của gen prion cho thấy không có sự khác biệt trong trình tự base của dạng bình thƣờng và các mô bị bệnh run ngứa. Điều này cho thấy cấu trúc gen không phải là yếu tố quyết định tính lây nhiễm của prion (Chesebro và ctv, 1985). Gen prion mã hoá protein prion (PrP). Ở động vật có vú, protein prion bình thƣờng (PrPc) là một loại protein màng của tế bào thần kinh và tế bào đệm của não bộ và tuỷ sống, ngoài ra chúng còn xuất hiện trên một vài loại mô ngoại vi và bạch cầu. PrPc vẫn còn một số đặc tính cần đƣợc nghiên cứu thêm (Kang và ctv, 2004). PrPc có thể chuyển sang dạng PrPsc gây bệnh. PrPc đóng vai trò chính trong cách sinh bệnh và truyền lây bệnh, nhƣng dạng đột biến PrPsc lại là thành phần chính của các hạt prion bất thƣờng (Prusiner, 1991). Mặc dù PrPc và PrPsc có cùng trình tự acid amin, chúng 3 có cấu trúc bậc hai khác nhau. Chìa khoá chính để hiểu rõ cơ chế sinh bệnh của prion là ta phải hiểu rõ sự thay đổi cấu trúc bậc hai từ dạng bình thƣờng PrPc (glycoprotein bề mặt tế bào) sang dạng đồng phân gây bệnh PrPsc (Hình B.1.A). Khi khảo sát protein trên các đối tƣợng bị bệnh, ngoại trừ PrPsc đến thời điểm hiện tại, không có một tác nhân đặc hiệu nào khác đƣợc cho là nguyên nhân gây nên các bệnh viêm não dạng xốp. Nên các nhà khoa học khẳng định PrPc là nguyên nhân gây nên bệnh viêm não dạng xốp (Diedrich và ctv, 1993). PrPc có cấu trúc xoắn anpha (khoảng 40%) và một phần nhỏ dạng bê ta, trong khi đó PrPsc gây bệnh lại có ít cấu trúc xoắn alpha (30%) nhiều cấu trúc dạng phiến (khoảng 45%)(Pan và ctv, 1993; Pergami và ctv 1996). Sự khác biệt trong cấu trúc bậc hai làm tăng tính mẫn cảm với proteinase K (PK), và sự khác biệt trong tính hoà tan (Corsaro và ctv, 2002). 2.2. Bệnh não dạng xốp ở bò (BSE) và các bệnh khác có nguyên nhân do prion 2.2.1. Bệnh não dạng xốp ở bò Bệnh não dạng xốp ở bò là một trong những bệnh đáng chú ý nhất trong các loại bệnh do prion gây ra. Sở dĩ bệnh đƣợc gọi là bệnh não dạng xốp vì khi xét nghiệm mô học ngƣời ta thấy có các không bào trong chất xám của não trông giống nhƣ san hô. Bệnh đƣợc gọi là bệnh truyền nhiễm vì chúng có khả năng lây lan trong loài và giữa các loài với nhau (trích Nguyễn Ngọc Tuân, 2002). Sau khi lây nhiễm cho bò, thời gian ủ bệnh trung bình khoảng 5 năm. Đó cũng là lý do bệnh chỉ đƣợc phát hiện sau khi đã trở thành một đại dịch. Ví dụ nhƣ trong trƣờng hợp của Anh, BSE đã lây nhiễm 160.000 đại gia súc và bò sữa trong suốt thập niên 1980 cho đến khi chúng đƣợc quan tâm (Anderson và ctv, 1996). Một vài nghiên cứu đã cho thấy rằng BSE trở thành một đại dịch lớn và lây lan mạnh, nguyên nhân là do các nhà chăn nuôi sử dụng trực tiếp bột thịt xƣơng (MBM) vào khẩu phần ăn của bò sữa (Nathanson và ctv, 1997; Wilesmith và ctv, 1991). Bột thịt xƣơng đƣợc chế