Luận văn Xác định hàm lượng cholesterol trong trứng và so sánh trình tự vùng điều khiển D-Loop DNA ty thể gà ri, gà ác, gà tre

c cây phát sinh và kết quả cho thấy 3 chủng Naganakidori có nguồn gốc từ gà chọi Shamo. Các kết quả này đã gợi ý rằng 3 mẫu gà cảnh đuôi dài đều có chung nguồn gốc mặc dù đặc điểm hình thái bên ngoài rất khác nhau. Hơn thế 3 chủng gà đuôi dài đầu tiên đã phân ly từ các con gà chọi Okinawa vốn có nguồn gốc địa lý gần với Nam Trung Quốc và Đông Nam Á hơn so với Honshu/Kyushu Nhật Bản. Điều này dẫn đến giả thiết rằng gà đuôi dài Nhật Bản đầu tiên được đưa đến Nhật Bản là gà chọi các vùng lân cận của vùng Nam Trung Quốc hoặc Đông Nam Á. Như vậy có thể thấy trình tự nucleotide của vùng D-loop là một công cụ rất hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng di truyền và sự phân hóa bên trong loài cũng như giữa các quần thể địa lý. 1.5.2 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam Cho đến nay, ở Việt Nam việc sử dụng phương pháp phân loại phân tử trên đối tượng gà mới chỉ bắt đầu. Năm 1999, Kim Thị Phương Oanh và cộng sự [11] đã tiến hành phân tích vị trí nhận biết của một số enzyme giới hạn trên vùng điều khiển D-loop của 3 loài gà Lôi Việt Nam gồm: gà Lôi lam đuôi trắng (L. hatinhensis), Trĩ bạc (L. nycthemera) và gà Lôi hông tía (L. diardi). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 Từ đó xác định bước đầu được sự khác biệt trên vùng điều khiển D-loop của mtDNA của 3 loài gà Lôi. Tuy nhiên, để có những kết luận chính xác về vấn đề này cần phải xác định trình tự vùng điều khiển của 3 dòng gà Lôi nói trên. Năm 2000, Nguyễn Hải Hà và cộng sự [3] đã tạo dòng phân tử đoạn gen điều khiển DNA ty thể của 2 loài gà Lôi đặc hữu Việt Nam trong vector pBluescript KS(-) để chuẩn bị cho việc đọc và so sánh trình tự nucleotide vùng D-loop. Năm 2006, Địch Thị Kim Hương và cộng sự [5] đã xác định được trình tự vùng D-loop gồm 1227 nucleotide của 2 mẫu gà Ác Tiềm và Lương Phượng, đã phát hiện được 22 vị trí khác biệt về nucleotide giữa 2 đại diện trên. Năm 2007, Lê Đức Long và cộng sự [6] đã giải trình tự và so sánh trình tự nucleotide vùng D-loop của 3 đại diện gà Mông có nguồn gốc từ Điện Biên, Hà Giang và Yên Bái được nuôi tại trại gà Nông Lâm Thái Nguyên theo dự án gà sạch. Kết quả nghiên cứu đã xác định trình tự vùng D-loop gồm 1227 nucleotide của 3 mẫu gà nghiên cứu và đã xác định được 10 vị trí khác biệt về nucleotide giữa các đại diện của 3 mẫu gà này. Năm 2008, Bùi Thị Kiều Vân và cộng sự [14] đã giải trình tự và so sánh trình tự nucleotide vùng D-loop của 3 giống gà Ri, gà Mông, gà Sao nuôi tại Thái Nguyên. Kết quả nghiên cứu đã xác định trình tự vùng D-loop gồm 1220 nucleotide của 3 mẫu gà nghiên cứu và đã xác định được 16 vị trí khác biệt về nucleotide giữa các đại diện của 3 mẫu gà này. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.1.1 Nguồn gốc mẫu Các mẫu trứng, máu được lấy từ các giống gà Ri, gà Ác, gà Tre được nuôi tại gia đình ông Nguyễn Văn Vân , thôn Đình Giã , Cao Thượng , Tân Yên, Bắc Giang. 