Luận văn Xây dựng qui trình phát hiện escherichia coli trong thực phẩm bằng phương pháp PCR (polymerase chain reaction) và thử nghiệm ứng dụng

ần của phản ứng; sự xuất hiện những sản phẩm phụ ức chế phản ứng khuếch đại, các bản sao vừa được tổng hợp không bắt cặp với mồi mà chúng tự bắt cặp với nhau... Ngoài ra, số chu kỳ cho một phản ứng còn phụ thuộc vào số lượng bản mẫu ban đầu. 4.3. Ưu nhược điểm của phư ơng p háp PCR để phát hiện v i sinh vật tr ong th ực ph ẩm [10,18] Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước Đoàn Thị Ngọc Tuyền Phương pháp PCR giúp phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm một cách nhanh chóng và tin cậy. Ưu điểm của phương pháp này là thời gian cho kết quả nhanh, ít tốn kém về mặt nhân sự, có thể nhận diện được những sinh vật khó nuôi cấy, việc nuôi cấy tăng sinh là đơn giản hơn và có khi không cần thiết. Ngoài ra, hóa chất cần cho phản ứng PCR sẵn có hơn và dễ tồn trữ hơn so với trường hợp huyết thanh học và không cần dụng cụ và môi trường chẩn đoán phức tạp. Tuy nhiên phương pháp này cũng có một số nhược điểm như: - Sự ức chế hoạt tính của Taq DNA polymerase bởi thành phần phức tạp của mẫu thực phẩm. Mặc dù vậy việc tách chiết và tinh chế DNA từ thực phẩm hay môi trường trước khi thực hiện phương pháp PCR cho phép loại bỏ những hợp chất ức chế. - Mật độ vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong mẫu thường thấp, nên trong đa số trường hợp cần có bước nuôi cấy làm giàu để có mật độ đủ để phát hiện bằng PCR. - Phương pháp PCR không phân biệt được tế bào sống với tế bào chết. Do vậy có thể dẫn đến trường hợp dương tính giả do DNA từ tế bào chết. Ngược lại phương pháp này cho phép phát hiện bào tử dạng tiềm sinh, hay tế bào đã chết của các vi sinh vật gây bệnh hoặc gây ngộ độc. Một giải pháp chung đối với các nhược điểm trên là kết hợp một bước tăng sinh ngắn và một bước ly tâm loại bỏ thành phần môi trường nuôi cấy và rửa tế bào trước khi tiến hành phản ứng PCR. 4.4. Các nghi ên c ứu ứng dụng PCR tr ong phát h iện vi sinh v ật trong thực pha åm [10] Hiện nay, có nhiều ứng dụng của phản ứng PCR trong các bộ kit thương mại dùng để phát hiện đặc hiệu các chủng vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm, bệnh phẩm hoặc những loài khó nuôi cấy. Việc phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm bằng phương pháp PCR cần phải qua bước nuôi cấy tăng sinh chọn lọc vi sinh vật cần phát hiện trước khi tách chiết DNA để thực hiện phản ứng PCR. Sau khi nuôi cấy tăng sinh, tiến hành thu tế bào từ dịch tăng sinh để tách chiết DNA làm khuôn cho phản ứng PCR. Tại Việt Nam đã có một số nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật PCR trong việc phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm tại Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học, Trường ĐH Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP. HCM đã thiết lập Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước Đoàn Thị Ngọc Tuyền được một số bộ kit phát hiện một số loài gây bệnh khác trong thực phẩm như Samonella, Shigella…bằng PCR [10] 5. XÁC NH ẬN H IỆU LỰC PHƯƠNG PHÁP [20, 21] 5.1. Định nghĩa Xác nhận hiệu lực (validation) là quá trình thực hiện để củng cố một mục đích sử dụng, thực hiện một qui trình hay một phương pháp bằng những thí nghiệm kiểm tra và cung cấp những chứng cứ khách quan về những kết quả thu được. Xác nhận hiệu lực một phương pháp phân tích vi sinh mới (hay phương pháp thay thế, alternative method) là quá trình thực nghiệm để so sánh những kết quả thu được từ phương pháp thay thế và kết quả thu được so vớiø phương pháp tiêu chuẩn (phương pháp tham chiếu, reference method) cho cùng mục đích sử dụng. Qui trình xác nhận hiệu lực của phương pháp thay thế thường gồm 2 bước: - Xác nhận hiệu lực sơ cấp (primary validation): bước này do phòng thí nghiệm đề xuất phương pháp mới tiến hành nhằm đưa ra các thông số kĩ thuật của phương pháp để chứng minh rằng phương pháp này có tính năng tương đương hay có nhiều ưu điểm hơn so với phương pháp tiêu chuẩn. - Xác nhận hiệu lực thứ cấp (secondary validation): bước này nhằm thẩm tra các thông số kĩ thuật trong bước xác nhận hiệu lực sơ cấp đồng thời xác nhận độ lặp lại (repeatability), độ tái lập (reproducibility), độ lệch chuẩn (standard deviation) của phương pháp thay thế. Bước này được tiến hành bởi nhiều phòng thí nghiệm khác nhau dưới sự chủ trì của một cơ quan có chức năng. Kết quả xác nhận hiệu lực thứ cấp sẽ được trình lên hội đồng quốc gia hay các tổ chức quốc tế có thẩm quyền ban hành phương pháp để xem xét, đánh giá và ban hành phương pháp trở thành một phương pháp chính thức. 5.2. Các thông số kĩ thuật trong xác nhận h iệu lư ïc phương pháp Độ chính xác (accuracy): là thông số đánh giá khả năng cho kết quả chính xác của phương pháp thay thế so với phương pháp tham chiếu. Độ chính xác của phương pháp thay thế biểu thị bằng tỉ lệ cho kết quả dương hay âm tính trên các mẫu có kết quả dương tính hay âm tính khi phân tích bằng phương pháp tham chiếu. - Độ đúng (precision): là mức độ thống nhất giữa những kết quả kiểm tra độc lập của những lần phân tích khác nhau từ một mẫu chung. Độ chính xác bao gồm độ lặp lại và độ tái lặp. Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước Đoàn Thị Ngọc Tuyền - Độ lặp lại (repeability): là mức độ thống nhất giữa các kết quả từ những lần khảo sát độc lập trên một mẫu xác định ở trong cùng một điều kiện thực hiện về qui trình, thiết bị, người thực hiện, tại cùng một thời điểm. - Độ tái lặp (reproducibility): là mức độ thống nhất giữa các kết quả từ nhiều lần phân tích khác nhau trên một mẫu xác định bằng phương pháp phân tích nhưng được thực hiện tại các phòng thí nghiệm khác nhau, thời gian, điều kiện thực hiện và người phân tích khác nhau. - Độ ổn định (robustness): là khả năng duy trì tính ổn định của kết quả phân tích khi các điều kiện thực hiện có sự thay đổi nhỏ. Độ ổn định cho biết giới hạn thay đổi cho phép của các thành phần tham gia vào qui trình phân tích và cung cấp thông tin về độ tin cậy của phương pháp trong quá trình sử dụng. - Độ nhạy (sensitivity): là chỉ số đánh giá khả năng phát hiện vi sinh vật mục tiêu có trong mẫu của phương pháp thay thế. Chỉ số này là tỉ lệ giữa số kết quả phát hiện dương tính so với số kết quả dương tính khi phân tích bằng phương pháp tham chiếu. - Độ đặc hiệu (specificity): là khả năng phương pháp đó cho kết quả âm tính trên mẫu phân tích không chứa vi sinh vật mục tiêu (được kiểm chứng bằng phương pháp tham chiếu). Chỉ số này là tỉ lệ giữa số kết quả phát hiện dương tính so với số kết quả âm tính khi phân tích bằng phương pháp tham chiếu. - Âm tính giảû (false negative): là kết quả âm tính khi phân tích một mẫu chắc chắn chứa vi sinh vật mục tiêu. - Dương tính giả (false positive): quả dương tính khi phân tích mẫu chắc chắn không chứa vi sinh vật mục tiêu. - Giới hạn phát hiện: là mật độ tế bào vi sinh vật thấp nhất mà một phương pháp phân tích có thể phát hiện được. Tại giới hạn phát hiện, số lần phân tích cho kết quả dương tính phải trên 50%. Việc xác nhận hiệu lực phải chứng minh được rằng phương pháp thay thế có giới hạn phát hiện bằng hoặc thấp hơn giới hạn phát hiện cuả phương pháp tham chiếu. Theo tiêu chuẩn AOAC, giới hạn phát hiện cuả phương pháp phân tích vi sinh vật có thể chọn ở các cấp độ khác nhau. Thấp nhất là 1 –5 tế bào/25g mẫu thực phẩm, cao nhất là 10 – 50 tế bào/25g mẫu thực phẩm. Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước Đoàn Thị Ngọc Tuyền Các thông số kĩ thuật nêu trên cho phép ta đánh giá tính khả thi của phương pháp thay thế, đồng thời cũng cho biết độ tin cậy của kết quả khi phân tích bằng phương pháp này. Các thông số kĩ thuật của phương pháp thay thế khi được công bố, sẽ cho phép các phòng thí nghiệm lựa chọn phương pháp phù hợp với yêu cầu và năng lực của mình. 5.3. Ý nghĩa c ủa v iệc xác nhận hiệu lực phươ ng ph áp thay thế Một phương pháp mới phải được đánh giá so sánh với những phương pháp truyền thống đã được xem là đáng tin cậy, được sử dụng từ trước tới nay. Việc đánh giá này giúp cho chúng ta nhận định một cách tương đối phương pháp nào là tối ưu hơn về các mặt như thời gian, tiền bạc... Từ đó tùy vào điều kiện yêu cầu cụ thể phòng thí nghiệm và người phân tích sẽ lựa chọn phương pháp mang tính hiệu quả nhất đáp ứng cho công việc của mình. Do đó việc xác nhận hiệu lực phải được thực hiện một cách khách quan và phải được kiểm định lại bởi các cơ quan tổ chức có thẩm quyền. Xác nhận hiệu lực phương pháp thay thế giúp bổ sung những thiếu sót hạn chế của phương pháp để trở thành một phương pháp đáng tin cậy và được sử dụng rộng rãi. Trong bối cảnh vấn đề về an toàn vệ sinh thực phẩm đang rất được quan tâm như hiện nay, việc lựa chọn phương pháp phân tích nào để đánh giá chất lượng của các loại thực phẩm là vấn đề rất quan trọng. Việc xác nhận hiệu lực để hoàn thiện phương pháp, giúp phương pháp thay thế được chấp nhận rộng rãi tạo sự thống nhất, sự hòa hợp mang tính quốc tế trong việc phân tích các chỉ tiêu vi sinh sẽ góp phần mang lại sự tiện lợi trong quá trình mua bán trao đổi các mặt hàng thực phẩm. Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước Đoàn Thị Ngọc Tuyền PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. VẬT LIỆU 1.1. Thiết bị v à dụng cụ Các dụng cụ và thiết bị chính được sử dụng bao gồm: - Máy dập mẫu STOMACHER 400 CIRCULATOR - Máy ly tâm (Hettich Centrifuge) - Máy luân nhiệt Mastercycler do hãng Eppendorf sản xuất - Bộ điện di ngang Horizon 58 (Life technoogy) - Hộp soi đèn tử ngoại Hoefer (Model No UVTM – 19 – 30V) - Bể điều nhiệt - Tủ ấm - Tủ sấy - Nồi hấp - Máy chụp hình gel IMAGE MASTERS VDS (Amersham Pharmacia Biotech APB) 1.2. Hoá chất và môi trường: - Hóa chất dùng cho PCR + Taq DNA polymerase do Amersham Pharmacia Biotech (APB) cung cấp có nồng độ 5U/ml. Enzyme này được bảo quản trong dung dịch gồm 500mM Tris HCl pH 7,5, 0,1 mM EDTA, 5mM DTT và 50% glycerol, được bảo quản ở - 20C. + Đệm PCR 10X: được cung cấp kèm với Taq DNA polymerase. Thành phần dung dịch đệm này gồm 500mM KCl, 15mM MgCl2,100mM Tris HCl pH 9,0, được bảo quản ở nhiệt độ phòng. + dNTP được cung cấp bởi APB; mỗi dNTP có nồng độ 100mM trong nước, pH 7,5. Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước Đoàn Thị Ngọc Tuyền + Mồi: trình tự đích được chọn đối với E. coli là một phần của gen uidA qui định sự tổng hợp enzym ß-D-glucuronidase hiện diện ở tất cả các chủng của loài E. coli. Cặp mồi EC tự thiết kế để tạo sản phẩm khuếch đại dài 299bp. + Thang DNA: trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng thang DNA chuẩn 100bp do Promega cung cấp ; kích thước các vạch của thang chuẩn như Hình 4. H ình 4. Thang DNA ch uẩn 100bp - Hoá chất dùng cho điện di và quan sát kết quả + Gel agarose (Sigma): gel nồng độ 1,5% agarose được pha trong đệm TAE. + Dung dịch nhuộm DNA trên gel: ethidium bromide 5mg/ml + Đệm TAE 1X chứa 4,48g Tris, 2ml Na2 EDTA 0,5M pH 8,0, 1,14ml glacial acetic acid và nước vừa đủ 1000ml. + Dung dịch TE chứa10 mM Tris – HCl pH 8,0. + Dung dịch nạp mẫu (Loading dye buffer) có thành phần 30% glycerol, 0,15% bromophenol blue, 200mM Tris, 20mM EDTA. - Thuốc thử sinh hóa + Thuốc thử Kovac ,s: 5g p–ethylamino benzaldehyde trong 75ml amyl hoặc isoamyl alcohol chứa 25ml HCl đậm đặc. + Thuốc thử Methyl red: hòa tan 0,1g đỏ methyl vào 300ml ethanol 95%. Thêm nước cất vào cho đủ 500ml. + Thuốc thử Voges Proskauer: 5% -napthol trong cồn tuyệt đối và dung dịch KOH 40%. Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước Đoàn Thị Ngọc Tuyền - Dung dịch Saline pepton Water (SPW): dùng để đồng nhất mẫu thực phẩm có thành phần gồm 1g pepton; 5g NaCl, nước cất vừa đủ 1lít. Hấp 121C trong 15 phút. - Môi trường Tryptic Soya Agar (TSA) dùng để phục hồi và giữ giống vi sinh vật thành phần gồm 1,5g Trypticase pepton, 3g Phytone pepton, 20g NaCl, 15g agar nước cất vừa đủ 1 lít. Đun để hoà tan môi trường, phân phối 5ml vào các ống nghiệm, hấp 121C trong 15 phút, pH cuối 7,3 ± 0,2. - Môi trường Tryptic Soya Broth (TSB): dùng để hoạt hóa giống vi sinh vật. Thành phần môi trường gồm 17g Trypticase pepton, 3g Phytone pepton, 20g NaCl, 2,5g KH2PO4, 2,5g glucose, nước cất vừa đủ 1 lít. Đun nóng, lắc nhẹ để hòa tan, phân phối vào erlen hoặc ống nghiệm, hấp 121C trong 15 phút, pH cuối cùng 7,3 ± 0,2. - Môi trường Plate Count Agar (PCA): dùng để kiểm tra mật độ vi sinh vật bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Thành phần môi trường gồm 17g casein, 3g solbean meal, 5g NaCl, 2,5g K2HPO4, 2,5g glucose, nước cất vừa đủ 1 lít, pH cuối cùng 7,3 ± 0,3. - Môi trường Brilliant Green Bile Lactose Broth (canh BGBL): dùng để tăng sinh chọn lọc E. coli. Thành phần môi trường gồm 10g