biến từ phủ tạng của cừu, bò, heo và gà, phó sản của lò mổ gia súc đƣợc xem nhƣ thức ăn bổ sung giàu đạm. Trong quá trình chế biến MBM đƣợc xử lý ở nhiệt độ thấp, kết quả là các tác nhân gây bệnh không đƣợc phá huỷ hoàn toàn. Thật ra prion có bản chất là protein nên rất khó tiêu diệt bằng các tác nhân vật lý và hoá học. Prion kháng rất 4 mạnh với nhiệt độ, formol, tia cực tím, phần lớn các dung môi nhƣ các chất kiềm, chất tẩy, muối đậm đặc. Prion có khả năng kháng bức xạ gấp 10 lần vi rút, bị biến tính ở 121 o C trong một giờ hoặc 240oC trong 1 phút (trích Nguyễn Ngọc Tuân, 2002). Vì nguyên nhân đó, để phòng tránh nguy cơ của prion, MBM đã bị cấm sử dụng làm thức ăn bổ sung trong chăn nuôi và các nƣớc có gia súc bị lây nhiễm prion đều chọn giải pháp thiêu hủy thú nghi bệnh. Đối với các nƣớc khác, việc cấm nhập khẩu thịt từ các nƣớc có dịch là giải pháp tối ƣu. Sau đợt đại dịch đầu tiên ở Anh Quốc vào năm 1986, BSE đã lan rộng khắp Châu Âu vào năm 2000. Sau đó, đại dịch lan rộng ra các quốc gia khác nhƣ Nhật Bản (2001), Israel (2002), Canada (2003), và tại Hoa Kỳ (2003, chỉ tìm thấy ở bò nhập từ Canada, nên OIE xếp hạng Hoa Kỳ là quốc gia chƣa bị BSE). Ghi nhận đến tháng 2 năm 2005 đã có 189.000 trƣờng hợp lây nhiễm tại 23 quốc gia (không bao gồm Hoa Kỳ). Đến thời điểm cuối năm 2005 vẫn chƣa có trƣờng hợp BSE nào đƣợc ghi nhận ở Hàn Quốc (Tae-Yung Kim và ctv, 2005), tuy nhiên vì khả năng lây nhiễm và nguy hại cho cộng đồng nên BSE vẫn là một nguy cơ đáng đƣợc quan tâm. 2.2.2 Các bệnh khác có nguyên nhân do prion BSE không chỉ là mối nguy cho bò mà còn có tiềm năng gây nguy hiểm cho ngƣời. Ngƣời ta tin rằng có mối liên quan đến BSE, bệnh vCJD (Creutzfeldt-Jakob biến thể) đƣợc phát hiện đầu tiên vào tháng 3 năm 1996 tại Anh Quốc. Khác với CJD thể bình thƣờng, vCJD biến thể lây nhiễm trên các bệnh nhân trẻ (trung bình 29 so với 65 tuổi), thời gian ủ bệnh cũng lâu hơn (14 tháng so với 4 tháng rƣỡi trong trƣờng hợp CJD). Khi quan sát những điểm tƣơng đồng trong các tác nhân gây bệnh vCJD và BSE và sự tƣơng đồng trong cách lây truyền của các tác nhân gây bệnh có thể giúp ta đƣa ra kết luận rằng vCJD và BSE có cùng tác nhân gây bệnh (WHO, 2002). Trong thực tế và thực nghiệm, ngƣời ta quan sát đƣợc prion còn có khả năng gây bệnh trên chuột nhắt, chuột cống, chồn, mèo, cừu, nai, dê và một vài loài linh trƣởng khác (Bảng A.1). 5 2.3. Sự nhân dòng Khoá luận này là bƣớc đầu trong quá trình nghiên cứu của nhóm nghiên cứu tại Hàn Quốc với mục tiêu thực hiện nhân dòng và giải mã đoạn gen của prion trên giống bò Hanwoo (Bos taurus coreanae) của Hàn Quốc. Gen prion đƣợc khuếch đại từ bộ gen (gDNA) của bò Hàn Quốc bởi kỹ thuật PCR nhờ vào 2 đoạn mồi: mồi xuôi và mồi ngƣợc (Hình B.2). Sản phẩm khuếch đại có 651 cặp base (bp) mã hoá 217 acid amin. Sau đó, đoạn gen đƣợc khuếch đại này đƣợc chuyển vào véc tơ pGEM-T easy. Véc tơ chứa đoạn gen mong muốn đƣợc chuyển vào vi khuẩn E. coli. Sản phẩm PrP tái tổ hợp này đƣợc dùng để giải trình tự và là vật liệu cho các nghiên cứu sau này. 2.3.1. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reacton) Kỹ thuật PCR đƣợc sử dụng để khuếch đại một đoạn DNA đã đƣợc biết trƣớc trình tự. Phản ứng PCR phụ thuộc vào khả năng tách đôi của mạch đơn DNA và bắt cặp bổ sung trong điều kiện thí nghiệm đƣợc kiểm soát (in vitro). Nhân tố thứ hai ảnh hƣởng đến phản ứng PCR là đoạn mồi (primer), đoạn oligonucleotide có độ dài khoảng 18 - 20 base. Hai đoạn mồi này bắt cặp bổ sung với đoạn DNA cần khuếch đại đã đƣợc biến tính. Nhiệt độ ủ bắt cặp từ 50 – 60oC. Đoạn mồi sau khi bắt cặp với DNA mẫu đƣợc tiếp tục kéo dài nhờ vào các deoxynucleotide (dNTPs) và DNA polymerase chịu nhiệt có trong hỗn hợp phản ứng. Enzyme này đƣợc gọi là Taq polymerase, enzyme này vẫn có khả năng giữ hoạt tính ở 95oC trong quá trình duỗi DNA và 72oC trong quá trình kéo dài chuỗi. Khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp đƣợc nâng lên 95oC để tách đoạn DNA mạch đôi mới. Sau đó nhiệt độ lại đƣợc hạ thấp xuống và bắt đầu một chu kỳ mới vì các đoạn mồi vẫn còn trong hỗn hợp. Các chu kỳ đƣợc lặp lại sẽ nhanh chóng khuếch đại đoạn gen mong muốn. Ở mỗi chu kỳ, số lƣợng DNA đƣợc tăng gấp đôi. Vì thế trong một thời gian ngắn chỉ khoảng hơn 20 chu kỳ, đoạn DNA mong muốn đƣợc tăng lên hàng triệu lần trong khi đoạn DNA gốc vẫn không đƣợc nhân lên. (Sandy Primrose và ctv, 2004) 6 2.3.2. Kỹ thuật điện di Kỹ thuật điện di không chỉ đƣợc sử dụng trong quá trình phân tích mà còn đƣợc sử dụng cho quá trình tinh sạch DNA. Kỹ thuật điện di thƣờng đƣợc tiến hành trên 2 loại thạch là agarose và polyacrylamide. Agarose thích hợp phân tách DNA có độ dài từ vài trăm base đến 20.000 base. Polyacrylamide thƣờng sử dụng cho các đoạn có kích thƣớc nhỏ hơn. Cơ chế của quá trình dựa trên sự khác biệt về trọng khối phân tử của DNA. Dƣới tác dụng của điện trƣờng, DNA tích điện âm sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng và xuyên qua các lỗ nhỏ trong thạch. Các phân tử có khối lƣợng nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn và ngƣợc lại. Thạch agarose có cấu trúc mạng phức tạp bao gồm các đại phân tử có kích thƣớc lỗ phụ thuộc vào nồng độ agarose đƣợc sử dụng. Kỹ thuật điện di là kỹ thuật cho phép xác định kích thƣớc đoạn DNA. DNA sẽ đƣợc xuyên qua chất nền đƣợc gọi là gel trong một điện trƣờng. DNA tích điện âm cho nên khi điện di mẫu đƣợc cho vào những giếng gần cực điện âm và DNA sẽ di chuyển về phía cực dƣơng. Sau quá trình điện di trên thạch, các đoạn DNA đƣợc phân tách theo khối lƣợng của chúng. Sự di