2.1.2 Địa điểm thí nghiệm Các nghiên cứu về cholesterol được tiến hành tại phòng thí nghiệm của Khoa Hóa an toàn vệ sinh thực phẩm- Viện dinh dưỡng Việt Nam. Các thí nghiệm sinh học phân tử tiến hành tại phòng thí nghiệm công nghệ DNA ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.2 Hoá chất và thiết bị 2.2.1 Hóa chất Các hoá chất tinh khiết sử dụng có nguồn gốc từ các nước Anh , Mỹ, Trung Quốc , Thụy Điển, Nga… như Phosphate buffer saline (PBS), protein K (20mg/ml), SDS, Tris HCl, EDTA, NaCl, CH3COONa, phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25:24:1), chloroform: isoamyl alcohol (24:1), agarose 0,8%... 2.2.2 Thiết bị sử dụng Máy li tâm lạnh của hãng Hettich (Đức), tủ sấy của hãng Carbolite (Anh), cân điện tử (Thuỵ Sỹ, Anh), máy Gerhardht, tủ lạnh sâu – 20oC Sanyo (Nhật), lò vi sóng Samsung (Hàn Quốc), máy PCR MJ Reseach, Inc (Mỹ), máy xác định trình tự tự động ABI PRISM® 3100 Genetic Analyser (Applied Biosystems, Mỹ), bể ổn nhiệt (Tempette Junior Tech), hệ thống Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 sắc ký Alliance (hãng Waters, Mỹ), máy hút chân không Speed Vac Sc 110A- Savant (Mỹ), pipetman và một số máy móc thiết bị khác. 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Phƣơng pháp hoá sinh xác định hàm lƣợng cholesterol * Cơ sở của phương pháp: chất béo trong thực phẩm (gồm cả cholesterol) được chiết bằng chloroform. Sau khi thủy phân lipit bằng KOH trong cồn, cholesterol được chiết lại bằng petroleum ether. Dịch chiết được cô cạn bằng máy cất quay chân không, sau đó được hòa tan lại bằng methanol. Cholesterol trong dịch chiết methanol được định lượng trên sắc ký lỏng (HPLC) bằng cách so sánh diện tích (hoặc chiều cao) của pic cholesterol trong mẫu với diện tích (hoặc chiều cao) của pic cholesterol chuẩn (John Wiley and Sons, 2005) [22]. * Xác định hàm lượng cholesterol theo quy trình sau: Lấy ngẫu nhiên trứng ở các giống gà thí nghiệm ở các lứa đẻ khác nhau và ở các con gà mái khác nhau trong cùng một giống. Sau khi lấy được mẫu, ở mỗi mẫu: đập 5 quả trứng vào cốc thủy tinh. Sau đó đồng nhất lòng đỏ và lòng trắng. Tiếp theo là các bước: + Cân 0,5 g mẫu vào ống ly tâm 25 ml. + Thêm 5 ml methanol, vortex 5 phút. + Thêm 10 ml chloroform, vortex 3 phút. + Ly tâm, gạn lấy dịch trong bình gạn 250 ml. + Chiết lại mẫu bằng 5 ml methanol và 10 ml chloroform trong 3 phút. + Gộp dịch chiết vào bình gạn. + Thêm 7 ml KCl 0,88%, lắc nhẹ và để tách lớp. + Lọc lớp chloroform qua phễu chứa Na2SO4 khan vào bình cô quay. + Cô quay đến khô ở 300C. + Thêm 20 ml KOH 0,5M trong ethanol. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 + Đun hồi lưu 30 phút trong cách thủy ở 600C. + Thêm 10ml n- heptane, đun hồi lưu thêm 2-3 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng. + Chuyển toàn bộ dịch chiết sang một bình gạn, thêm 5 ml NaCL bão hòa, 10 ml nước. + Chiết 2 lần cùng với 10 ml petroleum ether. + Gộp dịch chiết và rửa 2 lần với 20 ml nước cất. + Loại nước bằng Na2SO4 khan, cô quay ở 30 0C đến khô. + Hòa tan và định mức 10 ml bằng methanol. + Lọc qua màng lọc 0,45 m và bơm vào sắc kí lỏng. Cột sắc ký LunaC18 với nhiệt độ cột là 300C, tốc độ dòng là 1 ml/ phút, lượng mẫu bơm 10 l. Bộ phận phát hiện (detector) đo độ hấp thụ tia UV ở bước sóng 208 nm của cholesterol chuyển thành tín hiệu ra máy tính đó là các peak, mỗi peak có độ cao và diện tích khác nhau, từ đó tính được hàm lượng cholesterol của mỗi mẫu [22]. Công thức tính hàm lượng cholesterol của mẫu nghiên cứu như sau : X = m D