Luận văn Xác định kháng nguyên phản ứng miễn dịch của bệnh nhân ung thư gan

osephosphate isomerase (TIM) ở mẫu ung thƣ cao hơn đáng kể so với bình thƣờng và viêm gan maṇ tính . Phản ứng dƣơng tính với DEAD, eEF2, AIF và PBP là thƣờng xuyên xảy ra ở HCC hơn bất kỳ bệnh ung thƣ khác. Độ nhạy của tất cả kháng nguyên HCC từ 50% đến 85%. Vì vậy, các nhà nghiên cứu kết luận rằng việc phát hiện các tự kháng thể kháng lại các kháng nguyên trên có thể có giá trị trong việc chẩn đoán sớm ung thƣ gan [22]. Năm 2008, Looi và cs đã dùng phƣơng pháp proteomics để xác định các TAA liên quan đến HCC. Nghiên cứu đƣợc tiến hành trên mẫu huyết thanh của 20 bệnh nhân HCC, 30 bệnh nhân viêm gan mạn tính, 30 bệnh nhân xơ gan và huyết thanh của 10 ngƣời bình thƣờng khỏe mạnh và dòng tế bào ung thƣ gan HepG2. Trong số 34 spot protein có phản ứng miễn dịch đƣợc cắt ra khỏi bản gel điện di hai chiều, thủy phân protein bằng trypsin và phân tích LC-MS/MS, các tác giả đã nhận dạng đƣợc 28 protein. 17/28 protein không chỉ phản ứng với kháng thể trong huyết thanh của bệnh nhân HCC mà còn phản ứng với kháng thể trong huyết tƣơng của bệnh nhân tiền ung thƣ. 11/28 protein chỉ phản ứng với kháng thể trong huyết tƣơng của bệnh nhân HCC, nhóm protein này có tiềm năng lớn để trở thành chỉ thị sinh học của ung thƣ gan. Ngoài ra, để tìm hiểu mối liên quan của các protein đã nhận LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng 22 dạng với ung thƣ, tác giả đã tìm kiếm trên Pubmed về cơ sở dữ liệu protein. Theo kết quả tra cứu, 18/28 protein đã đƣợc báo cáo có liên quan đến ung thƣ: 3 protein liên quan ung thƣ vú; 4 protein liên quan HCC (GRP78, HSP70, serotransferrin, Mn-SOD); 11 protein còn lại liên quan đến các loại ung thƣ khác [26]. Gần đây, việc nhận dạng và mô tả đặc điểm của các TAA và dùng làm “TAA mini-array” để chẩn đoán miễn dịch ung thƣ là một hƣớng tiếp cận để phát hiện ung thƣ đang đƣợc quan tâm. Theo hƣớng nghiên cứu này, năm 2010, Zhang và cs đã tiến hành nghiên cứu “Sàng lọc miễn dịch ung thƣ tế bào biểu mô gan thông qua tự kháng thể và kháng nguyên liên quan đến khối u kết hợp với biểu hiện tăng bất thƣờng của AFP”. Nhóm tác giả đã dùng các tự kháng thể trong huyết thanh của một bệnh nhân HCC làm mẫu dò để sàng lọc miễn dịch xác định các TAA có liên quan đến quá trình chuyển dạng ác tính của tế bào gan trong thƣ viện biểu hiện cDNA của dòng tế bào ung thƣ thực nghiệm HepG2. Theo cách này đã xác định đƣợc 2 gene là SUI1 và RA1A. Protein tái tổ hợp của 2 gene này là Sui1 và Ra1A đƣợc biểu hiện, tinh sạch và dùng làm kháng nguyên trong xét nghiệm miễn dịch để xác định sự có mặt của tự kháng thể trong huyết thanh của 77 bệnh nhân HCC, 30 bệnh nhân viêm gan mạn tính, 30 bệnh nhân xơ gan và 82 ngƣời bình thƣờng. Tỷ lệ xuất hiện kháng thể kháng Sui1 và Ra1A trong huyết thanh bệnh nhân HCC lần lƣợt là 11,7% (9/77) và 19,5% (15/77), tỷ lệ này cao hơn đáng kể so với tỷ lệ xuất hiện kháng thể kháng lại 2 protein này trong huyết thanh của bệnh nhân xơ gan (3,3% và 3,3%) và không xuất hiện kháng thể kháng 2 protein này ở huyết tƣơng bệnh nhân viêm gan và ngƣời bình thƣờng. Khi bổ sung 