chuyển tỷ lệ nghịch với kích thƣớc phân tử, DNA có khối lƣợng nhỏ di chuyển nhanh và ngƣợc lại. Các DNA này có thể đƣợc quan sát bằng tia UV sau khi nhuộm bằng các tác nhân nhuộm màu nhƣ EtBr. 2.3.3. Véc tơ plasmid Plasmid là phân tử DNA nằm ngoài nhiễm sắc thể có kích thƣớc biến thiên từ 1 Kb đến hơn 200 Kb. Các plasmid hầu hết là mạch đôi, dạng vòng và có thể tách ra từ vi khuẩn ở dạng siêu xoắn. Vì khả năng có thể nhân đôi với số lƣợng lớn và độc lập với tế bào chủ nên plasmid là vật liệu quan trọng trong công nghệ di truyền. Plasmid đƣợc phát triển từ thập kỷ 1970, đầu thập kỷ các tác nhân chọn lọc nhƣ kanr, ampr, hay terr đƣợc chuyển vào plasmid. Năm 1973, Cohen và cộng sự lần đầu tiên sử dụng plasmid nhƣ là một véc tơ cho quá trình nhân dòng - pSC101. Plasmid đầu tiên mang đầy đủ đặc tính cần thiết cho một véc tơ nhân dòng là plasmid pBR313. Từ năm 1983 đến nay, plasmid đã đƣợc phát triển rất nhiều đặc tính mới: mang các origin và các promoter có nguồn gốc từ thể thực khuẩn, các tác nhân chọn lọc mới, véc tơ plasmid biểu hiện (Brown, 2005). 7 Plasmid có các đặc điểm nhƣ sau : Plasmid có thể tìm thấy ở nhiều loài vi khuẩn, hầu hết các plasmid chỉ có khả năng lây nhiễm trong một số ít vật chủ. Là một DNA nằm ngoài nhiễm sắc thể (NST), có vật chất di truyền ổn định và nhân đôi độc lập với NST tế bào vật chủ. Có rất nhiều cơ chế để ổn định số lƣợng trong tế bào vật chủ. Phụ thuộc vào enzyme và protein tổng hợp từ tế bào chủ trong quá trình sao mã và dịch mã. Thƣờng chứa các enzyme cần thiết cho tế bào chủ. Đặc tính này rất cần thiết cho quá trình chọn lọc plasmid trong công nghệ di truyền nhƣ kháng sinh, phân hủy các hợp chất hữu cơ phức tạp, các enzyme cắt hạn chế và biến đổi. 2.3.4. Sự kết buộc (ligation) Tất cả các tế bào sống đều có khả năng sản sinh DNA ligase, nhƣng enzyme sử dụng trong công nghệ di truyền thƣờng đƣợc tinh sạch từ vi khuẩn E. coli đã bị nhiễm bởi thể thực khuẩn T4. Trong tế bào, enzyme này đó một vai trò rất quan trọng trong quá trình sửa chữa các lỗi trên mạch đôi DNA. Trong thực nghiệm, DNA ligase không chỉ có khả năng sửa chữa các lỗi trên mạch đôi mà còn có khả năng nối các phân tử DNA lại với nhau hoặc hai đầu của cùng một phân tử. T4 DNA ligase là một ligase phổ biến có nguồn gốc từ thể thực khuẩn T4. Nó có khả năng kết buộc mạch đôi của DNA hoặc RNA. Enzyme này có hoạt tính trên cả đầu dính và đầu bằng. Ngoài ra T4 DNA ligase còn có thể sửa chữa, thêm vào những base còn trống trên mạch đôi của DNA, RNA. Quá trình này đòi hỏi phải có ATP. 2.3.5. Biến nạp ở vi khuẩn E. coli Biến nạp vào vi khuẩn E. coli là một bƣớc cần thiết trong bất kỳ thí nghiệm nhân dòng nào, ngƣời ta luôn tìm cách nâng cao khả năng biến nạp của chúng. Mục tiêu là đƣa plasmid vào tế bào chủ nhằm nhân