Luận văn Xây dựng cơ sở dữ liệu hai gene 16S và 23S Ribosom RNA ở vi khuẩn, ứng dụng cơ sở dữ liệu hai gene 16S và 23S Ribosom RNA ở vi khuẩn để phát hiện các tác nhân gây bệnh viêm màng não mủ (Bacterial Menighitis)

ng kết hồi cứu của Viện Nhi TW từ năm 1996 – 1999 ở trẻ từ 1 tháng đến 15 tuổi, 3 căn nguyên gây bệnh chính vẫn là Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis (88,7%) với tỷ lệ tử vong tƣơng ứng là 8,7%, 31,2%, 14,3% trong đó Haemophilus influenzae chiếm 56% tổng số và gặp ở trẻ dƣới 2 tuổi. Ở trẻ sơ sinh thì căn nguyên chính là Klebsiella pneumoniae và Escherichia coli. Bảng 2.1. Tóm tắt các tác nhân gây bệnh theo lứa tuổi Tuổi Tác nhân thông thƣờng 0 tuần đến 4 tuần Streptococcus agalactiae, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus spp 4 tuần đến 12 tuần Streptococcus agalactiae, Escherichia coli, Haemophilus influenzae 3 tháng đến 2 tuổi Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis 3 tuổi đến 15 tuổi Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae 15 tuổi đến 50 tuổi Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae Trên 50 tuổi Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, trực khuẩn gram âm 13 2.4.1.3. Các con đƣờng xâm nhiễm của vi khuẩn gây bệnh Một số vi trùng ở trong máu đi vào màng não cũng có thể có nguồn gốc từ viêm nội tâm mạc, viêm phổi, viêm tắc tĩnh mạch hoặc cũng có thể xâm nhập trực tiếp từ các ổ viêm xoang, viêm tai giữa, viêm mũi. Ở các bệnh nhân bị chấn thƣơng sọ não hoặc có vết gãy ở xoang mũi hay bị gãy xƣơng sàng dễ bị viêm màng não. Ở những trƣờng hợp này, sự nhiễm trùng thƣờng do các vi khuẩn hiện diện ngoài da của bệnh nhân. Các phẫu thuật ngoại thần kinh cũng có thể gây viêm màng não nhất là các thủ thuật đụng chạm đến dịch não tủy hoặc do các trƣờng hợp viêm cốt tủy ở xƣơng sọ và cột sống. Viêm màng não còn có thể do nhiễm các vi khuẩn từ môi trƣờng bên ngoài nhƣ các bệnh nhân bị phỏng dễ bị nhiễm Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa. Trẻ em nằm trong môi trƣờng ẩm ƣớt dễ bị nhiễm các loại vi khuẩn phát triển trong không khí ẩm. Trẻ sơ sinh dễ bị nhiễm các loại vi khuẩn có mặt thƣờng xuyên trong âm đạo hay trực tràng ngƣời mẹ (Escherichia coli) hoặc từ đƣờng tiết niệu của ngƣời mẹ (Listeria monocytogenes) khi màng ối bị vỡ. 2.4.2. Các triệu chứng biểu hiện lâm sàng của bệnh 2.4.2.1. Những triệu chứng giai đoạn khởi phát Một bệnh sử đƣợc khai thác tỉ mỉ có thể thấy bệnh nhân viêm màng não trƣớc đó có nhiễm trùng hô hấp, viêm xoang, viêm tai giữa hay chấn thƣơng sọ não mới hay cũ. Ở giai đoạn này, các triệu chứng tập trung ở hội chứng nhiễm trùng, một vài bệnh nhân có đau đầu hay ói mửa. Một vài triệu chứng gợi ý nhƣ sốt có tử ban, đốm xuất huyết rải rác trong cơ thể là nghĩ đến não mô cầu… 2.4.2.2. Biểu hiện lâm sàng của viêm màng não mủ – Hội chứng nhiễm trùng Sốt cao liên tục ở trẻ em. Ngƣợc lại, sốt có thể không điển hình ở ngƣời lớn hoặc bệnh nhân cao tuổi. Kèm theo sốt là thể trạng suy sụp, mất nƣớc, môi khô, tim đập nhanh. Ở trẻ em có thể bức