Nghiên cứu tính đa hình thái đơn của gen aldh2 trên bệnh nhân ung thư gan nguyên phát

ĐẶT VẤN ĐỀ . 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. 3

1.1. Sơ lược về ung thư gan nguyên phát. 3

1.1.1. Tỷ lệ mắc UTGNP trên thế giới và Việt Nam . 3

1.1.2. Các yếu tố nguy cơ . 4

1.1.3. Lâm sàng và cận lâm sàng của UTGNP . 6

1.1.4. Điều trị và tiên lượng UTGNP. 7

1.2. Hệ thống enzym ADH và ALDH và chuyển hóa rượu tại gan. 7

1.2.1. Hệ thống enzym ADH và ALDH. 7

1.2.2. Chuyển hóa rượu tại gan . 11

1.2.3. Chuyển hóa rượu và ung thư gan. 12

1.3. Sơ lược về gen ALDH2. 16

1.3.1. Vị trí và liên quan. 16

1.3.2. Chức năng của gen ALDH2. 16

1.3.3. Tính đa hình của gen ALDH. 17

1.3.4. Gen ALDH2 và bệnh ung thư . 19

1.4. Kỹ thuật xác định đa hình đơn gen ALDH2 . 20

1.4.1. Hiện tượng đa hình đơn nucleotide (SNP). 20

1.4.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định đa hình đơn . 22

2.1. Đối tượng nghiên cứu. 27

2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu. 28

2.3. Phương pháp nghiên cứu. 28

2.3.1. Thiết kế nghiên cứu. 28

2.3.2. Cỡ mẫu . 28

2.3.3. Cách thức tiến hành. 29

pdf43 trang | Chia sẻ: anan10 | Ngày: 02/11/2020 | Lượt xem: 78 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Nghiên cứu tính đa hình thái đơn của gen aldh2 trên bệnh nhân ung thư gan nguyên phát, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
OT, GPT, LDH, ALP tăng. Alpha-Fetoprotein huyết thanh: AFP huyết thanh là một dấu ấn ung thư hữu ích giúp chẩn đoán UTGNP. Hàm lượng AFP huyết thanh có liên quan chặt chẽ đến độ biệt hóa của tế bào ung thư và kích thước khối u. Đối với bệnh nhân UTGNP có khối u <2 cm có biệt hóa tế bào cao thì có hàm lượng AFP huyết thanh thấp hoặc trung bình. Như vậy, vẫn còn tỷ lệ ung thư gan (khối u nhỏ) thì hàm lượng AFP huyết thanh thấp hoặc không tăng, làm hạn chế khả năng chẩn đoán sớm ung thư gan [13], [48], [52].  Siêu âm Siêu âm 2D: Hình ảnh một khối u giai đoạn sớm <3 cm, giai đoạn muộn có thể 10 cm, cấu trúc âm khối đặc tăng âm hoặc giảm âm (thể 1ổ), hoặc thấy nhiều khối đặc nằm rải rác phân thùy gan phải, trái (thể nhiều ổ). Trong thể lan tỏa không có hình khốithấy vùng tăng âm và giảm âm xen kẽ, giới hạn không rõ [48], [52], [26]. Siêu âm Doppler: giúp nghiên cứu sự phân bố mạch trong u, khoảng 75% UTGNP thấy hình tăng mạch máu trong khối u [48], [26]. Ngoài ra, sử dụng các kỹ thuật chẩn đoán hình ảnh khác như chụp cắt lớp vi tính (CTscanner), chụp cộng hưởng từ (MRI) được sử dụng để giúp xác định kích thước và vị trí khối u, và tình trạng di căn của tổ chức ung thư. 7  Mô bệnh học của UTGNP: Các khối u nguyên phát gan phát sinh từ thành biểu mô (90%) hoặc từ thành phần không phải biểu mô [48], [26], [1].  Tế bào học của UTGNP: Trên tiêu bản các tế bào u tập trung thành từng đám, giải bè, có tế bào nhân trần, nhân thoái hóa, màng nhân méo mó, nhân quái, nhiều nhân [48], [26]. 1.1.4. Điều trị và tiên lượng UTGNP 1.1.4.1.