Luận văn Ứng dụng kỹ thuật phân tử lai huỳnh quang (fish) nhằm xác định nhanh một số loài tảo độc hại biển Việt Nam

10]. Một số công bố sau đó cũng cho thấy phương pháp FISH có khả năng áp dụng tốt trong việc phân loại các loài đặc hiệu ngay cả trong mẫu nuôi cấy và mẫu ngoài tự nhiên [10, 59]. Cùng thời gian này, Miller và Scholin đã ứng dụng FISH với việc sử dụng đầu dò huỳnh quang đặc hiệu rARN để phân loại chi Pseudo- 15 nitzschia. Tám đầu dò phân tử đặc hiệu (auD1, puD1, muD1, muD2, heD2-2, frD1, deD1, và amD1) được thiết kế và sử dụng để phân loại một cách dễ dàng tám loài khác nhau, đó là: P. australis, P. pungens, P. multiseries, P. heimii, P. fraudulenta, P. delicatisima, P. pseudodelicatisima và P. americana. Kết quả cũng cho thấy tính tiện dụng, chuẩn xác và tiết kiệm thời gian của phương pháp phân loại bằng các đầu dò huỳnh quang hơn nhiều so với các phương pháp truyền thống [50, 51]. Ở một nghiên cứu khác, kỹ thuật FISH cũng được ứng dụng thử nghiệm để nhận dạng 10 chủng tảo độc thuộc một số loài Pseudo-nitzschia được thu thập ở nhiều vùng khác nhau trên thế giới (Nhật Bản, Mĩ và Canada) với trình tự đích là ARN. Kết quả cho thấy, đầu dò có tín hiệu rất mạnh đối với các chủng Pseudo-nitzschia multiseries và P. pungens, thu thập từ Mĩ và Canada. Phép lai phân tử cũng cho thấy tín hiệu huỳnh quang giảm nhẹ khi tế bào nuôi cấy ở giai đoạn muộn chứng tỏ lượng ARN đã giảm trong tế bào. Việc định lượng tế bào Pseudo-nitzschia bằng sử dụng kết hợp kỹ thuật FISH cũng trở nên dễ dàng và nhanh chóng hơn [59]. Khả năng ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ đối với các mẫu Pseudo-nitzschia đã được cố định bằng hóa chất bảo quản cũng đã được thử nghiệm. Các mẫu vi tảo cố đã được cố định bằng êtanol cũng đã có phản ứng dương tính đối với thí nghiệm lai. Tuy nhiên, độ nhạy của tín hiệu huỳnh quang thu được tùy thuộc vào thời gian cố định và một số điều kiện bảo quản của mẫu trước khi thí nghiệm. Đối với các mẫu sau khi lai với đầu dò huỳnh quang được lưu giữ ở 4oC sẽ duy trì được sự phát quang trong thời gian dưới 1 tuần [49]. Trong những nghiên cứu khác, các các tiểu đơn vị của ribosome cũng đã được lấy làm các trình tự đích cho việc quan trắc Pseudo- nitzschia thu thập từ vịnh Chinhae Bay (Hàn Quốc). Kỹ thuật FISH với các đầu dò đặc hiệu đã được sử dụng gồm muD1, puD1, auD1, heD2-2, frD1, deD1, amD1. Nghiên cứu này cũng cho thấy, một số đầu dò cho tín hiệu huỳnh quang yếu hơn các đầu dò khác. Điều này được giải thích là liên quan đến trạng thái sinh lí của tế bào [20]. Sau này, việc sử dụng các đầu dò phân tử phát huỳnh quang trong kỹ thuật FISH để nhận dạng và phát hiện các loài tảo độc hại ngày càng phổ biến hơn. Đầu 16 dò được thiết kế dựa trên trình tự đích thuộc vùng D1- D2 của tiểu đơn vị lớn LSU rADN của các loài vi tảo đã được thử nghiệm trong phép lai FISH đặc hiệu trên tế bào nguyên vẹn. Các đầu dò ADN đặc hiệu cho 6 loài Alexandrium: A. tamarense, A. catenella, A. affine, A. fraterculus, A. insuetum và A. pseudogonyaulax đã cho kết quả tốt và không biểu hiện ở các phản ứng lai với các loài Alexandrium khác [43]. Cũng