A CA s sm 100  Trong đó: X: Hàm lượng cholesterol (mg/ 100 g) Am: Diện tích pic mẫu As: Diện tích pic chuẩn Cs: Nồng độ chuẩn D: Độ pha loãng m: khối lượng mẫu cân (g) 100: Tính hàm lượng cholesterol trong 100 g mẫu [22]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 Như vậy, để xác định được hàm lượng cholesterol ở các mẫu thí nghiệm thì trước hết ta phải xây dựng đường chuẩn cholesterol ở các nồng độ khác nhau: 2,04 ppm, 20,4 ppm, 204 ppm, 1 mg/ml, 2,04 mg/ml. Để xây dựng được đường chuẩn cholesterol thì ta phải xác định chiều cao và diện tích của các peak cholesterol chuẩn ở các nồng độ khác nhau đó. Kết quả về chiều cao và diện tích của peak cholesterol chuẩn ở các nồng độ khác nhau được thể hiện qua bảng 2.1. Bảng 2.1. Kết quả chiều cao và diện tích peak cholesterol chuẩn ở các nồng độ khác nhau Nồng độ cholesterol (ppm) Thời gian chạy máy (phút) Diện tích Chiều cao 2,04 33,159 19502 543 20,4 33,190 69573 1946 204 33,178 715249 17001 1000 33,054 3309741 91236 2040 33,329 7396448 181428 Từ các kết quả về chiều cao và diện tích của các peak cholesterol chuẩn chúng ta có thể xây dựng đường chuẩn cholesterol theo diện tích hoặc theo chiều cao như sau: 1000000 2000000 3 00 00 4000000 5000000 6000000 7000000 8000000 500 1000 1500 2500 DiÖ n tÝ ch cña pic ch ole ste rol 0 204 204020,4 Nång ®é cholesterol (ppm) Hình 2.1. Đƣờng chuẩn cholesterol dựa theo diện tích các peak chuẩn cholesterol Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 Ch iÒu ca o c ña pic ch ole ste rol 2500204015001000500 200000 180000 160000 140000 120000 100000 80000 60000 40000 20000 0 20420,4 Nång ®é cholesterol (ppm) Hình 2.2. Đƣờng chuẩn cholesterol dựa theo chiều cao các peak chuẩn cholesterol Như vậy, dựa vào đường chuẩn cholesterol chúng ta có thể xác định được lượng cholesterol có trong các mẫu nghiên cứu cần xác định. 2.3.2 Phƣơng pháp sinh học phân tử 2.3.2.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu động vật * Nguyên tắc chung Màng tế bào được phá vỡ bằng các chất tẩy mạnh kết hợp với biện pháp cơ học, DNA trong và ngoài nhân được giải phóng cùng với các protein. Sau đó DNA được tinh sạch nhờ proteinase K và phenol trong hỗn hợp phenol: chloroform: isoamylalcohol với tỷ lệ thích hợp. Cuối cùng DNA được kết tủa bằng cồn tuyệt đối 100% và để lạnh sau đó thu lại bằng ly tâm. * Quy trình tách chiết Một trong các mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết DNA là làm thế nào để giảm tối đa sự phân hủy của chúng. Các phân tử DNA có thể bị phân hủy hay đứt gãy do tác nhân cơ học (nghiền, lắc mạnh) hoặc hóa học (bị thủy phân bởi các enzyme phân giải thoát ra môi trường khi màng tế bào bị phá vỡ). Để đạt hiệu suất và độ tinh sạch nhất thì việc lựa chọn một phương pháp tách chiết có nhiều ưu điểm và phù hợp với đối tượng nghiên cứu là rất quan trọng. Vì mẫu sử dụng trong thí nghiệm là mẫu máu, nên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 chúng tôi đã lựa chọn phương pháp tách chiết DNA tổng số của Sambrook và Russell [30]. Máu đông được làm tan trong bể ổn nhiệt ở 370C trong một giờ. Trong điều kiện về nhiệt độ và thời gian như vậy, plasminogen trong huyết tương sẽ được chuyển sang dạng hoạt động là plasmin, chất này phân hủy các protein như fibrin, fibrinopeptit, prothrombin, nhờ đó mà các tế bào được giải phóng. Sau đó hút máu ra các eppendorf 1,5 ml rồi bổ sung đệm phosphate buffer saline (PBS) và ly tâm. Dung dịch muối này có tác dụng duy trì pH của máu. Các tế bào thu được đem hòa tan trong dung dịch đệm tách có chứa EDTA và SDS. Sự có mặt của SDS làm cho màng tế bào bị phá vỡ và giải phóng DNA ra ngoài môi trường. Thành phần EDTA sẽ liên kết với ion Mg2+, nhờ vậy mà hoạt động của các nulease bị ức chế để bảo vệ DNA khỏi sự phân giải của các nuclease. Ngoài ra, protease K có trong đệm chiết sẽ cắt đứt các liên kết peptid trong phân tử protein làm cho protein bị phân hủy. Hơn nữa pH kiềm của dung dịch đệm chiết làm DNA trở lên ổn định cấu trúc hơn do bản chất tích điện âm của nó, đồng thời làm giảm tương tác tĩnh điện giữa DNA với protein histon. Để loại bỏ protein trong hỗn hợp, mẫu được lắc mạnh với hỗn hợp phenol: chloroform: isoamyl alcohol. Chloroform làm tăng cường hoạt động của phenol trong việc biến tính protein nhưng không làm ảnh hưởng đến cấu trúc của DNA. Đồng thời nó còn tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách pha nước với pha hữu cơ. Isoamyl alcohol có tác dụng làm giảm bọt trong quá trình tách chiết. Sau khi lắc mạnh và đem ly tâm, hỗn hợp được phân làm 3 pha: pha trên cùng là pha nước có chứa DNA, pha giữa là protein bị biến tính và pha cuối cùng là hỗn hợp phenol, choloroform, isoamyl alcohol. Pha nước được hút nhẹ nhàng sang ống mới. Dịch chiết này sau đó được xử lý bằng hỗn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 hợp chloroform: isoamyl alcohol nhằm loại bỏ hoàn toàn phenol có lẫn trong dịch chiết và một lần nữa làm sạch DNA. Bước này có thể lặp lại 1-2 lần. Thu tủa bằng cách bổ sung vào dịch chiết 50l CH3COONa3M, pH=5,2 và 1 ml ethanol 100%. Ethanol có tác dụng hút lớp nước bao quanh phân tử DNA, để lộ ra các gốc phosphate tích điện âm. Khi đó các ion Na+ sẽ kết hợp với các gốc phosphate này khiến cho lực đẫy giữa các chuỗi nucleotide giảm, do đó DNA bị kết tủa. Trong điều kiện -200C trong 15 giờ thì DNA kết tủa gần như hoàn toàn. Rửa tủa bằng ethanol 70%, làm khô tủa trong máy sấy và hòa tan tủa trong nước cất 2 lần. Trong dung dịch này có nhiều RNA, vì thế chúng tôi đã loại bỏ RNA bằng RNAase, ủ ở 370C trong 2- 3 giờ. Quy trình tách chiết DNA tổng số theo Sambrook và Russell [30] có thể được tóm tắt như sau : (1): Ủ máu đông lạnh trong 37oC trong 1 giờ cho máu tan. (2): Hút vào mỗi eppendorf (epp, loại 1,5 ml) 500 l máu. (3): Bổ sung 500 l dung dịch PBS 1X, sau đó vortex và li tâm 6000 vòng/phút trong 15 - 20 phút, 4 0C, đổ dịch và thu cặn. (4): Bổ sung 1ml dịch đệm tách (buffer lysis) và 10 l protease K (20 mg/ml). Mẫu được ủ ở 650C trong 1 giờ, sau đó để ở nhiệt độ phòng. (5): Chia vào mỗi epp 500 l dịch. (6): Bổ sung một lượng tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol (tỷ lệ 25:24:1), vortex kỹ, sau đó ly tâm ở 12000 vòng/ phút, 15 phút, 40C. Hút pha trên cùng sang ống mới. (7): Thêm một thể tích tương đương chloroform: isoamyl alcohol (tỷ lệ 24:1), vortex kỹ, sau đó ly tâm ở 12000 vòng/ phút, 15 phút, 40C. Hút pha trên cùng sang ống mới. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 (8): Bổ sung 1/10 thể tích CH3COONa3M, pH 5,2 và 1ml cồn 100%, ủ qua đêm ở - 20oC. (9): Thu tủa bằng cách li tâm ở 12000 vòng/phút trong 15-20 phút, 4oC. Bổ sung 500 l cồn 70% để rửa vào mỗi epp. (10): Li tâm ở 12000 vòng/phút trong 15 phút, 4oC. Bỏ dịch và thu cặn. (11): Làm khô tủa trong máy sấy và hòa tủa vào 50 l nước khử ion vô trùng, búng nhẹ. Kiểm tra sản phẩm tinh sạch DNA trên gel agarose 0,8%. 2.3.2.2 Kỹ thuật điện di DNA trên gel agarose * Nguyên tắc chung Điện di là kỹ thuật để tách và định lượng axit nucleic với các kích thước và hàm lượng khác nhau. Kỹ thuật này dựa trên một đặc tính cơ bản của axit nucleic là các đại phân tử tích điện âm do có sự có mặt của gốc PO4 3- trên bề mặt. Do đó, khi đặt axit nucleic trong điện trường với cường độ dòng điện và hiệu điện thế thích hợp, chúng sẽ di chuyển dần về phía cực dương. Gel được sử dụng trong kỹ thuật điện di là gel agarose (với các phân tử DNA có kích thước lớn) hoặc polyacryamid (với các phân tử DNA có kích thước nhỏ). Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng gel agarose với nồng độ 0,8% bởi gel agarose với nồng độ này phù hợp với kích thước trung bình của các đoạn DNA cần phân tích (1- 20kb) [2]. * Quy trình kỹ thuật - Chuẩn bị gel agarose: Cân 0,8 gam agarose vào 100 ml dung dịch TAE 1X. Đun trong lò vi sóng đến tan hoàn toàn. Để nguội xuống khoảng 50 – 60oC, đổ dung dịch agarose vào khay điện di có cài sẵn răng lược. Sau 30 phút, khi gel đông cứng thì rút răng lược ra và đặt vào bể điện di có chứa sẵn dung dịch TAE 1X sao cho dung dịch TAE 1X ngập mặt gel từ 1 – 2 mm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 - Tra mẫu và điện di: mẫu DNA với một lượng thích hợp (3 - 8 l) được trộn với 2,5 l đệm màu và được tra vào các giếng nhỏ trên gel. Chạy điện di với dòng điện một chiều có cường độ dòng điện 60 – 80 mA, hiệu điện thế 100-120 V. Quan sát sự di chuyển băng màu bromophenol blue để biết lúc nào cần ngừng điện di. Sau khi kết thúc điện di, lấy bản gel ra khỏi khuôn và ngâm bản gel trong dung dịch EtBr (ethidium bromide) với nồng độ 0,5 l/ml. Sau khi ngâm 10-15 phút, lấy bản gel ra, rửa trong nước sạch và chụp ảnh dưới ánh sáng tử ngoại 254 nm (trên máy Bio-Rad). 2.3.2.3 Nhân vùng điều khiển D- loop bằng kỹ thuật PCR Vào năm 1985, K.Mullis đã phát minh ra phương pháp đơn giản khuếch đại nhanh nhiều bản sao (amplification) của các đoạn DNA mà không qua tạo dòng. Kỹ thuật này được gọi là Polymerase Chain Reaction, viết tắt là PCR, được hiểu là phản ứng polymerase dây chuyền. Kỹ thuật này được ứng dụng nhanh và có ý nghĩa cách mạng đối với sự phát triển của sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền [26]. * Nguyên tắc chung PCR là quá trình khuếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro do sự xúc tác của enzyme DNA taq polymerase. Enzyme này được chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus. Sự khuếch đại này được thực hiện nhờ các chu trình nhiệt lặp lại (có thể đến 35 lần) gồm đun nóng (950C), làm nguội (37- 65 0 C) và ủ lâu ở 720C. Trong dung dịch có chứa 4 loại deoxynucleotide (dNTPs) và các cặp mồi chuyên biệt. Mồi được sử dụng ở đây là các oligonucleotide, mỗi mồi sẽ bắt cặp bổ sung với đầu mạch đơn của DNA khuôn tương ứng, từ đó mạch được tổng hợp kéo dài. * Nguyên liệu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 - DNA khuôn phải được tinh sạch