Điều trị Tùy theo giai đoạn của ung thư lựa chọn các phương pháp điều trị [26], [52]. - Giai đoạn rất sớm: Phẫu thuật khối u, cắt thùy gan. - Giai đoạn sớm: Phá hủy khối u bằng tiêm ethanol qua da dưới hướng dẫn siêu âm hoặc sóng cao tần. - Giai đoạn phát triển: Nút mạch bằng hóa chất - Giai đoạn muộn: Liệu pháp điều trị đích. - Giai đoạn cuối: Chống đau và điều trị triệu chứng Các phương pháp điều trị [5], [26], [52]. 1.1.4.2.Tiên lượng Bệnh nhân UTGNP tiên lượng rất xấu, thường chẩn đoán giai đoạn muộn khi khối u đã xâm lấn di căn nhiều nơi. Thời gian sống trung bình bệnh nhân từ khi chẩn đoán thường là 6 tháng đến 12 tháng. Tỷ lệ sống thêm 5 năm chỉ là < 5% ở các bệnh nhân UTGNP [4], [52]. 1.2. Hệ thống enzym ADH và ALDH trong mối liên quan đến chuyển hóa rƣợu tại gan 1.2.1. Hệ thống enzym ADH và ALDH Enzym ADH (alcohol dehydrogenase)có chức năngtham gia xúc tác cho phản ứng oxy hóa ethanol thành acetaldehyde với sự thamgia của coenzym NADH. Enzym ADH có cấu tạo dạng protein dimer có trọng lượng 40.000 dalton, cấu tạo trung tâm hoạt động gồm nguyên tử Zn gắn với acid amin Cystein và Histidin và vị trí gắn cofactorNAD+ và alcohol (hình 1.1). 8 Hình 1.1. Mô hình cấu trúc không gian của enzym Alcohol dehydrogenase ADH là enzym có nhiều biến thể khác nhau (gọi là isozyme). Dựa vào trình tự của acid amin và hoạt độ của enzym mà ADH được chia thành 5 nhóm (bảng 1.1), ADH nhóm I chuyển hóa phần lớn rượu trong cơ thể. Các isozyme này là phân tử dimeric được tạo bởi các tiểu đơn vị α, β, γ(αα, αβ, γγ). Các gen mã hóa cho các enzym ADH này nằm trên nhiễm sắc thể số 4, trong đó có ba gen ADH1A, ADH1B, ADH1C mã hóa cho enzym nhóm I, trong đó ADH1B và ADH1C là gen đa hình thái, và đặc trưng cho từng chủng tộc [41]. Hầu hết các mô trong cơ thể đều có enzym ADH. ADH lớp I chủ yếu có ở gan. ADH1A xuất hiện trong những ngày đầu của bào thai, và hoạt tính enzym này kém trong thời kỳ thai nghén và thời kỳ trưởng thành, trong khi đó ADH1B và ADH1C có tổng hoạt enzym tính mạnh nhất trong nhóm. ADH4 liên quan ít đến oxy hóa ethanol, có nhiều ở gan, nhưng nồng độ thấp ở dạ dày, tụy và ruột non. ADH5 có mặt mọi mô trong cơ thể, nhưng oxy hóa ethanol kém. ADH6có ở gan, dạ dày, chức năng chuyển hóa ethanol hiện nay vẫn chưa biết rõ. ADH7 có nhiều ở dạ dày và đường tiêu hóa trên, tham gia chuyển hóa ethanol [25], [24], [71]. 9 Bảng 1.1. Các isoenzym ADH ở người [41]. Nhóm Danh pháp gen Protein Sai khác acid amin giữa các alen Mô Mới Cổ điển I ADH1A ADH1 Α Gan ADH1B*1 ADH2*1 β1 Arg48, Arg370 Gan, Phổi ADH1B*2 ADH2*2 β2 His48, Arg370 ADH1B*3 ADH2*3 β3 Arg48, Cys370 ADH1C*1 ADH3*1 γ1 Arg272, Ile350 Gan, Dạ dày ADH1C*2 ADH3*2 γ2 Gln272,Val350 II ADH4 ADH4 Π Gan III ADH5 ADH5 Χ Mọi mô IV ADH7 ADH7 σ(µ) Dạ dày V ADH6 ADH6 Gan, Dạ dày 1.2.1.1. Đặc điểm của hệ enzyme Aldehyde Dehydrogenase (ALDH) Ở người, có ít nhất 4 lớp ALDH isozyme đã được phát hiện là có tác dụng xúc tác phản ứng chuyển acetaldehyde thành acetate, làm loại bỏ chất độc aldehyde ảnh hưởng đến