nghiên cứu về một số loài thuộc chi Alexandrium, một số nhà khoa học khác cũng đã thành công trong việc phát triển phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ với các đầu dò được thiết lập từ các trình tự đích thuộc rARN có trong tế bào A. tamarense và A. catenella với cả mẫu nuôi cấy và mẫu tảo thu ngoài tự nhiên [63]. Một số thử nghiệm lai tại chỗ trên Heterosigma akashiwo (Raphidophyceae) với các đầu dò thiết kế các trình tự ARN và ADN đích đã cho thấy: đối với đầu dò rARN, kết quả là các ARN trong tế bào chất được lai với đầu dò và làm cho toàn bộ tế bào bắt màu xanh; còn với đầu dò ADN, đầu dò lai với ADN trong nhân nên chỉ có nhân tế bào là bắt màu xanh [21]. Khai thác trình tự vùng D1-D2 ADN mã hóa cho tiểu phần lớn của ribosome (LSU), một số nhà khoa học đã thiết kế các đầu dò và phát triển phép lai huỳnh quang tại chỗ với tín hiệu FITC nhằm định loại nhanh cho nhiều loài tảo độc hại trong nhiều thủy vực [22]. Bảng 1.2. Trình tự đầu dò cho một số loài Alexandrium [22]. Tên loài Trình tự đầu dò Số hiệu trên Genbank A.tamiyavanichii A. catenella A. fraterculus A. insuetum A. tamarense A. pseudogonyaulax GTACTTAGACCACACCATA GCAT TTGACAATTGCTCCT GCTCTTGTTCATCAACATC GCACTTGATGATCGATTGC GCATTTGGCGATCAATTCT GCACTTGATGGTTGTTTGC AB088316 AB088280 AB088290 AB088298 AB088279 AB088302 Trong nhiều nghiên cứu về sau này, một số cải tiến của kỹ thuật FISH đã được đưa ra nhằm hoàn thiện và tối ưu hơn cho từng mục đích hay đối tượng quan tâm 17 khác nhau [17]. Với những ưu thế về độ chính xác, độ nhạy và tiết kiệm thời gian, kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ vẫn được xem là một công cụ rất hữu hiệu cho nhiều nghiên cứu sinh học. 1.2. Tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH tại Việt Nam Cho đến nay, tại Việt Nam, kỹ thuật FISH chủ yếu được nghiên cứu ứng dụng trong lĩnh vực y học. Một số nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán trước sinh bằng kỹ thuật FISH đã được tiến hành. Các nghiên cứu này được dựa trên các trình tự ADN đích thuộc các nhiễm sắc thể nhằm phát hiện một cách chính xác các bất thường trên các nhiễm sắc thể (NST) tương ứng với các bệnh di truyền được quan tâm [4]. Trong một số nghiên cứu khác, ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang được dùng để chẩn đoán trước sinh hội chứng Đao, hội chứng Tớc-nơ cũng đã cho kết quả thành công. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy, việc sử dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ đã cho kết quả rất chính xác khi so sánh với phương pháp phân tích nhiễm sắc thể của tế bào ối [1, 2]. Bên cạnh đó, các nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH trong việc phát hiện các lệch bội nhiễm sắc thể số 13, 18, 21, X, Y từ tế bào dịch ối bằng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ cũng đã thành công. Trên cơ sở phân tích các mẫu thu từ các phụ nữ mang thai giai đoạn 17 - 25 tuần có nguy cơ cao bị dị tật, kỹ thuật FISH đã giúp phát hiện 1 trường hợp mắc hội chứng Patau (trisomy 13), 1 trường hợp mắc hội chứng Đao (trisomy 21), 1 trường hợp bất thường cánh dài của NST 16. Kết quả