nhanh số lƣợng phục vụ cho nghiên cứu. Nguyên nhân của việc sử dụng E. coli là do chúng có cấu trúc di truyền đơn giản, hơn nữa chúng là đối tƣợng nghiên cứu đƣợc hiểu rõ nhất về sinh hóa cũng nhƣ các thông tin di truyền. Các nghiên cứu đã cho thấy rằng tế bào E. coli và plasmid DNA có khả 8 năng biến nạp cao nhất ở môi trƣờng có ion calci và nhiệt độ thấp (0 – 5oC), và bƣớc sốc nhiệt (37 – 45oC) cũng đóng một vai trò quan trọng. Một vài yếu tố khác nhƣng các ion kim loại ngoài canci cũng có vai trò trong quá trình biến nạp. Trạng thái khả nạp tự nhiên xuất hiện ở một vài loài vi khuẩn khi mà nồng độ chất dinh dƣỡng và hàm lƣợng oxy trong môi trƣờng giảm xuống thấp. Thực tế khi nghiên cứu biến nạp phải tiến hành xử lý tế bào để chúng ở trạng thái khả nạp, có khả năng hấp thu DNA. Để có đƣợc tế bào khả nạp ngƣời ta thƣờng xử lý tế bào bằng các phƣơng pháp vật lý và hóa học. Trong phƣơng pháp hóa học, các tế bào vi khuẩn bình thƣờng sẽ đƣợc xử lý bằng các hóa chất và DNA có thể xâm nhập vào các lỗ trên màng tế bào. Hoá chất quan trọng nhất trong phƣơng pháp hoá học là CaCl2. Quá trình biến nạp sử dụng tế bào khả nạp đƣợc chia thành hai bƣớc chính : Xử lý với CaCl2: biến tế bào E. coli bình thƣờng thành tế bào khả nạp. Sốc nhiệt: tạo sự mất cân bằng nhiệt bên trong và bên ngoài màng tế bào khiến DNA có thể dễ dàng xâm nhập vào tế bào. 2.3.6. Chọn lọc vi khuẩn đã đƣợc biến nạp Vì môi trƣờng nuôi cấy có chứa các tác nhân kháng sinh nên chỉ có những khuẩn lạc có sự hiện diện của vec tơ mới có gen tổng hợp kháng sinh và tồn tại trên môi trƣờng kháng sinh. Tuy nhiên, các véc tơ này có thể mang gen mong muốn hoặc tự đóng vòng. Để nhận biết đƣợc, chúng ta cần sử dụng thêm một phƣơng pháp nhận biết khác nhƣ : - PCR: sau khi tách plasmid của những khuẩn lạc tồn tại đƣợc trên môi trƣờng có chứa kháng sinh, thực hiện phản ứng PCR với các primer của gen chèn. Sau đó điện di để kiểm tra kết quả. - Xác định thể biến nạp có mang plasmid tái tổ hợp bằng phƣơng pháp lai khuẩn lạc. - Sử dụng enzyme cắt plasmid để xác định sự hiện diện của gen chèn. - Sử dụng phƣơng pháp α-complementation. Sự hoạt động của enzyme -galactosidase dễ dàng nhận biết trong môi trƣờng dinh dƣỡng có 5-bromo-4-chloro- 3-indolyl- -D-galactoside (Xgal). Hợp chất này không màu nhƣng khi bị cắt sẽ có màu 9 xanh. Trên môi trƣờng đặc, những khuẩn lạc có -galactosidase hoạt động sẽ có màu xanh trong khi những khuẩn lạc không có -galactosidase có màu trắng. Vì Xgal không có khả năng hoạt hoá -galactosidase, isopropyl- -D-thiogalactoside (IPTG) đƣợc cho vào môi trƣờng. -galactosidase đƣợc tổng hợp bởi gene lacZ. Với các véc tơ có đoạn chèn, gene lacZ sẽ bị cắt và không có khả năng tổng hợp -galactosidase nên có màu trắng. Các véc tơ tự đóng vòng hoặc nối véc tơ – véc tơ gene lacZ hoạt động làm khuẩn lạc có màu xanh (Lodisd và ctv, 2000) . 