2 protein này vào mini-array gồm 8 TAA (Imp1, p62, Koc, p53, c-myc, cyclin B1, survivin và p16 [40]) đã đƣợc nghiên cứu trƣớc đó thì thấy tỷ lệ xuất hiện tự kháng thể kháng 10 TAA đạt tới 66,2%. Ngoài ra, khi kết hợp sử dụng 10 TAA trên để chẩn đoán ở những ngƣời có AFP biểu hiện bất thƣờng độ nhạy tăng từ 66,2% lên 88,7% [11]. Hiện nay, nhiều nghiên cứu về proteomics miễn dịch ung thƣ đã xác định đƣợc các kháng nguyên liên quan đến khối u. Khi một TAA đƣợc xác định, các nhà nghiên cứu sẽ dùng nhiều phƣơng pháp khác nhau để mô tả một cách toàn diện về LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng 23 TAA, mối liên hệ của TAA với quá trình chuyển dạng tế bào ác tính và xác nhận tƣơng tác của TAA với kháng thể kháng TAA nhằm đánh giá tiềm năng trở thành chỉ thị để chẩn đoán miễn dịch ung thƣ. Theo hƣớng này, năm 2011, Liu và cs đã tập trung nghiên cứu về hai TAA mới đƣợc tìm ra là p62 và p90 để tìm hiểu vai trò của chúng trong chẩn đoán miễn dịch [24]. Tại Việt Nam, những nghiên cứu proteomics mới chỉ đƣợc bắt đầu triển khai tại các Phòng thí nghiệm Trọng điểm (PTNTĐ) về công nghệ Gene và Protein đƣợc thiết lập trong giai đoạn 2001 - 2005 [2]. Ở nƣớc ta đã có một số nghiên cứu về ung thƣ gan sử dụng kỹ thuật proteomics, tuy nhiên, các nghiên cứu mới chỉ bƣớc đầu phân tích hệ protein mô gan của bệnh nhân ung thƣ, so sánh với mô gan của ngƣời bình thƣờng nhằm tìm ra các protein biểu hiện khác biệt trên hai loại mô này. Năm 2010, nhóm nghiên của chúng tôi thuộc Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc PTNTĐ Công nghê ̣Enzyme và Protein , Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên đa ̃ti ến hành nghiên cứu phân tích proteomics mô gan bệnh nhân ung thƣ gan nguyên phát đã xác định đƣợc 44 spot protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan bệnh nhân ung thƣ so với mô gan ngƣời bình thƣờng, nhận dạng đƣợc 37/44 spot protein tƣơng ứng với 28 protein đã đƣợc định danh và 8 protein giả thuyết. Trong đó, một số protein biểu hiện khác biệt đặc trƣng giữa mô ung thƣ so với mô thƣờng nhƣ: Annexin V, PCNA (biểu hiện tăng ở mô ung thƣ), p53, SODC (biểu hiện giảm ở mô ung thƣ) có tiềm năng trở thành chỉ thị của ung thƣ tế bào gan [20]. Năm 2011, chúng tôi đã tiến hành phân tích các protein biểu hiện khác biệt của mô gan ung thƣ và mô gan lành trên cùng lá gan của bệnh nhân ung thƣ gan [6], đồng thời cũng tiến hành phân tích biểu hiện khác biệt của protein huyết tƣơng của bệnh nhân ung thƣ gan sử dụng kỹ thuật điện di hai chiều [36]. Tiếp tục thực hiện hƣớng nghiên cứu proteomics ung thƣ gan tại Việt Nam, trong đề tài này, chúng tôi đã kết hợp phân tích proteomics mô gan của bệnh nhân ung thƣ gan và thực hiện phản ứng miễn dịch Western blot hai chiều nhằm tìm ra các protein có biểu hiện khác biệt, đặc biệt là các protein kháng nguyên phản ứng miễn dịch với kháng thể trong huyết tƣơng của bệnh nhân ung thƣ gan, đây là các protein có tiềm năng trở thành chỉ thị sinh học giúp chẩn đoán sớm ung thƣ gan. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng 24 Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. NGUYÊN LIỆU 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu Mẫu nghiên cứu là mô gan tại vị trí có khối u của bệnh nhân ung thƣ tế bào gan nguyên phát và huyết tƣơng của chính bệnh nhân đó. Mẫu đối chứng là mô gan cách ít nhất 5cm trên cùng lá gan tại vị trí không có khối u. Danh sách bệnh nhân ung thƣ gan đƣợc tiến hành nghiên cứu ghi tại Phụ lục 1. Mô gan và huyết tƣơng sử dụng trong nghiên cứu này (15 mẫu) do Khoa Tế bào - Giải phẫu bệnh, Bệnh viện K2, Tam Hiệp cung cấp. Mẫu mô đựng trong ống eppendorf đƣợc vận chuyển bằng bình chứa nitơ lỏng và bảo quản ở tủ lạnh sâu -80 o C, mẫu huyết tƣơng đƣợc bảo quản ở tủ lạnh -20oC. 2.1.2. Hóa chất Bảng 3. Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu Tên hóa chất Nhà cung cấp Ampholytes pH 4 - 7, pH 3 - 10 GE Health Care, Mỹ ECL Advance Western Blotting Detection Kit Product Booklet (RPN2135) GE Health Care, Mỹ Peptide chuẩn (Insulin B; Angiotensin II) Chất nền CHCA Sigma - Aldrich, Mỹ Trypsin Sigma - Aldrich, Mỹ CHAPS, DTT, IAA, Tris - base, Biorad, Mỹ Agarose low melting, Glycine, Urea, Tween 20 Sigma, Mỹ SDS, Acrylamide, Bis - Acrylamide Pharmacia, Thụy Điển Acetonitrile, Methanol, Acetone Merck, Đức Tất cả các hóa chất khác đƣợc sử dụng trong nghiên cứu đều đạt độ tinh sạch phân tích. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng 25 2.1.3. Thiết bị Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu sử dụng các dụng cụ, thiết bị trong Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, các thiết bị chính bao gồm: - Máy ly tâm lạnh 5417R (Eppendorft, Đức), máy ly tâm K30 (Sigma, Đức). - Thiết bị điện di đẳng điện Protean IEF cell (Biorad, Mỹ), Ettan IPGphor3 (GE - Healthcare, Mỹ). - Thanh IPG strip pH 3 - 10, 17cm; IPG strip pH 4 - 7, 7cm (Biorad, Mỹ). - Buồng điện di: Protean II xi multi-cell cho phép chạy 6 bản gel 17cm cùng một lúc, Protean II XL cell chạy 2 bản gel kích thƣớc 17cm và Mini-Protean 3 cell (Biorad, Mỹ) chạy các gel kích thƣớc 7cm. - Nguồn điện di PowerPacTMHC (Biorad, Mỹ). - Hệ thống phân tích hình ảnh sử dụng phần mềm chuyên dụng phân tích bản gel diện di hai chiều Phoretix (Shimadzu, Nhật Bản). - Hệ thống phân tích khối phổ AXIMA - CRF PLUS (KRATOS ANALYTICAL, Anh). 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Xử lý mẫu mô gan Mẫu mô gan lành và mô gan ung thƣ của cùng một bệnh nhân đƣợc cắt nhuyễn trong cối sứ đặt trên đá lạnh, protein mô gan đƣợc chiết bằng đệm muối phosphate (PBS) 0,05M, pH 7,4 và đệm phá tế bào (đệm Lysis) có chứa Urea 7M, Tris 30mM, CHAPS 4% w/v, DTT 65mM, PMSF 10mM. Tiến hành ly tâm thu các phân đoạn dịch chiết và kéo dài thời gian ly tâm lạnh với tốc độ cao để loại bỏ các thành phần phi protein (lipid, ARN, DNA...). Quy trình chiết protein từ mô gan đƣợc mô tả trong hình 3. Dịch thu đƣợc từ các phân đoạn gồm dịch chiết PBS1, PBS2, Lysis1, Lysis2 và Lysis3 sẽ đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 10% có SDS để kiểm tra thành LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng 26 phần và độ sạch. Các mẫu chƣa đạt độ sạch sẽ đƣợc tủa bằng dung dịch Acetone 100% theo tỷ lệ 1 thể tích mẫu và 4 thể tích dung dịch tủa ở -20oC trong 2 giờ. Protein lắng tủa đƣợc hòa lại bằng đệm Lysis. Các dịch chiết của cùng một mẫu đƣợc trộn lại để chuẩn bị cho điện di hai chiều. Hình 3. Quy trình chiết protein từ mô gan LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng 27 2.2.2. Định lƣợng protein theo phƣơng pháp Bradford Để đảm bảo tính đồng nhất về lƣợng protein giữa các mẫu nghiên cứu, trƣớc khi chạy điện di hai chiều, chúng tôi tiến hành xác định hàm lƣợng protein trong mẫu bệnh và mẫu đối chứng bằng phƣơng pháp Bradford [9]. Phƣơng pháp này định lƣợng bằng cách so màu và dựa trên sự thay đổi bƣớc sóng hấp thụ cực đại của phức protein với thuốc nhuộm coomassie brilliant blue. Dung dịch Bradford có tính axít thì độ hấp thụ cực đại ở bƣớc sóng 465nm, nhƣng khi kết hợp với protein thì độ hấp thụ cực đại ở bƣớc sóng 595nm. Trƣớc tiên, chúng tôi xây dựng đƣờng chuẩn về độ hấp thụ của albumin huyết thanh bò đã biết trƣớc nồng độ sau đó tiến hành đo mẫu. Từ số đọc của mẫu, dựa vào đƣờng chuẩn để xác định hàm lƣợng protein trong dịch chiết. 2.2.3. Điện di hai chiều Điện di hai chiều gồm: điện di phân vùng đẳng điện (IEF) để phân tách protein theo điểm đẳng điện và điện di SDS-PAGE để phân tách protein theo khối lƣợng và hình dạng phân tử. Quá trình này bắt đầu bằng việc làm trƣơng thanh strip có gradient pH cố định (IPG strip) bằng đệm trƣơng gel có chứa protein, sau 2 giờ, protein sẽ thấm hết vào thanh strip. Lƣợng protein tối đa mà sợi gel IPG strip dài 7cm và 17cm có thể thấm tƣơng ứng là 100µg và 400µg. Điện di đẳng điện đƣợc thực hiện trên hệ thống Protean IEF cell (Biorad, Mỹ) hoặc Ettan IPGphor3 (GE - Healthcare, Mỹ) để tập trung các phân tử protein vào vị trí tƣơng ứng với pI của phân tử đó trên thanh IPG strip. Quá trình chạy điện di đẳng điện diễn ra theo 5 buớc đƣợc trình bày ở bảng 4. Kết thúc điện di đẳng điện, các thanh IPG strip đƣợc ngâm trong đệm cân bằng I (Tris HCl 50mM pH 8,8; urea 6M, glycerol 30%, SDS 2%, DTT 0,1%) ở nhiệt độ phòng và đệm cân bằng II (Tris HCl 50mM pH 8,8; urea 6M, glycerol 30%, SDS 2%, IAA 0,25%), thực hiện trong bóng tối ở nhiệt độ phòng. Mỗi bƣớc cân bằng đƣợc thực hiện 3 lần, mỗi lần 10 phút. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng 28 Điện di chiều hai đƣợc tiến hành trên gel polyacrylamide 10% có SDS (SDS- PAGE) để tiếp tục phân tách protein theo khối lƣợng phân tử. Bảng 4. Các bƣớc chạy điện di đẳng điện trên thanh strip dài 7cm và 17cm Hiệu điện thế (V) Thời gian (t) V.t (V - giờ) Chế độ tăng V 7cm 17cm 7cm 17cm 7cm 17cm Bƣớc 1 50 12 giờ 0 Trƣơng gel Bƣớc 2 125 2 giờ ... ... Tuyến tính Bƣớc 3 250 15 phút ... ... Nhanh Bƣớc 4 4.000 10.000 1 giờ 2 giờ ... ... Chậm Bƣớc 5 4.000 10.000 ... ... 