cũng cho thấy 100% mẫu kết quả FISH phù hợp với kết quả phân tích về NST liên quan đến các NST số 13, 18, 21, X, Y. Quy trình chuẩn nhằm chẩn đoán trước sinh bằng chọc ối làm xét nghiệm FISH an toàn cũng đã được hoàn thiện [6]. Sử dụng kỹ thuật FISH nhằm phát hiện sự khuếch đại gen NMYC trên các bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đã được tiến hành tại các bệnh viện Nhi trung ương và cho kết quả tốt đẹp. Một số biến đổi di truyền trong u nguyên bào thần kinh có ý nghĩa quan trọng trong việc lựa chọn phác đồ điều trị và tiên lượng bệnh, trong đó sự khuếch đại gen NMYC được xem là yếu tố quan trọng nhất đã được tìm thấy. Kết quả thành công này có ý nghĩa quan trọng hỗ trợ các bác 18 sỹ lâm sàng trong việc phân nhóm bệnh nhân và lựa chọn phác đồ điều trị thích hợp [5]. Các nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ FISH đối với các loài sinh vật thủy sinh tại Việt Nam gần như rất ít. Trong một nghiên cứu gần đây tại Viện nghiên cứu hải sản về ứng dụng kỹ thuật FISH cho việc nhận diện nhanh 2 loài tảo giáp độc hại A. tamarense và A. catenella, một số thử nghiệm đã được tiến hành. Các trình tự đích thuộc vùng D1- D2 trên nhiễm sắc thể mã hóa cho tiều phần lớn LSU của ribosome của loài được lấy làm cơ sở thiết kế đầu dò. Tín hiệu huỳnh quang FITC được thiết kế gắn với đầu dò đặc hiệu. Kết quả nghiên cứu đã cho thấy các trùng lặp, giống nhau về đặc điểm hình thái của các loài tảo giáp từng gây khó khăn trong quan trắc tảo độc hại đã phần nào được giải quyết nhờ kỹ thuật FISH. Đây cũng là một trong những cơ sở ban đầu cho việc ứng dụng kỹ thuật này trong quan trắc cảnh báo về sự bùng phát các đối tượng thủy sinh gây thủy triều đỏ tại Việt Nam [3]. 1.3. Các bước cơ bản của quy trình lai huỳnh quang tại chỗ - FISH Sự ra đời của kỹ thuật FISH dựa trên các cải tiến của kỹ thuật ISH đã ra đời và là sự kết hợp chính xác của phép lai một đoạn oligonucleotit (đầu dò) có gắn tín hiệu huỳnh quang với một trình tự ADN đích đặc trưng. Bằng quan sát trực quan từ kính hiển vi huỳnh quang, các phân tử huỳnh quang phát sáng với những màu sinh động cho phép hiển thị các đoạn ADN, nhiễm sắc thể hay tế bào đích. Nhờ đó mà các nhà nghiên cứu có thể nhận dạng, liệt kê và định vị các tế bào sinh vật trong mẫu môi trường tự nhiên hay trong các mô bệnh phẩm... Quy trình này bao gồm các bước cơ bản sau: - Bước 1: Chuẩn bị mẫu và đầu dò có trình tự nucleotit bổ sung đặc hiệu với trình tự đặc hiệu cần nhận biết. - Bước 2: Cố định mẫu nghiên cứu. - Bước 3: Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu nằm trong tế bào của mẫu. 19 - Bước 4: Rửa mẫu để loại bỏ các đầu dò không được lai (đầu dò tự do). - Bước 5: Hiển thị, quan sát và phân tích kết quả bằng kính hiển vi huỳnh quang. Hình 1.2. Các bước cơ bản của kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ FISH 1.4. Đặc điểm sinh thái của một số loài vi tảo biển độc hại nghiên cứu Alexandrium affine được xác định là một trong số 31 loài tảo độc hại thuộc phân chi Alexandrium nom. nud của chi Alexandrium (chi tảo Hai roi) trên thế giới. Chúng được xác định có phân bố phổ biến ở vùng biển