rức, lăn lộn, bỏ ăn. Đau đầu là triệu chứng thƣờng gặp ở tất cả các trƣờng hợp. Nôn là triệu chứng xuất hiện muộn hơn đau đầu. Nôn vọt nhất thời không liên quan đến bữa ăn. 14 Rối loạn ý thức: ở giai đoạn đầu bệnh nhân rất tỉnh sau đó rơi vào trạng thái tâm lý hoảng sợ, sợ ánh sáng, sợ tiếng động; tiến nhanh đến mất ý thức và hôn mê. Rối loạn cơ vòng: bí tiểu, táo bón là triệu chứng thƣờng gặp trong viêm màng não mủ. – Hội chứng màng não Đau đầu, ói mửa, sợ ánh sáng, cứng tƣ thế do phản ứng, bệnh nhân nằm co, cứng gáy, tăng phản xạ gân cơ tứ chi. – Các dấu hiệu thần kinh khác Co giật, 20 – 30% các trƣờng hợp, xuất hiện sớm ở những ngày đầu. Liệt các dây thần kinh sọ (dây III, VI,VIII), phù gai thị. Liệt ½ ngƣời mức độ từ nhẹ đến nặng, trong một số ít trƣờng hợp có thể liệt một tay, một chân hay ½ mặt. Rối loạn ý thức và hôn mê. Hôn mê có thể xuất hiện sớm, mức độ khác nhau nhƣng khi rối loạn ý thức và hôn mê bệnh nhân thƣờng ở giai đoạn nặng. Một số trƣờng hợp với bệnh cảnh của triệu chứng tăng áp lực nội sọ: đau đầu, ói mửa và phù gai thị. Bảng 2.2. Dấu hiệu và triệu chứng của bệnh viêm màng não mủ Triệu chứng và dấu hiệu Tần số liên quan % Sốt 90 Đau đầu 90 Kích thích màng não 85 Tăng cảm giác 80 Kernig 50 Brundzinski 50 Co giật kiểu động kinh 30 Nôn 35 Dấu hiệu khu trú 10-20 Phù gai thị <1 15 2.4.3. Hậu quả của bệnh trên những đối tƣợng bị lây nhiễm Biến chứng nhiễm trùng máu do sự lan tỏa của vi khuẩn theo đƣờng máu. Vi khuẩn có thể khu trú lại gây viêm nội tâm mạc hay viêm mủ khớp. Biến chứng thần kinh nặng nề (20%). Ngoài ra còn có rối loạn thị giác, liệt nửa ngƣời (15%). Tuy nhiên, các biểu hiện liệt dây thần kinh này có thể biến mất sau khi lành bệnh. Biến chứng co giật: co giật toàn phần hay cục bộ, có thể kèm giãn đồng tử một bên, tăng phản xạ gân xƣơng không đồng đều do phù não, do viêm tắc tĩnh mạch vỏ não. Áp xe não do nhiễm trùng lan tỏa theo đƣờng máu từ các xoang bị viêm. Tràn dịch màng cứng nghi ngờ xảy ra ở những trẻ có vòng đầu lớn nhanh, ói, sốt kéo dài, đạm dịch não tủy tiếp tục tăng cao mặc dù tế bào giảm. Viêm màng não tái phát nhiều lần xảy ra ở những bệnh nhân có khuyết tật cơ thể học (rạn nứt hộp sọ trong những trƣờng hợp tiền căn chấn thƣơng sọ não, rò rỉ dịch não tủy…) do những ổ viêm kế cận tồn tại (viêm xoang, viêm tai…) hoặc do giảm miễn dịch cơ thể. 2.4.4. Tình hình bệnh viêm màng não mủ trên thế giới và Việt Nam – Tình hình nhiễm bệnh trên thế giới Bệnh viêm màng não nói chung (bao gồm cả viêm màng não mủ) xảy ra ở tất cả các nơi trên thế giới nhƣng những trận dịch lớn nhất và thƣờng xuyên lặp lại là ở vùng bán khô cằn của vùng cận sa mạc Sahara, châu Phi. Khu vực này còn đƣợc biết với tên “The meningitis belt” (tạm dịch là “vành đai bệnh viêm màng não”) trải dài từ Senegal đến Ethiopia gồm 15 nƣớc với dân số ƣớc đoán khoảng 300 triệu ngƣời. Trận dịch viêm màng não gần đây nhất xảy ra vào giữa thập niên 90 thế kỷ XX với 350 000 ca bệnh và hàng ngàn ngƣời chết. Năm 1996, hầu hết 190 000 ca bệnh ở Mali, Niger, Nigeria, Burkina và những