10.000 40.000 Nhanh Tổng ~ 18 giờ ~ 20 giờ ~ 14.000 ~ 60.000 Trong nghiên cứu này, mỗi cặp mẫu bệnh và đối chứng của từng bệnh nhân đƣợc tiến hành điện di hai chiều thành hai cặp bản gel. Sau khi kết thúc điện di hai chiều, một cặp bản gel đƣợc cố định protein bằng dung dịch chứa axit phosphoric 1,3%, methanol 20% trong một giờ, sau đó, nhuộm qua đêm bằng Coomassie G250 theo phƣơng pháp nhuộm Colloidal Coomassie Brilliant Blue của Neuhoff (1988). Phƣơng pháp nhuộm này đạt độ nhạy cao, có thể hiện lên các spot chỉ chứa 30ng protein [37]. Hình ảnh các protein trên bản gel này đƣợc chụp lại, lƣu giữ, phân tích đánh giá mức độ biểu hiện và so sánh với cơ sở dữ liệu sẵn có hoặc cắt, thủy phân spot protein để phân tích khối phổ. Cặp bản gel còn lại sẽ đƣợc dùng để điện chuyển sang màng PVDF để thực hiện phản ứng miễn dịch Western Blot. 2.2.4. Western Blot Western Blot hay còn gọi là kỹ thuật thẩm tách miễn dịch, đây là kỹ thuật đang đƣợc sử dụng rộng rãi để phát hiện sự có mặt của các protein cụ thể trong mẫu nghiên cứu dựa vào tƣơng tác đặc hiệu của kháng nguyên - kháng thể. Tiến hành kỹ thuật Western Blot sử dụng kit ECL AdvanceTM Western blotting detetion (GE Healthcare, Mỹ) để xác định kháng nguyên cố định là protein trong dịch chiết mô gan sử dụng kháng thể bậc một là huyết tƣơng của ngƣời bệnh và kháng kháng thể LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng 29 (kháng thể bậc hai) liên kết với peroxidase cỏ ngựa (HRP), enzyme này xúc tác cho phản ứng oxy hóa Luminol gây ra hiện tƣợng phát quang. Sự phát sáng tối đa xuất hiện ở bƣớc sóng 425nm. Quá trình thực hiện gồm các bƣớc sau: Tiến hành điện đi biến tính để phân tách protein trong mô gan trên bản gel polyacrylamide 10% có SDS. - Điện chuyển qua đêm ở 4oC để chuyển protein trong gel lên bề mặt màng PVDF. - Nhuộm màng bằng dung dịch Ponceau S để kiểm tra hiệu quả chuyển màng, sau đó, tẩy trắng màng bằng H2O và ủ màng với dung dịch blocking trong 1 giờ. - Ủ màng qua đêm với dung dịch kháng thể bậc 1 (huyết tƣơng của ngƣời bệnh) đã pha loãng. Sau đó, rửa sạch màng để loại bỏ kháng thể thừa và các liên kết không đặc hiệu. - Ủ màng với dung dịch kháng thể bậc hai (kháng kháng thể gắn với HRP) đƣợc pha loãng theo tỷ lệ 1:10.000 trong 1 giờ. Rửa bỏ kháng thể thừa. - Ủ màng với dung dịch chứa Luminol và H2O2, để trong bóng tối 5 phút, ghi lại hình ảnh phát quang trên màng PVDF. 2.2.5. Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều, kết quả Western Blot Hình ảnh các bản gel điện di hai chiều và hình ảnh phát quang trên màng PVDF sau khi thực hiện phản ứng kháng nguyên - kháng thể đƣợc số hóa bằng cách quét vào máy tính có phần mềm chuyên dụng Phoretix (Shimazdu, Nhật Bản) để phân tích hình ảnh. Trƣớc tiên, phần mềm sẽ xác định tất cả các spot protein có trên mỗi bản gel và màng, mỗi spot đều đƣợc xác định số thứ tự, vị trí, thể tích (tính theo độ lớn và độ đậm nhạt của spot) trên bản gel/màng. Phần mềm này còn cho phép xác định các spot protein tƣơng ứng trên từng cặp bản gel. Dựa vào cƣờng độ khối trung bình của từng spot (nomalized volume - đƣợc tính bằng thể tích của spot đó chia cho tổng thể tích các spot trên toàn bản gel nhân với 100) có thể chỉ ra điểm khác biệt giữa bản gel/màng mẫu bệnh so với bản gel/màng mẫu đối chứng (hình 4). LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng 30 Sau khi phân tích hình ảnh, chúng tôi có thể chỉ ra các spot protein xuất hiện trên bản gel/màng này mà không xuất hiện trên bản gel/màng khác; các spot protein biểu hiện tăng, giảm ở các bản gel/màng khác nhau. Dựa vào kết quả này, chúng tôi xác định các spot protein ở các mẫu nghiên cứu có thể cắt ra khỏi bản gel phục vụ cho các phân tích tiếp theo. Đồng thời cũng xác định đƣợc các điểm protein tƣơng ứng trên màng có tính kháng nguyên, đây chính là các protein kích thích sinh ra đáp ứng miễn dịch chống ung thƣ. Hình 4. Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều sử dụng phần mềm Phoretix 2.2.6. Cắt và thủy phân spot trên bản gel điện di hai chiều Các spot protein quan tâm trên các bản gel điện di hai chiều đƣợc cắt ra khỏi bản gel, lúc này, phân tử protein nằm trong gel polyacrylamide liên kết với phân tử thuốc nhuộm Coomassie, do đó, để thu đƣợc tập hợp các mảnh peptide phục vụ cho phân tích khối phổ, cần loại bỏ chất màu Coomassie và phá vỡ cấu trúc không gian của phân tử protein giúp enzyme trypsin có thể hoạt động. Enzyme trypsin cắt phân tử protein tại các gốc Lysine (K) và Arginine (R) ở đầu C, và không cắt tại các vị trí này khi các gốc này đƣợc liên kết với Prolin (P). Khi đó, phân tử protein đƣợc cắt thành các mảnh peptide (6 - 20 acid amin) thích hợp cho phân tích khối phổ. Quá trình tẩy màu spot và thuỷ phân protein thành các peptide sẵn sàng cho phân tích khối phổ, bao gồm các bƣớc cụ thể nhƣ sau: LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng 31 - Cắt các spot ra khỏi bản gel. - Rửa các spot bằng nƣớc MiniQ. - Tẩy màu các spot đã nhuộm coomassie bằng dung dịch chứa ammonium bicarbonate (ABC) 50mM, acetonitrile (AcCN) 50%. - Làm khô các spot bằng AcCN 100%. - Nhỏ dung dịch trypsin vào các spot và ủ ở 37oC trong 4 giờ, khi đó, phân tử protein trong các spot sẽ bị thuỷ phân thành các peptide có thể đi ra khỏi gel polyacrylamide. Các peptide trong dịch thủy phân sẽ đƣợc hấp phụ bằng Ziptip C18. Quy trình Ziptip đƣợc tiến hành theo các bƣớc sau: - Làm ƣớt Ziptip bằng dung dịch có Trifluoroacetic acid (TFA) 0,1% trong AcCN 70%. - Cân bằng Ziptip bởi dung dịch TFA 0,1%. - Hấp phụ peptide trong dịch thuỷ phân vào Ziptip. - Loại muối bằng dung dịch TFA 0,1%. - Phản hấp phụ peptide ra khỏi Ziptip lên đĩa MS bằng dung dịch TFA 0,1% trong AcCN 70%. - Cuối cùng, bổ sung lên đĩa MS dung dịch matrix (CHCA 10mg/ml trong TFA 0,05%, AcCN 50%). 2.2.7. Phân tích khối phổ và nhận dạng protein Tiến hành phân tích khối phổ (MALDI-TOF MS) để xác định khối lƣợng của tập hợp các peptide thu đƣợc sau khi thủy phân mỗi spot protein. Phƣơng pháp khối phổ (MS) là phƣơng pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lƣợng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các hạt mang điện tích hay ion trong một điện trƣờng hoặc từ trƣờng nhất định. Nguồn MALDI đƣợc dùng trong phân tích các hợp chất cao phân tử dựa trên nguyên lý làm ion hóa và thăng LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng 32 hoa mẫu peptide từ phức hợp với chất nền (matrix) ở dạng tinh thể qua tác động của các xung laser [1]. Mẫu peptide đƣợc phân tích song song với các mẫu chuẩn là hỗn hợp hai peptide: angiotensin II (Mw 1046,5423Da) và insulin B (Mw 3494,6513Da). Hỗn hợp peptide đƣợc trộn với chất nền CHCA, để khô và đƣa vào máy phân tích khối phổ AXIMA - CRF PLUS (KRATOS ANALYTICAL, Anh). Các thông số