và ít bị đứt gãy , có chứa trình tự đích cần nhân lên . Nồng độ DNA khuôn trong mỗi hỗn hợp phản ứng là 10 - 100 ng/phản ứng. - Mồi: là yếu tố quan trọng trong phản ứng PCR bởi việc điều chỉnh nhiệt độ gắn mồi và nồng độ mồi có ảnh hưởng lớn đến lượng sản phẩm và chất lượng sản phẩm PCR. Nồng độ mồi xuôi và mồi ngược sử dụng trong thí nghiệm này là 10 pmol/l (pM/l). Cặp mồi được sử dụng đó là : + Mồi xuôi H1255: 5’- CATCTTGGCATCTTCACTGCC - 3’. + Mồi ngược L16725: 5’- AGGACTACGGCTTGAAAGC - 3’. H, L là chữ viết tắt cho chuỗi nặng (Heavy) và chuỗi nhẹ (Light), chữ số là vị trí nucleotide trên mtDNA trong trình tự đầy đủ của gà mà đầu 3’ của mồi tiếp hợp vào (Desjadins và Morais, 1990) [17]. Cặp mồi H1255- L16725 được lựa chọn vì đây là cặp mồi “bảo thủ”, nó có thể được dùng cho nhiều loài, giống khác nhau trong bộ gà. - Dung dịch đệm: PCR được thực hiện trong môi trường đệm phù hợp với hoạt động của enzyme và nó có giá trị pH là 7,2. Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng đệm là buffer dream taq. Nó phù hợp với hoạt động của emzyme taq polymerase và trong dung dịch đệm này có chứa Mg2+. Vai trò của ion Mg 2+ là tạo phức với các dNTPs và gắn chúng với enzyme, kích hoạt và tăng cường sự kết hợp giữa mồi và khuôn. Nồng độ Mg2+ quá thấp sẽ làm giảm hoạt tính của enzyme. Tuy nhiên, nếu nồng độ quá cao sẽ ức chế hoạt động của enzyme. Sau khi khảo sát chúng tôi sử dụng nồng độ Mg2+ là 10 mM cho kết quả PCR tốt nhất. - 4 loại dNTPs: nồng độ của 4 loại dNTPs phải bằng nhau và phụ thuộc nhiều vào kích thước của đoạn DNA đích, nồng độ của mồi và MgCl2. Nồng độ các dNTPs lớn hơn 4mM sẽ ức chế phản ứng PCR do ion Mg2+ bị cô lập, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 dễ dẫn đến sự nhân lên của các đoạn không cần thiết. Qua thử nghiệm, chúng tôi thấy, nồng độ của các dNTPs là 1mM là phù hợp. - Taq DNA polymeaza của hãng Fermentas - Nước khử ion vô trùng. Thông thường phản ứng PCR cho một mẫu với tổng thể tích là 25 l, gồm các thành phần sau: Nước 14,8 l Buffer dream taq 2,5 l dNTPs 2,5 l H1255 (mồi xuôi ) 1 l L16725 (mồi ngược) 1 l Taq DNA polymeraza 0,2 l DNA khuôn 3 l Tổng thể tích 25 l PCR là một quá trình lặp lại gồm nhiều chu kỳ (tổng số chu kỳ chúng tôi tiến hành là 35 chu kì), mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn: - Giai đoạn biến tính: DNA khuôn bị biến tính ở nhiệt độ 94-950C trong khoảng một phút để tách phân tử DNA thành hai sợi đơn. Mỗi sợi đơn sẽ trở thành một sợi khuôn cho mồi bám vào. Thời gian biến tính tùy thuộc vào hàm lượng G-C và chiều dài của phân tử DNA. Chúng tôi chọn nhiệt độ biến tính là 94 0C trong một phút. Trước khi bước vào chu kì thứ nhất, nhiệt độ biến tính được đặt ở 940C trong 4 phút để đảm bảo phân tử DNA được biến tính hoàn toàn. - Giai đoạn gắn mồi: ở giai đoạn này, nhiệt độ của phản ứng được hạ xuống trong khoảng 37- 650C để cho mồi kết hợp vào sợi khuôn. Nhiệt độ và thời gian của bước này thay đổi, phụ thuộc vào trình tự mồi. Chúng tôi đã thử Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 chạy phản ứng ở một số giá trị nhiệt độ khác nhau trong khoảng nhiệt độ này và chọn được nhiệt độ gắn mồi là 550C. - Giai đoạn kéo dài mạch: nhiệt độ tăng lên 720C để cho enzyme Taq polymerase hoạt động tốt nhất. Bước này cần 1-5 