nƣớc khác đã làm tê liệt hệ thống chăm sóc y tế và làm cạn kiệt nguồn dự trữ vaccine thế giới. Theo thống kê của Tổ chức Y Tế thế giới (WHO), hằng năm số ngƣời mắc bệnh viêm màng não mủ (không kể những đại dịch) là 1,2 triệu ca. Năm 1999, trên toàn thế giới có 88006 trƣờng hợp viêm màng não mủ đƣợc ghi nhận, trong đó có 6593 trƣờng hợp tử vong. Trong số này, các nƣớc châu Phi cũng chiếm một số lƣợng đáng kể, 16 52953 trƣờng hợp, 4129 trƣờng hợp tử vong. Và nếu tính từ ngày 1/1 đến 16/4/2000, trong một khoảng thời gian ngắn đã có hàng chục ngàn trƣờng hợp nhiễm bệnh viêm màng não mủ đƣợc ghi nhận, trong đó châu Phi có 18091 trƣờng hợp, 1897 trƣờng hợp tử vong. Đối với bệnh viêm màng não mủ, ngƣời ta có thể thống kê đƣợc một bức tranh toàn diện về dịch tễ của bệnh này. Tuy nhiên, theo các số liệu thống kê chính thức tại Mỹ, tỷ lệ mắc bệnh viêm màng não mủ là 3-5/100 000 dân và hơn 2000 trƣờng hợp tử vong trong một năm. Nếu chỉ tính riêng ở trẻ sơ sinh, theo điều tra của Thụy Điển, tỷ lệ mắc bệnh viêm màng não mủ là 2,8/100 000 trẻ mới sinh. Tại các quốc gia đang phát triển, bệnh có khuynh hƣớng trầm trọng hơn. Tại Brazil, trong giai đoạn 1973 – 1982, tỷ lệ mắc bệnh viêm màng não mủ là 45,8/100 000 dân và tử vong là 33%. Tại Gioudanni, tỷ lệ mắc bệnh viêm màng não mủ là 1,1/1000 trẻ mới sinh. – Tình hình viêm màng não mủ ở Việt Nam Tại Việt Nam, bệnh viêm màng não mủ tuy không bùng phát thành dịch nhƣng vẫn xảy ra liên tục ở các khoảng thời gian khác nhau trong năm. Theo thống kê của Trung tâm Y Tế Dự Phòng thành phố Hồ Chí Minh cho biết: Năm 1997 1998 1999 2000 Số ca bệnh 217 177 301 458 Trong đó chỉ có 8 ca tử vong từ năm 1997 đến năm 2000 (chiếm tỉ lệ 0,69%) Các số liệu thống kê trên cho thấy bệnh viêm màng não mủ đang có chiều hƣớng gia tăng. Tỷ lệ tử vong của những trƣờng hợp viêm màng não mủ thấp nhƣng di chứng của bệnh để lại rất nặng nề. Do đó, việc chẩn đoán nhanh và chính xác để điều trị bệnh một cách nhanh chóng là vô cùng cần thiết. 2.5. VI KHUẨN GÂY BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MỦ Có ít nhất 15 loại vi khuẩn có thể là căn nguyên gây bệnh. Đƣợc thƣờng xuyên ghi nhận là Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae cả 3 loại này chiếm tỷ lệ là 80% các trƣờng hợp viêm màng não mủ. Tuy nhiên, mức độ mắc phải từng loại vi khuẩn tuỳ thuộc vào lứa tuổi, giới tính và yếu tố 17 thuận lợi cũng nhƣ tuỳ thuộc vào khu vực địa lý. Ngoài ra, điều kiện khí hậu, vệ sinh, mùa… cũng ảnh hƣởng đến tần số mắc bệnh của các căn nguyên. – Haemophilus influenzae Viêm màng não mủ do H. influenzae chiếm khoảng 45 – 48% tổng số bệnh nhân với tỷ lệ tử vong là 3 – 6%. H. influenzae là căn nguyên quan trọng nhất ở trẻ dƣới 6 tuổi, đặc biệt ở trẻ 6 – 12 tháng. Các yếu tố nguy cơ là viêm xoang, viêm tai giữa, viêm nắp thanh quản, viêm phổi, bệnh tiểu đƣờng, suy giảm miễn dịch sau khi cắt lách, chấn thƣơng đầu có thoát dịch não tủy. – Neisseria meningitidis (não mô cầu) Viêm màng não mủ do não mô cầu chiếm 14 – 20% tổng số bệnh nhân với tỷ lệ tử vong