pepton, lactose10g, 20g mật bò, 0,0133g brilliant green nước cất vừa đủ 1 lít. Hòa tan pepton và lactose vào 500ml nước cất, mật bò vào trong khoảng 200ml và brilliant green trong khoảng 100ml nước cất. Trộn đều 3 dung dịch đạt thể tích cuối cùng là 1 lít, chỉnh pH môi trường khoảng 7,4 và phân phối 10ml vào mỗi ống nghiệm có chứa ống Durham. Hấp 110C trong 15 phút, pH 7,2 ± 0,2 ở 25C. - Môi trường EMB: dùng để phân lập E. coli có thành phần gồm 10g peptone, 2g K2HPO4, 5g lactose, 5g saccharose, 0,4g đỏ Eosin, 0,07g xanh methylen, 13,5g agar. - Môi trường thử nghiệm sinh hóa + Simon citrate: dùng để thử nghiệm khả năng sử dụng citrate của vi sinh vật có thành phần gồm 2g sodium citrate, 5g NaCl,1g KH2PO4,1g NH4H2PO4, 0,2g MgSO4, 0,08g xanh Bromthymol, 15g agar, nước cất vừa đủ 1 lít, pH 6,8 ± 0,2. + Trypton water (nước trypton): dùng để thử nghiệm khả năng sinh Indol có thành phần gồm 20g tryptone hoặc trypticase, nước cất vừa đủ 1 lít, pH 7,3 ± 0,2 . Phân phối 4ml môi trường vào các ống nghiệm, hấp 121C trong 15 phút. Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước Đoàn Thị Ngọc Tuyền + Môi trường thử nghiệm MR – VP có thành phần gồm 7g buffered pepton powder, 5g glucose, 5g KH2PO4 nước cất vừa đủ 1 lít, pH cuối cùng 6,9 ± 0,2. Hoà tan môi trường trong nước nóng, phân phối 10 ml vào ống nghiệm hấp 121C trong 15 phút. 1 .3. Vật li ệu thí nghiệm - Mẫu thực phẩm: mẫu thực phẩm sử dụng trong nghiên cứu này được mua từ các chợ (Tân Phú, Thủ Đức, Bào Sen,ï Nancy, Trạm 2 Cầu Vượt và siêu thị ( Đầm Sen , Miền Đông) trong tháng 8 năm 2004 thuộc khu vực thành phố Hồ Chí Minh. - Chủng vi sinh vật: các chủng vi sinh vật dùng trong luận văn được nhận từ Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học phân tử Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP. HCM, bao gồm: Salmonella typhimurinum, Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus, Staphylococus aureus, Shigella sonnei, Clostridium botulinum ,Clostridium perfringgens và các chủng E. coli có nguồn gốc từ Đại học RMIT (Úc) và Viện Pasteur TP. HCM. 2. PHƯƠNG PHÁP 2.1. Thu và chuẩn bị mẫu Mẫu thực phẩm được chọn đại diện cho các loại thực phẩm theo hướng dẫn của qui trình đánh giá NordVal (Đan Mạch). Mẫu được thu mua từ các chợ, siêu thị và được bảo quản tạm thời trong các bao nilon vô trùng ở điều kiện lạnh và được đông lạnh ở - 20C tại phòng thí nghiệm. Trước khi xử lý mẫu, rửa sạch tay bằng xà phòng, nước sạch và sát trùng bằng cồn 70. Thực hiện việc xử lý mẫu bên trong tủ cấy vô trùng. Dùng cồn 70 sát trùng kéo, nhíp và miệng bao nylon. Ghi chú chi tiết như tên mẫu, ngày lấy mẫu, ký hiệu mẫu trên bao nilon. Dùng kéo, nhíp thu chính xác 10g mẫu một cách ngẫu nhiên ở nhiều điểm khác nhau trên khối mẫu vào bao dập mẫu, đồng nhất và tiến hành phân tích. 2.2. Đồng nhất mẫu Thêm 90g môi trừơng Saline Pepton Water (SPW) vào bao dập mẫu chứa 10g mẫu. Đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu ở tốc độ 230 vòng/phút trong 30 giây. Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước Đoàn Thị Ngọc Tuyền 2.3. Phương pháp pha loãng bậc 10 Dịch tế bào sau khi tăng sinh được pha loãng bậc 10 liên tiếp trước khi tiến hành xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Chuẩn bị các eppendorf chứa 0,9ml nước muối sinh lý 0,85% vô trùng. Dùng pipetman và đầu tip vô trùng chuyển 0,1ml dịch tế bào vi khuẩn vào eppendorf. Vortex để được dung dịch có độ pha loãng là 10–1. Hút 0,1ml dung dịch có độ pha loãng 10–1 cho vào ống nghiệm khác và thực hiện như trên để có độ pha loãng 10–2. Lặp lại việc pha loãng một cách tương tự để có các dịch pha loãng 10 –3 đến 10–9. 2.4. Định lượng E. coli bằng p hương pháp đếm khuẩn lạc Dùng pipetman và đầu tip vô trùng chuyển vô trùng 0,1ml mẫu ở các độ pha loãng khác nhau vào giữa đĩa petri vô trùng; sử dụng mỗi đầu tip riêng cho một độ pha loãng và mỗi độ pha loãng thực hiện từ 2 – 4 đĩa. Đỗ 15 - 20ml môi trường thạch PCA (đem đun chảy và để nguội 45oC) một cách vô trùng vào đĩa petri. Xoay tròn hộp petri khoảng 5 lần xuôi và ngược chiều kim đồng hồ. Đặt đĩa trên mặt phẳng ngang cho đông tự nhiên. Khi môi trường đã đông, lật úp đĩa và đặt vào tủ ấm ở 37 ± 1C trong 24 giờ. Đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa. Chọn nồng độ pha loãng có số lượng khuẩn lạc nằm trong khoảng 25 – 250 khuẩn lạc/petri. - Tính số lượng khuẩn lạc có trong 1ml mẫu như sau: C = N/ n1x v1x f1+ ....+ ni x vi x fi (CFU/ml) Trong đó, C: số lượng vi sinh vật trong 1ml mẫu (CFU/ml) N: tất cả các khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa ni: số lượng đĩa được đếm tại độ pha loãng i V: thể tích dịch mẫu cấy vào trong 1 đĩa fi: độ pha loãng tương ứng 2.5. Phân lập chu ûng E. coli từ mẫu thực p hẩm - Tăng sinh: cân chính xác 10g mẫu vào một bao PE, bổ sung 90g môi trường BGLB. Đem đồng nhất mẫu và hút 1ml cho vào ống trường Durham, ủ ở 44C ± 0,5C trong 24 giờ. Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước Đoàn Thị Ngọc Tuyền - Phân lập: sau khi tăng sinh 24 giờ dùng khuyên cấy ria dịch mẫu từ ống có phản ứng dương tính (có bọt khí trong ống Durham) lên môi trường EMB. Ủ ở 37C trong 24 giờ. Quan sát đặc điểm hình thái đặc trưng của khuẩn lạc E. Coli (màu đỏ tía, có ánh kim, bờ đều, đường kính 0,5mm). - Khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hoá: các khuẩn lạc nghi ngờ là E. coli trên môi trường EMB được cấy sang ống nghiệm chứa môi trường TSA thạch nghiêng. Ống nghiệm được ủ ở 37C ± 0,5C trong 24 giờ. Cấy các khuẩn lạc vào các ống môi trường thử nghiệm sinh hoá sau đây: 1 ống canh trypton; 2 ống MR-VP; 1 ống Simon citrate để thực hiện thử nghiệm IMViC (indol, methyl red, VP và citrate). + Thử nghiệm Indol: nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac,s vào canh khuẩn trong môi trường canh trypton. Phản ứng indol là dương tính khi có vòng đỏ xuất hiện trên bề mặt, phản ứng là âm tính khi không có vòng đỏ trên. + Thử nghiệm Methyl Red: nhỏ vài giọt thuốc thử Methyl Red vào canh khuẩn trong môi trường MR–VP, lắc đều. Phản ứng MR là dương tính khi canh khuẩn chuyển sang màu đỏ, phản ứng là âm tính khi canh khuẩn không chuyển màu. + Thử nghiệm Voges Proskauer: cho 0,2ml thuốc thử –napthol 5% vào canh khuẩn MR–VP, lắc mạnh; bổ sung thêm 0,2 – 0,3 ml KOH 40%, lắc mạnh, quan sát 10 – 30 phút. Phản ứng VP là dương tính khi canh khuẩn chuyển sang màu đỏ, phản ứng là âm tính khi canh khuẩn không chuyển màu. - Thử nghiệm Simon citrate: trong môi trường Simon citrate, phản ứng là dương tính khi môi trường có xuất hiện sinh khối vi khuẩn và màu môi trường chuyển sang xanh da trời, phản ứng là âm tính khi môi trường không có sinh khối và không chuyển màu. Qui trình phân lập, định danh E. coli bằng phương pháp nuôi cấy và thử nghiệm sinh hóa được tóm tắt trên H ình 5. Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước Đoàn Thị Ngọc Tuyền Lấy 1g (1ml) mẫu vào 10ml môi trường BGBL Ủ ở 44C  0,5C trong 24 – 48 giờ Chọn các ống có sinh hơi cấy sang EMB agar. Mẫu không sinh hơi được xem là âm tính E. coli Ủ ở 37  0,5C trong 24 giờ Chọn khuẩn lạc dẹt, có ánh kim tím, đường kính khoảng 1mm để cấy sang TSA Ủ ở 37C  0,5C qua đêm Thử nghiệm IMViC E. coli có biểu hiện sinh hoá: Indol (+), MR (+), VP (-), Citrat (-). Một trong số các phản ứng trên sai là không phải E. coli Kết luận: có hay không có E. coli/g thực phẩm H ình 5. Quy trình phân l ập, định danh E. coli bằng phương p háp nuôi cấy v à thư û nghiệm sinh hoá Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước Đoàn Thị Ngọc Tuyền 2.6. Thu và xử lý khuôn DNA ch o ph ản ứng PCR Hút 1ml dịch tăng sinh cho vào eppdorrf sạch. Ly tâm 800 vòng/phút trong 5 phút. Chuyển phần dịch bên trên sang một eppendorf khác. Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút để thu nhận sinh khối. Rửa sinh khối tế bào trong 1ml nước cất vô trùng. Thu nhận sinh khối sau khi rửa bằng cách ly tâm 10000 vòng/ phút trong 5 phút. Huyền phù hoá sinh khối trong 0,2ml TE. Đun sôi cách thủy dịch huyền phù tế bào trong 10 phút, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút. Dịch nổi phía trên được sử dụng làm khuôn DNA cho phản ứng PCR. 2.7. Điều kiện của phản ứng PCR phát hiện E. coli Phản ứng PCR được thực hiện trong thể tích 25l với các thành phần như sau: - d H2O 13l - Đệm PCR 10X 2,5l - dNTP 10X 2,5l - MgCl2 25 mM 2,5l - Mồi EC1 6 pM 1,0l - DNA 3,0l - Taq DNA polymerase 1UI/l 0,5l Chương trình của phản ứng PCR được thiết lập như sau: hỗn hợp phản ứng được giữ ở 95C trong 10 phút để biến tính hoàn toàn các sợi DNA, đồng thời hoạt hóa Taq DNA polymerase. Phản ứng chính được thực hiện trong 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm: 95C trong 1 phút, 55C trong 45 giây, 72C trong 1 phút. Sau khi kết thúc phản ứng chính mẫu được giữ ở 72C trong 10 phút. Mẫu được giữ ổn định ở 4C trong 30 phút trước khi phân tích. Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Trần Linh Thước Đoàn Thị Ngọc Tuyền 2 .8. Phân tíc h sản p hẩm PCR bằng điện di tr ên g el agar ose - Chuẩn bị gel agarose 1,5%: cân 0,75g agarose vào bình tam giác 100ml, thêm vào 50ml đệm TAE, đun bằng lò vi ba trong khoảng 2 - 3 phút cho đến khi agarose tan hoàn toàn, lắc đều. Để nguội khoảng 60C. Đổ hỗn hợp gel vào khay đổ gel đã chuẩn bị sẵn cùng với các lược tạo giếng. Để yên trong khoảng 30 phút cho gel đông đặc hoàn toàn. Bề dày của gel sau đông đặc khoảng 0,7 - 0,8cm. - Nhẹ nhàng lấy lược ra khỏi gel, đặt khuôn gel vào bồn điện di. Cho dung dịch điện di vào bồn cho đến khi ngập gel. - Cho vào mỗi ống PCR chứa sản phẩm khuế