phút tùy thuộc chiều dài đoạn DNA cần khuếch đại. Tốc độ tổng hợp của phản ứng khoảng 1000 nuleotide/ phút. Trình tự vùng D-loop quan tâm có kích thước khoảng 1,3 kb nên thời gian giai đoạn kéo dài chuỗi là 1 phút 20 giây. Sản phẩm cuối cùng của chu kỳ trước sẽ là khuôn mẫu cho chu kỳ tiếp theo. Sau mỗi chu kỳ, số lượng DNA được tăng lên gấp đôi. Sau một thời gian, lượng DNA được tăng lên theo cấp số nhân nhờ đó mà có đủ lượng DNA phục vụ cho thí nghiệm tiếp theo. Sau khi kết thúc 35 chu kì, chúng tôi đặt nhiệt độ ở 720C trong mười phút để đảm bảo sự tổng hợp được kết thúc hoàn toàn. Sản phẩm PCR được giữ 40C. * Quy trình nhiệt của phản ứng PCR có thể được tóm tắt như sau: Bước 1: 94oC - 4 phút Bước 2: 94oC - 1 phút Bước 3: 55oC - 1 phút Bước 4: 72oC - 1 phút 20 giây Từ bước 2 đến bước 4 lặp lại 34 lần. Bước 5: 72oC - 10 phút. Sản phẩm PCR được giữ ở 4oC. Sau khi phản ứng kết thúc, lấy 8 l sản phẩm PCR điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% để kiểm tra sản phẩm PCR. 2.3.2.4 Tinh sạch sản phẩm PCR Sau khi điện di kiểm tra phản ứng PCR đã thành công, chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR. Để tinh sạch sản phẩm PCR, chúng tôi tiến hành điện di toàn bộ sản phẩm PCR thu được ở mỗi mẫu. Sau đó chúng tôi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 tiến hành thôi gel theo protocol của hãng Promega để thu sản phẩm PCR tinh sạch. Quy trình được tiến hành như sau: - Đổ gel và chạy điện di sản phẩm PCR. - Cân ống eppendorf (epp) loại 1,5 ml. - Cắt băng chứa sản phẩm PCR cho vào epp đã cân. - Cân lại epp có chứa gel (mang sản phẩm PCR để biết được trọng lượng của băng gel ta vừa cắt). - Bổ sung dung dịch mambrane binding (dung dịch 1) với tỷ lệ 1 mg gel: 1 l dung dịch 1. - Ngâm trong nước nóng (nhiệt độ khoảng 50-650C) để gel tan hết. - Chuyển sang cột và để ở nhiệt độ phòng khoảng 1 phút. - Ly tâm 12000 vòng/phút, 4 0 C, trong 1 phút, sau đó loại bỏ dịch phía dưới. - Bổ sung 700 l manbrane wash (dung dịch 2) và ly tâm 12000 vòng/ phút, 4 0C, trong một phút, sau đó cũng loại bỏ dịch phía dưới. - Bổ sung thêm 500 l dung dịch 2 và ly tâm 12000 vòng/phút, 40C, trong 5 phút, sau đó cũng loại bỏ dịch phía dưới. - Ly tâm lại một phút, 12000 vòng/ phút, 40C. - Cho vào máy sấy 5 phút. - Bổ sung thêm khoảng 30-50 l nước cất 2 lần, để ở nhiệt độ phòng trong khoảng một phút. - Ly tâm 12000 vòng/phút, 4 0C, trong một phút. Sau khi đã thôi gel tinh sạch sản phẩm PCR, chúng tôi tiến hành điện di để kiểm tra sản phẩm thôi gel trên gel agarose 0,8%. Nếu điện di xuất hiện băng sáng rõ, tập trung, không bị smear, có kích thước trùng với kích thước đoạn DNA cần nhân trong phản ứng PCR thì sản phẩm thôi gel đủ chất lượng để tiến hành đọc trình tự. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 2.3.2.5 Phƣơng pháp xác định trình tự DNA *Nguyên tắc chung Trình tự vùng D-loop được xác định dựa trên nguyên tắc chung của phương pháp Sanger [2], [10] tạo ra các đoạn oligonucleotide hơn kém nhau một nucleotide, kết thúc bởi các ddNTP được đánh dấu huỳnh quang. Để tạo ra các đoạn kết thúc bằng các loại ddNTP khác nhau, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR sử dụng BigDye Terminaor v3.1 Cycle Sequencing Kit đã có chứa sẵn các hóa chất cần thiết của phản ứng nhân gen