là 10 – 13%. N. meningitidis là căn nguyên phổ biến ở trẻ em và thanh niên. Căn nguyên này gồm nhiều nhóm, tất cả các nhóm đều có khả năng gây dịch. Tuy nhiên nhóm B thƣờng gây dịch lẻ tẻ, nhóm A và C thƣờng gây các vụ dịch lớn. Nhóm Y có thể có viêm phổi kết hợp. Yếu tố nguy cơ là bệnh nhân suy giảm phần cuối của bổ thể (C5, C6, C7, C9). – Streptococcus pneumoniae (phế cầu) Viêm màng não mủ do phế cầu chiếm 13 – 17% tổng số bệnh nhân với tỷ lệ tử vong là 19 – 26%. Phế cầu là căn nguyên chính ở ngƣời trƣởng thành và là một trong ba căn nguyên chính ở trẻ em. – Listeria monocytogenes Viêm màng não mủ do Listeria chiếm khoảng 2% các trƣờng hợp viêm màng não mủ với tỷ lệ tử vong là 22 – 29%. 90% các trƣờng hợp viêm màng não mủ do Listeria là do các type Ia, Ib, VIb gây nên. Nhiễm Listeria monocytogenes hay gặp ở trẻ sơ sinh, trẻ bị ung thƣ, giảm miễn dịch, tiểu đƣờng, bệnh gan, thận. Phụ nữ mang thai có thể mang Listeria monocytogenes ở bộ phận sinh dục, trực tràng mà không có triệu chứng và truyền vi khuẩn cho con. – Streptococcus agalactiae (liên cầu khuẩn) Viêm màng não mủ do liên cầu khuẩn chiếm 3 – 6% tổng số bệnh nhân viêm màng não mủ với tỷ lệ tử vong là 12 – 27%. Liên cầu khuẩn nhóm B là nguyên nhân phổ biến ở trẻ sơ sinh. Khoảng 15 – 40% phụ nữ có thai có liên cầu khuẩn nhóm B trong trực tràng và âm đạo nhƣng không có triệu chứng. Nguy cơ truyền bệnh từ mẹ sang con tăng cao lên khi mẹ mắc bệnh. Bệnh có thể truyền từ tay nữ hộ sinh đến đứa 18 trẻ. Hầu hết các ca nhiễm khuẩn S. agalactiae gây ra bởi type III và xuất hiện ngay sau tuần đầu. – Trực khuẩn Gram âm hiếu khí Các loài vi khuẩn này (Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa…) đang trở thành căn nguyên quan trọng với tỷ lệ tử vong tƣơng đối cao. Bệnh hay gặp sau chấn thƣơng đầu, phẫu thuật thần kinh, trẻ sơ sinh, bệnh nhân có vấn đề về miễn dịch và nhiễm khuẩn huyết Gram âm. – Staphylococci (tụ cầu) Tỷ lệ tử vong của viêm màng não mủ do tụ cầu từ 14 – 77%. S. epidermidis là căn nguyên chủ yếu ở bệnh nhân có lỗ thông dịch não tủy. Tụ cầu vàng (S. aureus) thƣờng gặp trong giai đoạn sớm sau phẫu thuật thần kinh, hoặc sau chấn thƣơng có rò dịch não tủy. Các điều kiện thuận lợi khác gồm: tiểu đƣờng, suy thận có thấm phân máu và u ác tính. – Những vi khuẩn khác Các điều kiện thuận lợi cho viêm màng não mủ do Nocardia spp nhƣ dùng thuốc miễn dịch, u ác tính, chấn thƣơng đầu và hệ thần kinh trung ƣơng, mụn mủ viêm mãn tính, bệnh sarcom. Viêm màng não mủ do vi khuẩn kỵ khí thƣờng có điều kiện nhƣ: viêm tai, viêm xoang, viêm họng, áp xe não, nhiễm khuẩn vết thƣơng sau chấn thƣơng và sau phẩu thuật thần kinh. 2.6. CÁC PHƢƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MỦ 2.6.1. Phƣơng pháp chẩn đoán lâm sàng Ngƣời bị viêm màng não mủ thƣờng có những biểu hiện nhƣ sốt cao, nôn mửa, đau đầu dữ dội, cứng cổ, sợ ánh sáng, mất ý thức… 2.6.2. Phƣơng pháp xét nghiệm vi khuẩn học Dịch não tủy đƣợc đem ly tâm lấy phần cặn lắng để nhuộm gram tìm vi khuẩn. Có thể soi nhìn thấy đƣợc vi khuẩn hay không tùy