cơ thể. ALDH có tác dụng oxy hóa hơn 90% acetaldehyde được tạo ra từ phản ứng chuyển hóa đầu tiên của ethanol [25], [24], [71]. Các isoenzym của ALDH có 2 lớp chính là ALDH1, enzyme tìm thấy trong bào tương tế bào và được mã hoá bởi gen ALDH1A1, và ALDH2, enzyme tìm thấy trong ty thể, được mã hoá bởi gen ALDH2. Gen ALDH1A1có kích thước khoảng 52kb nằm trên nhiễm sắc thể số 9 còn gen ALDH2 có kích thước khoảng 43 kb nằm trên nhiễm sắc thể số 12. Cả hai gen đều có cấu trúc tương tự nhau bao gồm 13 exon. Thêm vào đó, các protein tương ứng của 2 gen này có trình tự giống nhau tới 70% và cấu trúc không gian cũng tương tự nhau [64]. Có lẽ, gen ALDH2 được mã 10 hóa bởi gen đa hình thái được nghiên cứu nhiều và biết rõ hơn cả. Các nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh rằng hiện tượng đa hình đơn mã hóa cho enzym ALDH2 liên quan đến nhiều loại hình ung thư [70], [69], [14], [19]. ALDH2*2 là do sự thay thế glutamate bằng lysine ở vị trí acid amin 504. Hậu quả dẫn đến sự tạo thành enzyme ALDH2 gần như mất hoạt tính oxy hoá acetaldehyde thành acetate. Các nghiên cứu dịch chiết gan cho thấy alen ALDH2*2 trội so với alen ALDH2*1 (những người mang một alen ALDH2*2và một alen ALDH2*1, dạng dị hợp tử) cũng không phát hiện thấy hoạt tính của enzyme ALDH [23]. Các nghiên cứu tạo dòng các alen này trên tế bào nuôi cấy cũng thu được kết quả tương tự [55]. Tỷ lệ alen ALDH2*2 bất hoạt phổ biến ở người Trung Quốc, Nhật Bản và Triều Tiên. Tuy nhiên tỷ lệ này rất thấp ở người Châu Âu hoặc Châu Phi [32], [64], [67]. Những người mang alen ALDH2*2 lượng acetaldehyde trong máu tăng từ mức gần như không phát hiện được tới mức cao và gây nên các phản ứng bao gồm nôn nặng, buồn nôn, nhịp tim nhanh và các phản ứng như khi dùng các thuốc điều trị nghiện rượu. Một số nghiên cứu đã cho thấy tác dụng bảo vệ chống tình trạng phụ thuộc rượu khi có mặt alen ALDH2*2[15], [64]. Nghiên cứu tiến hành so sánh 2 nhóm nam giới Trung Quốc, một nhóm mang 2 alen hoạt động ALDH2*1 và 2 bản sao bình thường của alen ADH1B*1 , một nhóm mang 1 alen bất hoạt ALDH2*2 và 2 bản sao bình thường của alen ADH1B*1. Kết quả cho thấy OR của người nghiện rượu giữa 2 nhóm là 0,33. Nếu có thêm alen ALDH2*2, người đó mang ít nhất 1 alen tăng hoạt động ADH1B*2, thì OR còn giảm xuống 0,05. Ở người đồng hợp tử ALDH2*2, tác động của lượng nhỏ rượu cũng rất nặng nề. Điều này càng chứng tỏ enzyme ALDH2 ty thể đóng vai trò quan trọng trong quá trình đào thải acetaldehyde ra khỏi cơ thể và giữ nồng độ acetaldehyde cực thấp. Tương tự như bất kỳ tác động của gen nào đối với nguy cơ bệnh tật của con người thì tác dụng bảo vệ của alen ALDH2*2còn chịu sự chi phối của môi trường. Điều này được minh chứng bởi nghiên cứu của Higuchi và cộng sự (1994). Nghiên 11 cứu này được tiến hành từ năm 1979 đến năm 1992. Trong nhóm những người nghiện rượu Nhật Bản, tỷ lệ người mang alen ALDH2*2 tăng từ 2,5% lên 13%. Qua đó cho thấy, tác dụng bảo vệ chống nghiện rượu của alen