Việt Nam. Các kết quả nghiên cứu trước đây cho thấy rằng chúng phát triển mạnh vào thời gian từ tháng 12 đến tháng 2 hàng năm và bắt gặp nhiều trong các thủy vực Thừa Thiên Huế. Loài này cũng đã bắt gặp phát triển mạnh tại các vịnh Văn Phong, Cam Ranh (Khánh Hòa) vào mùa khô thuộc các tháng 3 và 4. Một kết quả phân tích độc tố của loài này 20 đã cho thấy rằng, thành phần độc tố của chúng bao gồm các loại NeoSTX, STX, GTX1-4 với nồng độ <2,28µmol/tế bào. Đây là các chất độc được sản sinh ra khi chúng bùng phát mạnh với mật độ cao trong môi trường thủy sinh. Các chất độc này làm chết nhiều đối tượng thủy sinh [45]. Trong các nghiên cứu vi tảo biển độc hại, A. affine là một trong những đối tượng được quan tâm vì chúng cũng là một trong những yếu tố chỉ thị môi trường quan trọng [7]. Một loài tảo khác là Alexandrium pseudogonyaulax đã được xác định là một trong 15 loài tảo độc hại thuộc chi Alexandrium (phân chi Gessnerrium) có ở biển Việt Nam. A. pseudogonyaulax được coi là loài tảo gây hại trong nhiều thủy vực nước mặn và lợ ven biển Việt Nam. Các kết quả điều tra nghiên cứu trước đây đã cho thấy rằng: A. pseudogonyaulax có phân bố rộng và rất dễ bùng phát và đã từng bùng phát nhiều đợt, làm thiệt hại nghiêm trọng tới nhiều thủy vực nuôi trồng thủy sản tại các vùng ven biển miền trung và Nha Trang [7]. Tuy không phải là nhóm vi tảo hai roi sản sinh độc tố, nhưng do khả năng dễ tạo mật độ cao trong các thủy vực nên A. pseudogonyaulax được đánh giá là một trong những loài tiềm tàng gây hại cao, là nguyên nhân gây thiệt hại cho nhiều đầm nuôi thủy sản trong thời gian qua. Chính vì vậy đây cũng là một trong những đối tượng chỉ thị môi trường quan trọng trong nhiều thủy vực ven biển [45]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi vì vậy đã tiến hành thử nghiệm ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang FISH nhằm nhận diện nhanh được 2 loài tảo độc hại là Alexandrium affine và A. pseudogonyaulax thu thập ở Việt Nam. 21 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm thu mẫu và đối tượng nghiên cứu Hai mẫu tảo độc hại được thu tại vùng biển Cát Bà – Hải Phòng, gồm có: + Mẫu A. sp6 (Alexandrium affine) được thu vào ngày 20/7/2010 tại khu vực cửa biển thuộc Bến Bèo (Cát Bà, Hải Phòng) với điều kiện môi trường như sau: độ mặn nước biển: 27‰, pH 7,72. + Mẫu A. sp7 (Alexandrium pseudogonyaulax) được thu vào ngày 27/4/2011 tại khu vực vịnh cảng Cát Bà (Hải Phòng) với các điều kiện môi trường nước biển như sau: độ mặn nước biển: 29‰, pH 7,44. 2.2. Phương pháp thu và lưu giữ mẫu Mẫu vi tảo nghiên cứu được thu theo hướng dẫn của Hallegraeff và đồng nghiệp [32] và Anderson [15]. Mẫu được thu bằng lưới thu thực vật phù du có đường kính 20cm, kích thước mắt lưới 20µm, thu theo phương thẳng đứng. Mẫu sau đó được bảo quản trong lọ và giữ trong điều kiện nhiệt độ từ 4 – 15oC. Mẫu này sau đó được chuyển về phòng thí nghiệm để phân lập. Đối với các mẫu vi tảo thu ngoài tự nhiên để thử nghiệm đầu dò, 2 phương pháp bảo quản, xử lý mẫu được tiến hành: - Xử lý mẫu thu được từ lưới kéo như trên và sau đó mẫu này được sử dụng cho các thí nghiệm lai như trình bày ở phần sau. - Các mẫu thu từ ngoài tự nhiên không kịp tiến hành thí nghiệm lai với đầu dò ngay trong ngày thì được cố định bằng etanol 70% hoặc formandehyt 10%. Các mẫu này sau đó được đưa vào thí nghiệm lai như mô tả ở phần sau (Shoko và cộng sự [60]). 