thuộc vào số lƣợng vi khuẩn bị nhiễm. Nếu số lƣợng này lên đến 105/ml thì có thể soi (+) trong 97% các trƣờng hợp. Tỷ lệ nhuộm (+) cũng tùy thuộc vào loại vi khuẩn. Dịch não tủy đƣợc đem cấy vào môi trƣờng thạch máu hay thạch sô-cô-la. Cấy dịch não tủy có thể dƣơng tính trong 70 – 80% các trƣờng hợp viêm màng não mủ. 19 2.6.3. Phƣơng pháp miễn dịch học Phƣơng pháp điện di miễn dịch ngƣợc chiều (Counter Immuno Electrophoresis) xác định đƣợc viêm màng não do H. influenzae, S. pneumoniae, N. meningitidis A, B, C, Y và W 135 trong vòng vài giờ. Phản ứng ngƣng kết với latex nhạy hơn phƣơng pháp CIE, cho kết quả trong 4 giờ, giúp phát hiện kháng nguyên polysaccharide trong H. influenzae type b, S. pneumoniae, N. meningitidis và Streptococcus nhóm B. 2.6.4. Phƣơng pháp tế bào học Tế bào dịch não tủy phải đƣợc khảo sát ngay, vì sau 90 phút, các bạch cầu của dịch não tủy sẽ bắt đầu thoái hóa. Trong trƣờng hợp bệnh viêm màng não mủ, lƣợng tế bào có thể từ 100 – 1000/mm3, trong đó bạch cầu đa nhân trung tính chiếm đa số (trên 80%). Trong những trƣờng hợp viêm màng não mủ đang điều trị dở dang, số lƣợng các tế bào đơn nhân có thể cao hơn đa nhân. Công thức Dejong Nếu bạch cầu đếm đƣợc trong dịch não tủy lớn hơn số lƣợng trên chính là số lƣợng bạch cầu viêm. Nếu bạch cầu viêm trên 10/mm3 cho phép kết luận có sự tăng bạch cầu dịch não tủy, nghĩa là có hiện tƣợng viêm. 2.6.5. Phƣơng pháp sinh hoá 2.6.5.1. Đƣờng trong dịch não tủy Trong viêm màng não mủ, lƣợng đƣờng ở dịch não tủy thƣờng thấp hơn đƣờng huyết 50 – 60%. Một số ít trƣờng hợp đƣờng dƣới 10 mg%. Đƣờng trong dịch não tủy thấp có giá trị phân biệt viêm màng não mủ với các viêm màng não siêu vi hay các nhiễm trùng cạnh màng não. 2.6.5.2. Đạm trong dịch não tủy Đạm trong dịch não tủy tăng cao, khoảng 100 mg%. Nếu đạm trong dịch não tủy tăng lên trên 1000 mg% phải nghĩ đến tắc nghẽn khoang dƣới nhện thứ phát. Ngoài ra, khi dịch não tủy bị chạm thƣơng, nồng độ đạm có thể gia tăng hơn: cứ 1000 hồng cầu sẽ tăng 0,1 mg/ml. Bạch cầu dịch não tủy = (Hồng cầu dịch não tủy x bạch cầu máu)/ Hồng cầu máu 20 2.6.5.3. Phƣơng pháp khảo sát nồng độ lactate Lactate là chất đƣợc sản sinh từ quá trình chuyển hóa kỵ khí của glucose. Nó là một yếu tố quan trọng giúp chẩn đoán bệnh. Trị số lactate dịch não tủy tăng cao trên 4 mmol/l trong viêm màng não mủ. Độ nhạy cảm của thông số này khá cao so với các thông số khác nhƣ đạm, đƣờng. Trị số này sẽ giảm trong quá trình đáp ứng với điều trị. 2.6.6. Phƣơng pháp chụp cắt lớp – CT (Computer Tomography) Phƣơng pháp chụp cắt lớp điện toán – CT sọ não không có ích cho chẩn đoán nhƣng có thể chỉ định cho bệnh nhân cứ sốt dai dẳng, có biểu hiện tăng áp lực nội sọ, liệt khu trú, co giật, vòng đầu to, rối loạn thần kinh kéo dài, hoặc kết quả cấy và các thông số của dịch não tủy bất thƣờng kéo dài để xác định biến chứng. Ở trẻ có sốt và nghi ngờ có tràn dịch dƣới màng cứng nên chụp CT để phát hiện và dẫn lƣu. Đặc biệt ở bệnh nhân viêm màng não mủ do vỡ nền sọ có thoát dịch não tủy, chụp CT có thể phát hiện