ALDH2*2 giảm dần qua thời gian. Trong trường hợp này, nguyên nhân là do sự gia tăng sử dụng rượu ở Nhật. Enzym ALDH1 cũng tham gia đào thải acetaldehyde, giúp kiểm soát nồng độ acetaldehyde ở những người mang alen ALDH2*2. Trong một số nghiên cứu, người ta đã nhận thấy một số tính đa hình của vùng điều hoà gen ALDH1A1ảnh hưởng tới sự biểu hiện của gen này [42]. Mặc dù vậy, tỷ lệ của các alen này thấp và tác động tới nguy cơ nghiện rượu còn chưa sáng tỏ. Một nghiên cứu cho thấy người Tây Nam California mang alen ALDH1A1*2 có tỷ lệ phụ thuộc rượu thấp và làm giảm lượng rượu uống trong 24 giờ [17]. Ngược lại, trong cộng đồng người Úc, enzyme ALDH1 có hoạt tính không có mối liên quan với tình trạng nghiện rượu hay phản ứng với rượu [51]. Sự khác biệt trong kết quả nghiên cứu này có thể là do thực tế là các gen điều hoà hoạt động không giống nhau trong các loại tế bào. Và có thể lượng enzym có hoạt tính trong máu không phản ảnh được lượng enzym trong tế bào gan. 1.2.2. Chuyển hóa rượu tại gan Khi rượu vào cơ thể, 2-8% đào thải qua mồ hôi, nước tiểu và hơi thở, 92-98% được chuyển hóa trong cơ thể. Trong số đó, một lượng nhỏ rượu sẽ được chuyển hóa tại dạ dày và 92-95% từ đường tiêu hóa vào máu tới gan và được chuyển hóa tại gan. Quá trình chuyển hóa tại gan có 2 con đường là oxy hóa và không oxy hóa. Quá trình oxy hóa ethanol tại gan gồm 2 giai đoạn: - Giai đoạn chuyển từ ethanol thành acetaladehyde: Có 3 loại enzym tham gia giai đoạn này  Enzym ADH có tác dụng oxy hóa ethanol thành acetaldehyde, vận chuyển proton H +gắn với coenzym NAD+ thành NADH. ADH hoạt động trong bào tương tế bào gan. 12  Enzym Cytochrome P450 2E1 của gan, tham gia chuyển hóa ethanol thành aldehyd và NADPH thành NADP+  Enzym Catalase có mọi nơi trong cơ thể tham gia chuyển hóa ethanol thành aldehyde và giải phóng O2 từ H2O2 tạo thành H2O. Enzym tham gia chuyển hóa rượu ở não liên quan đến dẫn truyền thần kinh. - Giai đoạn chuyển hóa từ acetaldehyde thành acetate Tham gia phản ứng này là enzymacetaldehyde dehydrogenase với vai trò chuyển aldehyde thành acetate và H+sẽ được gắn với NAD+tạo thành NADH. Enzym này hoạt động trong ty thể và được tìm thấy trong tế bào ở nhiều cơ quan khác nhau trong đó nhiều nhất là ở tế bào gan [25], [24], [71]. Khi acetate được tạo thành thì thường thoát khỏi tế bào gan vào máu và đi vào chu trình Krebs ở các cơ quan khác và tạo nên CO2 và các chất chuyển hóa gây tăng lượngAcetaldehyde“adducts”, ROS (các loại chất oxy hóa) và tăng tỷ lệ NADH/NAD +. Quá trình chuyển hóa acetate cũng làm tăng lượng Acetyl coA và tăng tổng hợp lipid, cholesterol[71]. 1.2.3. Chuyển hóa rượu và ung thư gan. Các con đường chuyển hóa ethanol đã gây ra hậu quả bất lợi, làm tổn thương mô và tế bào, gây bệnh ở những bệnh nhân nghiện rượu. Hậu quả bao gồm thiếu oxy tại gan, hình thành các chất độc, các gốc tự do oxy hóa (ROS), thay đổi tỷ lệ NADH/ NAD + (thay đổi oxy hóa khử của tế bào). - Thiếu máu tại gan. Con đường chủ yến chuyển hóa ethanol dưới xúc tác của ADH và ALDH tạo ra NADH sẽ tiếp tục tham gia vào vận chuyển electron trong ty thể hoặc chuỗi hô hấp tế bào. Để đáp ứng quá trình vận chuyển electrons, tế bào gan cần lượng oxy nhiều hơn mức bình thường. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng chuyển hóa rượu có xu hướng làm tăng hấp thụ oxy từ máu của tế bào gan. Tiêu thụ rượu mãn tính gây thiếu oxy đến gan làm tổn thương tế bào gan. Ngoài ra, ethanol gián tiếp gây tăng sử dụng oxy do hoạt hóatế bào Kuffer ở gan, làm tình trạng thiếu oxy tại tế bào gan trở nên trầm trọng hơn. Khi các tế bào này bị hoạt hóa, chúng giải phóng phân 13 tửnhư prostaglandin E2 gây kích thích một loạt các phản ứng khác đòi hỏi tiêu thụ nhiều oxy hơn tại gan [71]. - Hình thành chất độc. Chuyển hóa ethanol với sự xúc tác ADH và CYP2E1 hình thành acetaldehyde và ROS tương tác protein và các phân tử khác hình thành chất độc bền vững và không bền vững. Acetaldehyde là chất độc gây đột biến gen và ung thư, Acetaldehyde gắn với DNA hình thành “DNA adduct”. Vai trò của Acetaldehyde gây ung thư do rượu có liên quan đến di truyền. Hiện tượng đa hình thái hoặc biến đổi gen mã hóa có liên quan đến tăng hay giảm nồng độ AA [61]. + Acetaldehyde“adducts” Acetaldehyde “adducts” (AA) là cấu trúc màu acetaldehyde gắn với các protein như protein ở màng hồng cầu, lipoprotein, hemoglobin, albumin, collagen và tubulin. AA có thể kết hợp tubulin làm ngăn cản quá trình hình thành vi ống và ảnh hưởng tới sự phân chia tế bào cũng như vận chuyển nội bào hay protein qua màng tế bào [71]. AA kết hợp với collagen, một protein có vai trò quan trọng trong kết nối các mô và kích thích quá trình sinh tổng hợp collagen trong các tế bào hình sao của gan, đây là bước quan trọng trong quá trình hình thành sẹo trong gan, và xơ gan [38]. Acetaldehyde tương tác với các acid amin (cystein, lysine, acid amin nhân thơm) của các protein hình thành “adducts” [21]. “Acetaldehyde-lysin adducts” được tìm thấy ở màng tế bào gan của chuột được uống rượu [57]. Những chất độc này gián tiếp gây tổn thương tế bào gan do cơ thể nhận chúng là những kháng nguyên lạ, và sinhkháng thể chống lại, ví dụ kháng thể gây độc tế bào ADCC(antibody dependent cell mediated cytotoxicity) gây phá hủy tế bào gan [71]. AA có khả năng làm thay đổi tính toàn vẹn của DNA bằng nhiều con đường. Bản chất phản ứng của AA để tạo thành “DNA adduct” là N2-ethyl-2'- deoxyguanosine, N²-propano-dG (PdG). PdG được xem là chất gây đột biến DNA trênđộng vật có vú trong các nghiên cứu in vivo[54], [40]. 