2.3.7. Giải trình tự Có 2 phƣơng pháp chính đƣợc sử dụng để giải trình tự DNA. 2.3.7.1 . Phƣơng pháp Sanger và Coulson Yêu cầu mạch đơn DNA và phân tử DNA đƣợc giải mã thƣờng đƣợc nhân dòng từ véc tơ M13. Nguyên tắc của phản ứng là dideoxynucleotide (ddNTP) đƣợc cho vào để nối dài mạch DNA, ddNTP có thể gắn vào mạch nhƣng không có khả năng kéo dài mạch do không có đƣờng ở đầu 3’. Các nhóm ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP lần lƣợt đƣợc phản ứng và có thể dễ dàng đọc trình tự bằng máy chụp phóng xạ 2.3.7.2 . Phƣơng pháp Maxam – Gilbert (Phân giải DNA) Để thực hiện phƣơng pháp Maxam – Gilbert đòi hỏi phải có DNA mạch đôi, do đó véc tơ M13 không cần phải sử dụng. Nguyên tắc của phƣơng pháp là cắt đoạn DNA có sử dụng các hoá chất để đánh dấu. 2.3.7.3 . Giải trình tự bằng hệ thống tự động Nguyên tắc chung của máy giải trình tự gene tự động dựa trên cơ sở phƣơng pháp Sanger và Coulson. Máy đọc trình tự cả trên hai mạch đơn, do vậy có thể phát hiện và giảm các nhầm lẫn do kỹ thuật. Giải trình tự theo phƣơng pháp tự động sử dụng các chất huỳnh quang để đánh dấu DNA, và đƣợc đọc bằng các đầu dò của máy dựa vào độ dài bƣớc sóng khác nhau. 10 CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 1 năm 2006 đến tháng 6 năm 2006 tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Di Truyền, khoa Công Nghệ Di Truyền trƣờng Đại học Sungkyunkwan, Suwon, Hàn Quốc. 3.2. Vật liệu Gen prion đƣợc sử dụng có nguồn gốc từ giống bò Hanwoo, đƣợc cung cấp bởi viện Nông Nghiệp, thuộc Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn Hàn Quốc. Quá trình ly trích và tinh sạch bộ gen của bò đƣợc thực hiện bởi anh Kim Yong Hwan, phòng thí nghiệm Công Nghệ Di Truyền, khoa Công Nghệ Di Truyền trƣờng Đại học Sungkyunkwan. 3.3. Dụng cụ và hoá chất 3.3.1 Dụng cụ Micropipette Máy luân nhiệt Máy điện di ngang Máy đọc kết quả điện di bằng tia UV Máy ly tâm thƣờng và ly tâm lạnh Nồi hấp cách thủy 16 oC và 42 oC Tủ mát (4oC), tủ âm (-20oC) và âm sâu (-80oC) Nồi hấp Tủ sấy Lò vi sóng Cân điện tử Máy đo pH Buồng cấy vi khuẩn Máy vortex Máy khuấy từ Máy ủ và máy ủ lắc 3.3.2 Hóa chất 11 agarose type VII ampicillin D-(+)-glucose EDTA ethanol ethidium Bromide glacial acetic acid glucose glycerol IPTG isopropanol methanol màng nylon Mg2SO4 NaOH potassium acetate sodium acetate sodium chloride SDS tryptone X-gal 3.3.3. Các dung dịch EtBr: 10 mg/ml in H2O giữ trong môi trƣờng tránh ánh sáng, 4ºC TE : 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0 Môi trƣờng LB: 170 mM NaCl; 0,5% (w/v) dịch chiết nấm nem và 1% (w/v) peptone, pH 7,5 TAE: 50X TAE (Tris-Acetate-EDTA); 242 g Tris base; 57,1 ml acetic acid và 100 ml EDTA 0,,5 M Thêm nƣớc cất 2 lần sao cho dung dịch vừa đủ 1 lít và pH = 8,5. 