mức độ khí – dịch, độ mờ của xoang mũi hoặc khí nội sọ. CT cắt dọc có thể định vị đƣợc vị trí vỡ xƣơng. Chụp CT có thể sử dụng chất cản quang tạo độ tƣơng phản rõ giữa dịch – chất hòa tan là cách tốt nhất để xác định vị trí thoát dịch. 2.6.7. Phƣơng pháp xét nghiệm dựa vào kỹ thuật PCR Phƣơng pháp PCR là một phƣơng pháp mới để xét nghiệm bệnh viêm màng não mủ. Phƣơng pháp này có nhiều ƣu điểm nhƣ độ nhạy, độ chính xác cao, cho phép phát hiện trực tiếp và chính xác vi khuẩn gây bệnh trong thời gian ngắn, kĩ thuật thao tác đơn giản và nhanh chóng trên một lƣợng dịch não tủy ban đầu ít. Mặt hạn chế của phƣơng pháp này là sự ngoại nhiễm cao. 2.7. KỸ THUẬT PCR VÀ ỨNG DỤNG TRONG VIỆC PHÁT HIỆN TÁC NHÂN GÂY BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MỦ 2.7.1. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn. Sau đó DNA polymerase sẽ nối dài để hình thành mạch mới. Phƣơng pháp PCR đã đƣợc hình thành dựa trên các đặc tính đó của DNA polymerase. Vậy nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của trình tự, ta sẽ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi. 21 Thành phần cơ bản của phản ứng PCR gồm có: DNA bản mẫu, mồi xuôi và mồi ngƣợc, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP,dTTP), dung dịch đệm cho phản ứng PCR, MgCl2, Taq polymerase. 2.7.2. Quy trình của phản ứng PCR Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba bƣớc và mỗi chu kỳ sẽ tăng gấp đôi số lƣợng mẫu lần trƣớc (nhân bản theo cấp số nhân). Bƣớc 1: Giai đoạn biến tính Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA đƣợc biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thƣờng ở 90oC – 95 oC trong vòng 30 giây đến 1 phút. Bƣớc 2: Giai đoạn bắt cặp (lai) Nhiệt độ đƣợc hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi bắt cặp với khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40oC – 70oC tuỳ thuộc Tm các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút. Bƣớc 3: Giai đoạn kéo dài Nhiệt độ đƣợc tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tổng hợp tốt nhất (DNA polymerase sử dụng là DNA polymerase chịu nhiệt). Thời gian tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần nhân bản. Hình 2.6. Quy trình phản ứng PCR 22 2.7.3. Seminested PCR/ multiplex PCR 2.7.3.1. Seminested PCR Đây là một trong những kỹ thuật phát triển sau này dựa vào nền tảng kỹ thuật PCR. Kỹ thuật này gồm hai bƣớc: Bƣớc 1: là sự nhân bản một trình tự DNA. Bƣớc 2: là sự nhân bản các bản mẫu là các đoạn DNA vừa đƣợc nhân bản. Đoạn DNA đƣợc nhân bản trong bƣớc 2 nằm trong đoạn DNA đƣợc nhân bản trong bƣớc 1. Một trong hai mồi sử dụng ở bƣớc 1 sẽ đƣợc sử dụng lại trong bƣớc 2 để cùng mồi mới tạo thành một cặp mồi. Sau bƣớc đầu tiên, các đoạn DNA chứa đoạn DNA cần nhân bản ở bƣớc 2 đã đƣợc nhân lên rất nhiều so với lƣợng DNA ban đầu. Do đó, ở bƣớc 2, lƣợng bản mẫu sẽ nhiều hơn lƣợng DNA không mong muốn nên sự nhân bản các đoạn DNA mong muốn sẽ diễn ra dễ dàng hơn, dẫn đến sự nhân bản đặc hiệu hơn. 2.7.3.2. Multiplex PCR Multiplex PCR là một kỹ thuật dùng