hoạt động của máy khối phổ gồm: - Nguồn laser: 55 - Profile: 30 profile cho một lần bắn - Khối lƣợng tối ƣu: 2000Da - Phổ khối lƣợng: 500 - 5000Da Protein đƣợc nhận dạng theo phƣơng pháp Peptide Mass Fingerprint (PMF). Theo phƣơng pháp này, protein đƣợc xác định bằng việc so sánh khối lƣợng của các peptide thu đƣợc sau khi thủy phân với cơ sở dữ liệu lý thuyết sẵn có sử dụng phần mềm Mascot để tra cứu theo chế độ sau: - Cơ sở dữ liệu: NCBInr - Phân loại: Homo sapiens - Enzyme: Trypsin - Các cải biến không thay đổi: Cacbamidomethyl (C) - Các cải biến thay đổi: Oxidation (M) - Cho phép sai số: ± 1Da - Giá trị khối: MH+ LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng 33 Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. TÁCH CHIẾT PROTEIN TỪ MÔ GAN Trong quá trình thực hiện đề tài này, chúng tôi tiến hành tách chiết protein từ mô gan ung thƣ và mô gan bình thƣờng (mẫu đối chứng). Mẫu mô đƣợc cắt nhỏ, ngâm trong dịch chiết PBS 0,05M pH7,4 và đệm phá tế bào (Lysis) rồi thực hiện các bƣớc ly tâm để thu lấy các phân đoạn dịch chiết protein. Kết quả tách chiết đƣợc kiểm tra bằng điện di SDS-PAGE (hình 5). 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 A. Dịch chiết mô gan bình thƣờng B. Dịch chiết mô gan ung thƣ Hình 5. Điện di kiểm tra các phân đoạn dịch chiết protein từ mô gan bình thƣờng và mô gan ung thƣ trên gel polyacrylamide 10% có SDS (Giếng 1: Dịch chiết PBS1; Giếng 2: Dịch chiết PBS2; Giếng 3: Dịch chiết Lysis1; Giếng 4: Dịch chiết Lysis2; Giếng 5: Dịch chiết Lysis3) Trong điêṇ di SDS-PAGE, protein đƣợc phân tách theo khối lƣợng phân tử, các protein có khối lƣơṇg phân t ử khác nhau thì đƣơc̣ hiêṇ lên dƣới daṇg tƣ̀ng băng vạch khác nhau. Hiệu quả tách chiết protein đƣợc đánh giá thông qua thành phần và hàm lƣợng protein thể hiện bằng số lƣợng các băng và độ đậm nhạt của các băng protein. Khi nhuộm bản gel bằng thuốc nhuộm có chứa Coomassie, băng protein bắt màu thuốc nhuộm càng đậm chứng tỏ hàm lƣợ ng protein tại đó càng lớn . Số lƣơṇg băng trong môṭ giếng điêṇ di càng nhiều ch ứng tỏ thành phần protein của mẫu càng đa daṇg phong phú. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng 34 Trong kết quả điện di kiểm tra dịch chiết protein từ mẫu mô gan (hình 5), chúng tôi thấy trong các giếng đã xuất hiện nhiều băng protein trải đều từ trên xuống dƣới, chứng tỏ mẫu dịch chiết protein từ mô gan có thành phần protein đa dạng. Tuy nhiên, các phân đoạn dịch chiết protein mô gan có độ sạch khác nhau, ở các giếng 1, 3 (hình 5A) và giếng 1 (hình 5B), sự biểu hiện của các băng protein là chƣa rõ ràng, hơn nữa, ở các giếng vẫn có hiện tƣợng kéo vệt dọc. Do đó, chúng tôi tiến hành tủa mẫu dịch chiết thô bằng dung dịch acetone 100% theo tỉ lệ 1 thể tích mẫu và 4 thể tích dung dịch tủa ở -20oC nhằm tập trung protein có trong mẫu, đồng thời loại mỡ và các chất phi protein. Các dịch chiết sau khi tủa đƣợc hòa lại bằng đệm lysis và trộn lại với nhau tạo thành dịch chiết protein đầy đủ của mô gan dùng để tiến hành bƣớc thí nghiệm tiếp theo. 3.2. PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH BẢN GEL ĐIỆN DI HAI CHIỀU 3.2.1. Phân tách hệ protein