22 2.2.1 Phân lập các chủng vi tảo (theo phương pháp thu tế bào đơn lẻ bằng micropipet của Richmon [57] và Andersen [13]: Mẫu tảo sau khi chuyển về phòng thí nghiệm, được phân lập bằng pipet mao quản (pipet thủy tinh kéo dài). Sau đó, tế bào được rửa sạch bằng cách hút chuyển từng tế bào cần phân lập vào môi trường nuôi tảo vài lần có cùng độ mặn, cho tới khi mẫu sạch hoàn toàn. Tiếp theo, mỗi tế bào được chuyển sang một giếng nuôi đã chứa sẵn môi trường đã được pha sẵn với độ mặn tương ứng ngoài tự nhiên. Môi trường nuôi được sử dụng là môi trường IMK (Daigo IMK – mua từ hãng Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.) dành cho nhóm tảo giáp (Alexandrium). 2.2.2 Phương pháp nuôi giữ các chủng vi tảo thu được (theo Shoko và cộng sự [60], Nguyễn Văn Nguyên và cộng sự [3]): Các mẫu tảo sau khi thu thập được nuôi giữ như sau: + Bước 1 - Nuôi trong giếng: Mẫu sau khi phân lập được rửa sạch, mỗi tế bào (hoặc chuỗi tế bào) được chuyển vào một giếng. Giếng nuôi có đường kính 16mm, thể tích khoảng 5ml (loại 24 giếng/khay của hãng Corning - Mỹ). Sau 3 đến 5 ngày nuôi và theo dõi, nếu tảo đã thuần và phát triển tốt, tiến hành cấy truyền sang lọ nuôi bằng nhựa (flask). Đối với các mẫu chưa thuần, phân lập được lặp lại cho tới khi thuần hoàn toàn. + Bước 2 - Nhân nuôi sinh khối trong lọ nhựa hoặc bình tam giác: Mẫu tảo phát triển tốt được tiếp tục nuôi tạo sinh khối trong lọ nhựa hoặc bình tam giác 50ml làm nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo. Mẫu tảo độc được nuôi trong các điều kiện nhân tạo được kiểm soát về các thông số môi trường, bao gồm: Cường độ chiếu sáng: 2.500 lux, bằng hệ thống ánh sáng trắng (đèn neon); Chế độ chiếu sáng: 13h sáng liên tục/11h tối liên tục, được điều khiển bởi đồng hồ đóng ngắt tự động; Nhiệt độ nuôi: ổn định ở 24oC liên tục trong buồng có điều hòa nhiệt độ; Môi trường nuôi: IMK (hãng Nihon Pharmaceutical Co., Ltd., Nhật Bản). 23 2.3. Phương pháp phân loại hình thái Việc phân loại các mẫu tảo giáp được thực hiện chủ yếu dựa vào công thức tấm vỏ tế bào đã được nhuộm Calco - fluor, quan sát dưới kính hiển vi quang học và có sự hỗ trợ của chuyên gia phân loại hình thái. Các tài liệu chính để phân loại là: Balech (1995), Abe (1967a,b), Larsen và cộng sự (2004) [8, 9, 16, 45]. 2.4. Phương pháp kiểm tra phân loại bằng ADN và thiết kế đầu dò 2.4.1. Phương pháp chuẩn bị ADN khuôn (Sebastián và cộng sự (2001) [62]): Chuẩn bị ADN khuôn: Một tế bào được phân lập từ mẫu nuôi bằng pipet pasteur thủy tinh kéo dài. Tế bào được rửa 3 lần bằng nước biển lọc có độ mặn giảm dần từ 27‰ đến 20‰ và 15‰. Cuối cùng, tế bào được rửa 3 lần bằng nước cất trước khi đưa vào trong ống PCR chứa sẵn 10µl nước khử ion đã được tiệt trùng. Tế bào được giữ ở -20oC và sau đó được đưa vào sốc nhiệt để phá vỡ tế bào, chuẩn bị cho phản ứng PCR. Phương pháp sốc nhiệt : Các ống mẫu chứa tế bào được chuyển đột ngột qua lại 3 lần giữa hai trạng thái lạnh (-20oC ) và nóng (90oC) trong thời gian mỗi 20 giây ở mỗi điều kiện, nhằm làm vỡ tế bào và dung giải ADN ra ngoài. Các mẫu được lắc rung (votex) và ly tâm trở lại (5000vòng/phút) chuẩn bị cho phản ứng PCR. 2.4.2. Phương pháp Singel cell PCR (Sebastián và cộng sự (2001) [62], Shoko và cộng sự (2005) [60]) Phản ứng PCR được tiến hành để nhân vùng D1 – D2 của gen mã hóa tiểu đơn vị lớn 28s ARN ribosome. Tuy nhiên, do lượng ADN khuôn ban đầu ít (từ 1 tế bào) nên quy trình PCR được thực hiện thông qua 2 phản ứng theo sơ đồ hình 2.1). Sản phẩm phản ứng PCR 2 (vùng ADN mục tiêu) Pr28- PrS1R PrD2 PrD1 SSU ITS1 5S ITS2 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 SSU ITS1 5S ITS2 D1 D2 D3 D4 D5 ADN mã hóa Ribosom Cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR1 Sản phẩm phản ứng PCR1 PCR 1 PCR 2 D1 D2 Cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR2 Hình 2.1. Sơ đồ phản ứng PCR nhân vùng D1-D2 của rADN 24 Phản ứng PCR lần 1: Nhân đoạn ADN dài khoảng 5.000 bp, mã hóa cho rARN của Alexandrium từ vùng tiểu phần nhỏ SSU tới vùng D6 của tiểu phần lớn LSU. Cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR lần 1: S1R (5’-TACCTGGTTGATCCTGCCAG- 3’) và 28-1483R (5’-GCTACTACCACCAAGATCTGC-3’). Chu trình nhiệt: 950C 5phút, (950C 1phút, 550C 1phút, 720C 5phút 30 giây) x 35 chu kỳ, 720C 10 phút . Thể tích phản ứng PCR là 25µl có chứa các thành phần như sau: - MgCl2: 20mM (1x đệm Takara Ex Taq) - dNTPs: 200µM (Takara Ex) - Taq: 1U (Takara Ex Taq) - Mồi: 1µM mỗi mồi (TOS-Nhật Bản) - ADN khuôn: 5µl Phản ứng PCR lần 2: Nhân đoạn D1-D2 của tiểu phần LSU, với độ dài khoảng 700bp. Thể tích phản ứng PCR lần 2 là 25µl có thành phần tương tự như trên, sử dụng ADN khuôn là 5µl sản phẩm PCR lần 1. Cặp mồi sử dụng là: D1R (5’-ACCCGCTGAATTTAAGCATA-3’) và D2C (5’- CCTTGGTCCGTTTCAAGA-3’). Chu trình nhiệt: 95oC 5phút, (95oC 30 giây, 55oC 30 giây, 72oC 1phút 50 giây) x 35 chu kỳ, 72oC 10 phút. Các phản ứng PCR được thực hiện trên máy PCR Thermal Perkin Elmer 9600. Kiểm tra sản phẩm PCR: Sản phẩm PCR lần 2 được điện di trên gel agarose 1,5%, nhuộm trong ethidium bromide, soi trên đèn UV có bước sóng 365nm để kiểm tra và đánh giá kết quả. 2.4.3. Phương pháp kiểm tra phân loại bằng ADN Giải trình tự ADN vùng D1-D2: Sản phẩm thu được của PCR lần 2 được tinh sạch bằng cột tinh sạch của hãng Promega và gửi đi giải trình tự trên máy Applied Biosystems 3130 Series (tại phòng thí nghiệm của Viện vi sinh vật và Công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội). 25 Kiểm tra phân loại bằng ADN: Dựa trên trình tự vùng D1 - D2 thu được, chúng tôi xây dựng cây phát sinh chủng loại theo phương pháp kết nối lân cận (neighbor joining) sử dụng thuật toán Jukes-Cantor với độ lặp lại 1000 lần, sử dụng trình tự số hiệu AF260387 trên ngân hàng gen (genbank) làm loài ngoài nhóm để so sánh. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng trên phần mềm Mega phiên bản 5.03. 