14 Chuyển hóa ethanol dưới sự xúc tác của CYP2E1 và oxy hóa NADH bởi chuỗi vận chuyển electron hình thành ROS, ROS tham gia vào quá trình lipid peroxidation hình thành các chất MDA, HNE. AA–MDA–protein "adduct” gây tăng đáp ứng miễn dịch và phản ứng viêm tại gan gây ra bệnh lý tại gan [21]. - Hình thành ROS và sự giảm chất chống oxy hóa. ROS bao gồm các gốc tự do O•, H2O2, OH • , OCL • được tạo ra bởi nhiều phản ứng khác nhau trong cơ thể. ROS hoạt động bằng cách lấy đi ion H+ từ các phân tử khác để chuyển các phân tử thành các gốc tự do có hoạt tính cao. Ngoài ra, ROS kết hợp các phân tử có tính ổn định hình thành gốc tự do khác nhau. Thông qua 2 cơ chế trên, ROS có vai trò quan trọng trong quá trình hình thành ung thư. Trong điều kiện bình thường, có sự cân bằng giữa ROS và các chất chống oxy hóa tồn tại trong các tế bào. Khi cân bằng này bị xáo trộn, ROS sẽ bị dư thừa được gọi tình trạng stress oxy hóa. Trong hầu hết các tế bào, ROS được gắn với chuỗi vận chuyển điện tử ở ty thể. Ngoài ra, ROS còn được tạo ra từ phản ứng do enzym CYP2E1 xúc tác và tế bào Kuffer hoạt hóa tại gan [12]. Tiêu thụ rượu mạn tính và cấp tính đều gây tăng ROS dẫn tới tình trạng stress oxy hóa [56], [20], [59]. Tăng mức ROS gây nên những ảnh hưởng có hại như ROS kích thích tế bào Kuffer giải phóng TNFα, cytokinelàm hoạt hóa quá trình viêm gây tổn thương mô và hình thành tổ chức xơ tại gan. Ngoài ra, ROS còn tương tác với lipid, protein, DNA được gọi peroxidation. Peroxidation tại màng ty thể sẽ gây biến đổi màng ty thể, các phân tử ở ty thể được giải phóng ra bào tương, kích hoạt các chuỗi phản ứng hóa học gây hiện tượng chết tế bào (apoptosis). Hơn nữa, peroxidation các phân tử màng tế bào và ty thể làm thay đổi điện tích qua màng, kết quảgiảm ATP trong tế bào gây hoại tử tế bào gan. Như vậy, ROS không những làm tăng stress oxy hóa mà còn gây tổn thương DNA, đây là yếu tố quan trọng làm phát triển ung thư gan do rượu [12], [18], [71]. - Thay đổi tỷ lệ NADH/NAD+, hoạt hóa gen Quá trình chuyển hóa ethanol làm tăng tỷ lệ NADH/ NAD+trong bào tương và ty thể của tế bào gan. Trong bào tương NADH được tạo ra từ phản ứng ethanol 15 thành acetaldehyde bởi enzym ADH, sau đó được vận chuyển vào ty thể. Tại ty thể NADH được hình thành nhờ enzym ALDH. Tỷ lệ này ảnh hưởng đến biểu hiện của gen, kích hoạt các gen [45]. Tóm lại: Quá trình chuyển hóa rượu gây nhiều yếu tố có hại cho tế bào, mô, các cơ quan, và các chuyển hóa khác trong cơ thể. Tại gan, người ta thấy ảnh hưởng của rượu làm tổn thương tế bào gan là thường gặp nhất. Nghiện rượu, giai đoạn đầu là gan nhiễm mỡ, sau đó là hiện tượng viêm, xơ hóa vàxơ gan do rượu. Stickel (2002) đã chứng minh rằng nghiện rượu có vai trò rất quan trọng phát triển UTGNP (hình 1.2) [28]. Hình 1.2. Chuyển hóa rƣợu ở gan và vai trò hình thành ung thƣ gan Alcohol được chuyển hóa thành acetaldehyde dưới tác dụng của enzym ADH và cytochrom P4502E1, acetaldehyde gắn với DNA tạo thành “DNA adduct” và gắn protein tạo thành sản phẩm gây độc cho cơ thể, có thể hình thành ung thư. Enzym ALDH chuyển acetaldehyde thành sản phẩm không độc là acetate, chất này đi vào chu trình Krebs. Quá trình chuyển hóa ethanol hình thành ROS tạo ra chất MDA-4HNE có thể gắn DNA tạo “DNA adduct”, chất này tạo ra có thể hình thành ung thư gan. Chu trình Krebs Hình thành ung thƣ gan? 16 1.3. Sơ lƣợc về gen ALDH2 1.3.1. Vị trí và liên quan - Gen ALDH2 