3.4. Mồi PCR Mồi PCR đƣợc sử dụng để khuếch đại đoạn gen prion là đoạn oligonucleotide đƣợc thiết kế dựa theo trình tự đã đƣợc nghiên cứu và ấn bản trên Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học quốc gia Hoa Kỳ (NCBI), Ngân hàng gen NM_181015. Trình tự đoạn mồi đƣợc trình bày ở Hình B.2. Mồi đƣợc tổng hợp bởi công ty COSMO và kiểm tra bằng chƣơng trình DNAstart. 3.5. Khuếch đại gen prion từ bộ gen của bò Hàn Quốc bằng kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR đƣợc sử dụng để khuếch đại đoạn gen prion bằng cách sử dụng đoạn mồi đặc hiệu. Hỗn hợp phản ứng bao gồm 10 μl chứa 10 pM mồi xuôi và mồi 12 ngƣợc; 100 ng gDNA; 0,4 mM dNTPs; 10X dung dịch đệm PCR, 5 đơn vị Super Taq DNA polymerase (Super-Bio, Seoul, Hàn Quốc); 25 mM Mg2SO4 Quá trình chuẩn hoá phản ứng PCR đƣợc thực hiện bằng gradient PCR với nhiệt độ bắt cặp từ 55 - 60oC. Phản ứng khuếch đại bao gồm biến tính ở 95oC trong 3 phút; theo sau đó là 30 chu kỳ gồm biến tính 94oC trong 45 giây, ủ bắt cặp ở 58oC trong 30 giây, và kéo dài ở 72oC trong 30 giây; và cuối cùng là một chu kỳ kéo duỗi ở 72oC trong 3 phút. 3.6. Kỹ thuật điện di trên thạch agarose phân tách gen prion 3.6.1. Kiểm tra sản phẩm PCR Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên thạch agarose 0.8%. Dung dịch mẫu bao gồm 5 μl DNA xét nghiệm, 1 μl dung dịch đệm 6X, và thang chuẩn 1 Kb (GeneRulerTM, Fermentas, Co.) đƣợc sử dụng để xác định độ dài của đoạn gen đƣợc khuếch đại. Điều kiện của phản ứng điện di là 100V trong 30 phút. Gel điện di sau đó đƣợc nhuộm với ethidium bromide (EtBr) và đặt trên máy lắc trong 30 phút. Sản phẩm sau khi nhuộm đƣợc quan sát bằng đèn UV. 3.6.2. Thạch tinh sạch DNA Để làm thạch tinh sạch DNA, thạch agarose 0,8% đƣợc cho thêm 2,5 μl EtBr trong quá trình làm nguội. Sau khi cho DNA đã đƣợc trộn với dung dịch đệm 6X và thang chuẩn cho vào giếng, tiến hành điện di ở 80V trong 10 phút sau đó tăng lên 120V trong 25 phút. 3.7. Tách chiết và tinh sạch DNA DNA đƣợc tách bằng kỹ thuật điện di. Dƣới đèn UV ta có thể nhận biết đƣợc phần DNA mong muốn, DNA này sau đó đƣợc cắt ra khỏi gel sao cho lấy đƣợc hết lƣợng DNA tuy nhiên dính càng ít gel càng tốt. Sau đó, đoạn gel đƣợc tách rửa sử dụng bộ Kit QUAquick Gel Extraction (Qiagene) theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất và đƣợc trình bày ở qui trình C.I. 13 Để kiểm tra kết quả sau quá trình tách DNA, 2 μl sản phẩm đƣợc trộn với 3 μl 1X dung dịch đệm TAE và 1 μl dung dịch đệm 6X, điện di trong thạch agarose 0,8%, dùng thang chuẩn 1 Kb. 3.8. Sự kết buộc DNA đƣợc buộc vào véc tơ pGEM-T easy (Promega, Madison, WI, U.S.A.) bằng enzyme ligase T4 (Promega). Véc tơ pGEM-T easy đƣợc trình bày ở Hình B.3. Hỗn hợp chứa 1 μl véc tơ pGEM-T easy, 4 μl đoạn DNA cần chèn vào, 5 μl buffer 2X, 1 μl ligase (T4). Phản ứng xảy ra ở nhiệt độ 16oC trong 1 giờ hoặc 4oC qua đêm. Sau quá trình kết buộc, 2 μl sản phẩm đƣợc kiểm tra bằng điện di trong thạch agarose 0,8%, phần còn lại đƣợc dùng để chuyển vào vi khuẩn E. coli DH5α. 3.9. Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E. coli Plasmid tái tổ hợp đƣợc chuyển vào tế bào E. coli khả biến DH5α để tiến hành nhân dòng. E. coli sử dụng cho quá trình biến nạp là chủng E. coli khả nạp DH5α. Véc tơ pGEM-T easy đã đƣợc gắn đoạn gen prion đƣợc chuyển vào DH5α. Để nâng cao hiệu suất của quá trình biến nạp 5 μl plasmid đƣợc trộn chung với 100 μl E. coli và đƣợc tiến hành biến nạp trong CaCl2 (Sambrook, Russell et al. 2002). Hỗn hợp đƣợc lắc nhẹ và đặt vào nƣớc đá trong 30 phút. Sau đó, huyền phù đƣợc sốc nhiệt trong bồn nƣớc ở 42oC trong 90 giây. Cuối cùng huyễn dịch đƣợc đặt lại trong nƣớc đá khoảng 2 phút để sốc lạnh. Sau đó 1ml môi trƣờng LB đƣợc cho vào ống chứa sản phẩm và nuôi cấy trong máy ủ lắc ở 37oC trong 90 phút. Dung dịch nuôi cấy sau đó đƣợc ly tâm 12000 rpm trong 1 phút. Bỏ phần nổi và thêm 100 μl nƣớc tinh khiết vào ống eppendorf. Sau đó vortex để hoà tan tủa với nƣớc cất hai lần, dung dịch này sau đó đƣợc dàn lên đĩa LB-Amp+. Để có thể chọn đƣợc véc tơ tái tổ hợp, cho thêm vào mỗi đĩa LB 20 μl X-gal và 34 μl IPTG. Các đĩa này đƣợc ủ ở 37oC trong một đêm... 14 3.10. Chuẩn bị plasmid Chọn các khuẩn lạc có màu trắng (khuẩn lạc có chứa plasmid tái tổ hợp) và tiếp tục nuôi cấy trong môi trƣờng LB lỏng (5 ml LB và 5 μl Amp+) ở 37oC trong 12 giờ bằng máy ủ lắc. Sau quá trình nuôi cấy, 700 μl sản phẩm đƣợc trộn với 300 μl glycerol trữ âm ở -80oC để phục vụ cho các thí nghiệm sau. Phần còn lại đƣợc dùng vào việc chuẩn bị plasmid. Phƣơng pháp tách chiết sử dụng theo Kit tinh sạch plasmid (LaboPassTM) đƣợc trình bày rõ hơn ở qui trình C.II. 3.11. Giải trình tự Trƣớc khi mẫu đƣợc gởi đến công ty Macrogen để giải trình tự, DNA tinh khiết đƣợc cắt bởi EcoR I để kiểm tra plasmid có chứa đúng gen mong muốn hay không. Việc xác định trình tự DNA đƣợc thực hiện bởi công ty Macrogen, sử dụng phƣơng pháp tự động bằng máy giải mã trình tự gen. 15 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 . KẾT QUẢ 4.1.1. Khuếch đại gen prion bằng kỹ thuật PCR Để khuếch đại đƣợc gen prion từ bộ gen DNA của bò Hanwoo, các đoạn mồi đƣợc thiết kế đặc hiệu dựa trên trình tự gen prion (GeneBank số NM_181015). Kết quả gradient PCR cho thấy phổ của nhiệt độ ủ bắt cặp của mồi rất rộng, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng nhiệt độ bắt cặp ở 58oC (Hình 4.1). Hình 4.1: Gradient PCR. Băng M: Thang chuẩn DNA 1Kb , 1: Sản phẩm PCR của gen prion 650 bp ở 55 oC, 2: Sản phẩm PCR của gen pr