2.4.4. Phương pháp thiết kế đầu dò đặc hiệu Dựa trên trình tự ADN thu được, sử dụng công cụ ClustalW, phần mềm BioEdit để sắp xếp, so sánh các trình tự nucleotit thu được với trình tự của những loài gần gũi về mặt phân loại. Trên cơ sở đó, lựa chọn đoạn ADN đặc trưng nhất cho loài để thiết kế đầu dò. Đầu dò được thiết kế và được đặt hàng tại công ty TOS (Nhật Bản) để chế tạo, với yêu cầu gắn thêm chất phát huỳnh quang fluorescein isothiocyanate (FITC) ở đầu 5’ để phục vụ cho việc hiển thị sự hiện diện của trình tự đặc trưng. Trong nghiên cứu này, kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ giữ nguyên vẹn tế bào được áp dụng. Các đầu dò huỳnh quang gắn tín hiệu FITC được thiết kế để gắn đặc hiệu với trình tự đích trên tiểu phần lớn của ribosome của tế bào vi tảo. Với số lượng lớn các ribosome trong mỗi tế bào, kết quả lai tốt sẽ cho lượng lớn các đầu dò có gắn tín hiệu huỳnh quang được gắn lên ribosome trong mỗi tế bào của loài. Dưới sự tác động của chùm sáng 490nm, tín hiệu FITC được kích thích và phát sáng (xanh lam) đặc trưng sẽ làm toàn bộ tế bào phát sáng xanh lam. Do đó tế bào dễ dàng được phát hiện bằng kính hiển vi huỳnh quang. 2.5. Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (dựa theo phương pháp của Shoko và cộng sự (2005) [60])  Mẫu (5000 - 7000 tế bào/ml) được đưa vào ly tâm thu tế bào (3000vòng/phút trong 1 phút ở 4oC).  Cố định tế bào bằng 1ml dung dịch PBS (5x) có chứa paraformandehyde (4%), để mẫu trên đá lạnh trong 5 phút.  Ly tâm mẫu 3000vòng/phút trong 1 phút (4oC).  Loại nước trong mẫu theo 2 bước: 26 - Thêm 1ml dung dịch ethanol 50% vào mẫu, ủ trên đá trong 5 phút. Ly tâm thu tế bào (3.000vòng/phút trong 1 phút, 4oC). - Thêm 1ml dung dịch ethanol 80% vào mẫu, ủ trên đá trong 5 phút. Ly tâm thu tế bào (3.000vòng/phút trong 1 phút, 4oC).  Thêm 500µl dung dịch lai (gồm: Formamide (40%), SSC (5x), mẫu dò có gắn huỳnh quang (50 pmol)).  Lai tế bào ở các thang nhiệt độ khác nhau: 37°C, 40°C, 43°C, 46°C, 49°C, 52°C trong 5 phút.  Sau khi lai, mẫu được rửa 2 lần: - Thêm 1ml SSC (5x) vào mẫu, ủ mẫu ở 50oC trong 5 phút. Ly tâm thu tế bào (3000vòng/phút trong 1 phút, 4oC). - Thêm 1ml SSC (5x) vào mẫu, ủ mẫu ở 50oC trong 5 phút. Ly tâm thu tế bào (3000vòng/phút trong 1 phút, 4oC). Sản phẩm lai huỳnh quang sau đó được quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang (ECLIPSE E800, Nikon, Tokyo, Japan) với kính lọc sắc B-2A, bước sóng kích thích tín hiệu FITC 490 nm, hiển thị và chụp ảnh tế bào bằng camera DS Nikon. Chi tiết thành phần các dung dịch được thể hiện trong phụ lục 1. 27 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân lập và phân loại các chủng vi tảo độc hại bằng hình thái Trên cơ sở các mẫu thu được từ vùng biển Cát Bà, 2 chủng vi tảo độc hại đã được phân lập, nuôi giữ và phân loại sơ bộ dựa trên các đặc điểm về hình thái. Hai loài tảo giáp được xác định sơ bộ là thuộc chi Alexandrium bao gồm: 3.1.1. Loài Alexandrium affine Một số đặc điểm hình thái của tế bào được ghi nhận qua công thức tấm vỏ của loài đặc trưng như sau: Kích thước tế bào khoảng 38 - 45µm, có dạng bất đối xứng. Tấm 1' liên kết trực tiếp với tổ hợp lỗ đỉnh và có một lỗ bụng nhỏ ở vị trí trung tâm trên mép phải tấm 1' nơi tiếp xúc với tấm 4'. Tấm S.a có dạng hình thang và không có phần phụ đi kèm. Một số hình ảnh loài được ghi nhận qua hình 3.1. Hình 3.1. Một số đặc điểm hình thái của A. affine. Hình dạng ngoài của tế bào (A); Tấm 1' với lỗ bụng và tổ hợp lỗ đỉnh (B, C); Tấm S.a hình thang, không có phần phụ (D). 