mô gan trên bản gel diện di hai chiều Cho đến nay, kỹ thuật điện di hai chiều (2-DE) đã trở thành một trong những công cụ phân tách protein đƣợc dùng rộng rãi trong các nghiên cứu về hệ protein. Kỹ thuật 2-DE cho phép phân tách các protein khác nhau 0,1 đơn vị pI (isoelectric point) và 1kDa về khối lƣợng phân tử [37]. Protein trong dịch chiết mô gan bình thƣờng và mô gan ung thƣ cùng đƣợc phân tách bằng điện di hai chiều. Trên bản gel điện di, các protein trong mẫu đƣợc phân tách thành các spot protein riêng rẽ hoặc các dãy spot của một loại protein, đây là kết quả của việc cải biến protein, có thể do sự sắp xếp ARN hay biến đổi sau dịch mã, tạo ra các đồng phân có khối lƣợng phân tử tƣơng tự nhau và điểm đẳng điện gần nhau. Tuy hệ protein mô gan rất phức tạp, song hàm lƣợng của các protein trong gan khá đồng đều, do đó, các protein đƣợc phân tách khá tốt trên bản gel 2-DE (hình 6). Khi phân tách protein mô gan trên bản gel 2-DE sử dụng thanh strip dài 17cm trong khoảng pH 3 - 10 (hình 6A1, B1), kết quả điện di cho thấy các protein đã đƣợc phân tách rõ ràng thành các spot riêng rẽ nằm trải khắp bản gel và ít có những vùng tập trung các spot protein có hàm lƣợng cao bao trùm lên các spot protein LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng 35 khác. Tuy nhiên, ở vùng giữa bản gel trong khoảng pH 4 - 7, mật độ các spot protein cao, do đó, chúng tôi tiếp tục tiến hành điện di hai chiều sử dụng thanh strip 7cm, pH 4 - 7 để phân tách protein trong khoảng pH này rõ ràng hơn (hình 6A2, B2). A - Mô gan bình thƣờng B - Mô gan ung thƣ Hình 6. Phân tách protein mô gan của bệnh nhân 8460 trên bản gel điện di hai chiều Chiều 1: Điện di đẳng điện sử dụng thanh IPG strip dài 17cm, pH 3 - 10 (A1 và B1); IPG strip dài 7cm, pH 4 - 7 (A2 và B2); Chiều 2: Điện di SDS-PAGE trên gel polyacrylamide 10%. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân tách đƣợc hệ protein mô gan ung thƣ và mô gan bình thƣờng của 6 bệnh nhân HCC trên cả bản gel 2-DE sử dụng thanh strip dài 17cm, pH 3 - 10 và thanh strip dài 7cm, pH 4 - 7. Kết quả điện di phân tách protein mô gan của bệnh nhân HCC trên bản gel 2-DE đƣợc thể hiện trong hình 6 và phụ lục 2. LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng 36 Bƣớc đầu sử dụng phần mềm chuyên dụng phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều - Phoretix, chúng tôi đã xác định đƣợc tổng số spot đƣợc phân tách trên các bản gel 2-DE (bảng 5). Bảng 5. Tổng số spot trên mỗi bản gel điện di hai chiều Mã bệnh nhân Bản gel 17cm Bản gel 7cm Mô bình thường Mô ung thư Mô bình thường Mô ung thư 8261 272 spot 171 spot 75 spot 136 spot 8460 329 spot 288 spot 139 spot 123 spot 8935 258 spot 291 spot 53 spot 61 spot 8977 229 spot 254 spot 72 spot 91 spot 9242 275 spot 334 spot 108 spot 155 spot 10480 220 spot 268 spot 145 spot 141 spot 3.2.2. Phân tích biểu hiện của protein trên bản gel điện di hai chiều Phần mềm chuyên dụng Phoretix cho phép so sánh sự biểu hiện của các protein thuộc mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng thông qua sự biểu hiện của các spot trên các bản gel 2-DE. Phần mềm giúp xác định các spot