nhiều cặp mồi khác nhau trong cùng một phản ứng PCR để nhân bản đồng thời nhiều đoạn trình tự. Số lƣợng các sản phẩm PCR khác nhau đƣợc nhân bản trong cùng một phản ứng PCR có thể từ 2 sản phẩm đến tối đa 15 sản phẩm, điều này có nghĩa là có thể dùng đến 15 cặp mồi trong cùng một phản ứng. Kỹ thuật này đƣợc thử nghiệm thành công vào năm 1988 và từ đó đã đƣợc áp dụng thành công trong nhiều công trình nghiên cứu về các biến đổi di truyền ở ngƣời cũng nhƣ nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác. Kỹ thuật multiplex PCR thƣờng dùng để kết hợp với kỹ thuật nested PCR hay seminested PCR nhằm thu đƣợc kết quả với độ chính xác và độ đặc hiệu cao. 2.7.4. Ứng dụng kỹ thuật PCR trong việc phát hiện vi khuẩn gây bệnh viêm màng não mủ Gene 16S rRNA của các vi khuẩn thuộc nhóm Eubacteria có những vùng bảo tồn cao ở cấp độ nhóm, xen kẽ với các vùng biến động khác nhau giữa các loài trong nhóm. Do đó, những trình tự này rất phù hợp với mục đích thiết kế mồi nhằm phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn và các kỹ thuật chẩn đoán dựa vào kỹ thuật PCR ngày càng đƣợc phát triển với mục đích tăng độ nhạy của phản ứng. Năm 1994, Radstrom và các cộng sự đã đề ra phƣơng án sử dụng cặp mồi u3 và ru8 để nhân bản vùng trình tự bảo tồn trên gene 16S rRNA trong bƣớc đầu và sử dụng 23 mồi ru8 với các mồi đặc hiệu cho từng loài vi khuẩn để nhân bản vùng trình tự đặc biệt của mỗi loài trong bƣớc 2. Kỹ thuật tiếp tục đƣợc nhóm nghiên cứu phát triển (năm 1998) để phát hiện đồng thời các chủng vi khuẩn gây bệnh viêm màng não mủ trong dịch não tủy nhƣ Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae và Listeria monocytogenes. Cũng vào năm 1994, Greisen và các cộng sự công bố công trình nghiên cứu những mồi và mẫu dò cho gene 16S rRNA của hầu hết các loài vi khuẩn gây bệnh, bao gồm vi khuẩn tìm thấy trong dịch não tủy. Đầu tiên là sự nhân bản vùng trình tự bảo tồn trên gene 16S rRNA bằng phƣơng pháp PCR. Sau đó sử dụng các mẫu dò đặc hiệu để phát hiện DNA các loài vi khuẩn. Tƣơng tự các công trình nghiên cứu trƣớc, Jang – Jih Lu và các cộng sự vào năm 2000 cũng đã thiết lập một cặp mồi chung trên gene 16S rRNA cho các loài vi khuẩn Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Mycobacterium tuberculosis, Legionella pneumophila, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Proteus mirabilis, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis để thiết lập phản ứng PCR nhân bản đoạn có kích thƣớc 996 bp. Ở bƣớc 2 tác giả sử dụng enzyme cắt giới hạn phân cắt đoạn trình tự lớn 996 bp. Các sản phẩm PCR sau khi đã xử lý bằng enzyme sẽ đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 6% và so sánh với thang chuẩn để xác định sự hiện diện của vi khuẩn trong dịch não tủy. Qua một số công trình nghiên cứu trên, chúng tôi thấy hầu hết việc phát hiện vi khuẩn gây viêm màng não mủ đều trải qua bƣớc cơ bản là nhân bản 1 trình tự bảo tồn. Do đó, trong khuôn khổ khóa luận này chúng tôi tiến hành thu thập các trình tự gene 16S và 23S rRNA bảo tồn trên các