28 So sánh các đặc điểm này cho thấy có sự trùng hợp với các đặc điểm phân loại được mô tả đặc trưng cho loài này trong các nghiên cứu trước đây. Tuy nhiên, đây cũng là những đặc điểm khó nhận biết và dễ nhầm lẫn trong phân tích công thức tấm vỏ của loài. Do đó việc kết luận loài là A. affine chỉ được khẳng định lại một cách chắc chắn từ kết quả phân loại bằng ADN được trình bày ở phần sau của luận văn. 3.1.2. Loài A. pseudogonyaulax Các đặc điểm nhận dạng về hình thái của loài A. pseudogonyaulax được xác định qua các hình ảnh thu được như sau: tế bào hơi dẹt, chiều dài 45 - 47µm. Rãnh ngang vòng theo chiều hướng xuống. Tấm 1’ hình 5 cạnh, không liên kết với lỗ bụng và có 1 lỗ bụng lớn tròn tiếp giáp với mép; ở một vài tế bào, lỗ bụng ở vị trí tiếp giáp của các tấm 1’-4’6” (Hình 3.2). Hình 3.2. Một số đặc điểm hình thái của A. pseudogonyaulax. Hình dạng ngoài của tế bào (A). Lỗ bụng lớn tròn nằm lệch trên tấm 4‘(B,C), tấm Sa nằm cuối rãnh bụng (D). 29 Cũng giống như đối với loài A. affine, kết quả phân loại dựa trên hình thái đối với loài A. pseudogonyaulax không thật sự rõ ràng. Mặc dù các đặc điểm thu được có nhiều tương đồng so với mô tả của Larsen [45]. Do vậy, việc xác định chính xác tên loài được kết hợp với những kết quả so sánh trình tự ADN vùng D1 - D2 của mẫu thu được với các trình tự mẫu trên Genbank sẽ được mô tả ở phần sau của luận văn. 3.2. Ảnh hưởng của độ mặn tới nuôi sinh khối vi tảo tạo nguyên liệu Do trong điều kiện thí nghiệm này đã sử dụng môi trường nuôi dưỡng IMK dành riêng cho tảo giáp (hãng Nihon Pharmaceutical Co., Ltd., Nhật Bản) và đã tham khảo một số điều kiện chiếu sáng tối ưu trong các nghiên cứu trước đây về tảo giáp [7], nên tác giả chỉ tập trung vào tìm hiểu ảnh hưởng của độ mặn lên sự sinh trưởng của tảo trong phòng thí nghiệm, nhằm thu được sinh khối tốt nhất cho các thí nghiệm tiếp theo. Độ mặn được xem là một trong những yếu tố quyết định cho việc sinh trưởng của các loài vi tảo biển. Hai mẫu vi tảo biển độc hại thu được được đưa vào nhân nuôi trong phòng thí nghiệm với các điều kiện đã nêu ở trên. Kết quả thí nghiệm nuôi cấy trong các điều kiện độ mặn khác nhau cho thấy, ảnh hưởng của độ mặn lên sự sinh trưởng của từng loài là khác nhau (Hình 3.3 và 3.4). Trong điều kiện nuôi có độ mặn 30‰ (cường độ chiếu sáng 2500lux, chế độ chiếu sáng 13 giờ sáng: 11 giờ tối) loài A. affine phát triển tốt nhất trong các chế độ nuôi cấy. Kết quả này cũng thống nhất với kết quả nghiên cứu trước đây là độ mặn thích hợp nhất cho sự phát triển của loài này là 20 – 35‰ với chủng tảo thu được ở vùng biển miền trung Việt Nam [7, 45]. Một kết quả nghiên cứu khác của Larsen (2004) đối với loài này với chủng thu được trên vùng biển Autralia cho thấy chúng có ngưỡng chịu độ mặn 30 rộng, từ 4 đến 34‰, trong đó độ mặn thích nghi nhất của chúng được