loài vi khuẩn và lƣu trữ trong CSDL. Từ các trình tự này chúng tôi sử dụng phần mềm Primrose để thiết kế mồi cho phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn gây bệnh viêm màng não mủ. 24 2.8. GENE 16S rRNA VÀ 23S rRNA 2.8.1. RNA ribosome (rRNA) – Cấu trúc ribosome Sự tổng hợp các chuỗi polypeptide trong tất cả các hệ thống sống đƣợc thực hiện tại các ribosome. Ribosome của vi khuẩn có khối lƣợng khoảng chừng 2,5 triệu dalton, có hệ số lắng là 70S, trong đó protein chiếm 1/3 khối lƣợng và phần còn lại là các rRNA. Tất cả các ribosome đƣợc hình thành từ hai tiểu đơn vị ribonucleoprotein có kích thƣớc không bằng nhau. Ở vi khuẩn, những tiểu đơn vị này có hệ số lắng là 50S và 30S. Ribosome ở E. coli cũng nhƣ ở các loài vi khuẩn khác chứa 3 loại rRNA: 16S rRNA, 23S rRNA và 5S rRNA. 16S rRNA ở E. coli có chiều dài khoảng 1542 ribonucleotide là một thành phần cấu thành tiểu đơn vị nhỏ của ribosome. Tiểu đơn vị lớn của ribosome thì chứa hai loại rRNA là 23S và 5S (ở E. coli có chiều dài lần lƣợt là 2904 và 120 ribonucleotide). Ngƣời ta cho rằng rRNA đóng vai trò rất quan trọng trong cấu trúc của ribosome, giúp cho việc gắn kết của các protein ribosome và góp phần quyết định hình dạng của ribosome. Thành phần cấu tạo của ribosome điển hình (ở vi khuẩn E. coli) bao gồm 55 phân tử protein có khối lƣợng khoảng 900 000 dalton, trong số này có 4 phân tử protein cùng loại, các phân tử còn lại là khác nhau. Tiểu đơn vị nhỏ của ribosome bao gồm 21 protein kết hợp với 16S rRNA, tiểu đơn vị lớn bao gồm 34 protein kết hợp với 23S rRNA và 5S rRNA. 25 Hình 2.7. Thành phần cấu tạo của ribosome ở prokaryote Cho đến nay, chƣa có một kết luận hợp lý nào về sự xuất hiện một lƣợng lớn rRNA trong ribosome. Tuy nhiên, mọi ngƣời đều tin rằng các ribonucleotide không bắt cặp trong cấu trúc bậc 2 của rRNA có liên quan đến sự gắn kết của các RNA khác lên ribosome. Chẳng hạn một vài ribonucleotide ở gần đầu 3‟ của 16S rRNA là điểm bắt cặp với các nucleotide (trình tự Shine – Dalgarno) trên phân tử RNA thông tin (mRNA) để ribosome có thể gắn vào RNA thông tin và tiến hành tổng hợp chuỗi polypeptide. Tƣơng tự, một vài trình tự rRNA của ribosome cũng tƣơng tác với các trình tự của RNA vận chuyển (tRNA) khác nhau trong quá trình tổng hợp protein. 2.8.2. Gene 16S rRNA thƣớc đo tiến hóa Từ năm 1967, Zuckerkand và Pauling đã đƣa ra ý kiến cho rằng các phân tử sinh học có thể là “tài liệu của lịch sử tiến hoá” hay “thƣớc đo tiến hoá”. Để là một thƣớc đo tiến hóa, phân tử đƣợc chọn phải có các đặc điểm sau. - Phân tử phải có mặt ở tất cả các sinh vật khảo sát. - Phân tử không đƣợc truyền qua lại giữa các loài. - Trình tự của phân tử này phải có độ bảo tồn và biến động thích hợp trong khoảng cách tiến hóa khảo sát. 26 - Phân tử phải có kích thƣớc đủ lớn để chứa nhiều thông tin. Mặc dù các tRNA có mặt ở hầu hết các vi sinh vật nhƣng chúng không đƣợc chọn làm thƣớc đo tiến hóa do có kích thƣớc quá nhỏ (75 ribonucleotide). Một thập kỷ sau, vào năm 1977, Woese và các cộng sự đã xác định 16S rRNA là