mã hóa cho enzym ALDH2 của ty thể. Gen này nằm trên nhiễm sắc thể số 12, nhánh dài, vùng 2, băng 4 (12q24). Hay nói cách khác là gen ALDH2 nằm ở cánh dài nhiễm sắc thể số 12, vị trí 24.2 (12q24.2). - Chính xác hơn, vị trí của gen ALDH2 là từ cặp Nucleotide 111,766,886 đến cặp Nucleotide 111,809,984 trên NST số 12 (hình 1.3). Hình 1.3. Vị trí của gen ALDH2 trên nhiễm sắc thể số 12 ở ngƣời 1.3.2. Chức năng của gen ALDH2 - Các enzyme mã hóa bởi gen ALDH này thuộc về họ Aldehyd dehydrogenase của các enzym xúc tác biến đổi hóa học từ acetaldehyde để thành acid acetic. - Enzyme ALDH có hai đồng dạng lớn là: bào tương và ty lạp thể, có thể được phân biệt bởi tính điện di linh động, tính chất động học. - Enzyme ALDH2 gồm có 517 acid amin, trọng lượng phân tử là 56000 Dalton. - Enzyme ALDH2 được thấy ở một vài mô trong cơ thể người với nồng độ cao nhất ở mô gan. Vị trí tồn tại cũng như hoạt động của nó là chất nền của ty thể. Enzyme ALDH2 tham gia vào quá trình chuyển hóa rượu tại gan trong cơ thể, chính xác hơn là nó xúc tác biến đổi hóa học từ acetaldehyde thành acid acetic. 17 1.3.3. Tính đa hình của gen ALDH 1.3.3.1. Tính đa hình của gen Genome của loài người có những biến thể di truyền khác nhau và điểm đó làm nên sự khác nhau giữa các cá thể trong cộng đồng. Phần lớn những biến thể đó là do sựkhác biệt của hàng triệu các điểm đa hình tại những vị trí Nucleotide nhất định nằm giải rác trên toàn bộ genome đã làm thay đổi mã di truyền hoặc làm thay đổi hoạt động của gen. Những điểm khác biệt đó được gọi là những điểm đa hình đơn nucleotide (single nucleotide polymorphisms, SNP). Về mặt tiến hóa, những điểm khác biệt này được giả thuyết là các dạng đột biến trung tính tạo nên sự đa dạng về mặt di truyền giữa các cá thể loài người. Tuy nhiên, một số điểm đa hình SNP có thể liên quan đến khả năng mẫn cảm với bệnh [58], [37], [27]. 1.3.3.2. Tính đa hình của gen ALDH2 Trong cùng một cách thức như ADHs của người là tính đa hình, trình tự mã hóa của gen ALDH2 ở người mang một sự thay đổi một Nucleotide có tính chất quyết định tại codon 487 (G  A trong exon thứ 12, nghĩa là GAA đối với allen ALDH2.1 và AAA đối với ALDH2.2). Ở cấp độ Protein, sự đa hình gen tương ứng với sự thay thế Glutamat (dạng 1) thành Lysine (dạng 2) dẫn đến việc không hoạt hóa sự hoạt động của Enzyme. Trong các dị hợp tử, sự bất thường của allen ALDH2 trội hơn so với allen ALDH1 bởi vì sự liên hợp giữa allen ban đầu và alen đột biến làm bất hoạt các protein nhiều đơn vị [63]. Một vài nghiên cứu dịch tễ học và lâm sàng được tiến hành để xác định tần số của ALDH2.2 ở người bình thường và người người nghiện rượu. Thông thường, kiểu hình của ALDH được biểu diễn bằng sự điện dihoặc từ việc sinh thiết gan. Phương pháp này có thể không đáng tin cậy vì sự bất hoạt của ALDH trong hệ Protein. Vì mục đích xác định sự đa hình của gen A2, ta cải tiến bằng phương pháp giải trình tự gen ALDH ty thể từ mẫu máu, lỏng hoặc khô trên giấy lọc. Hai allen này được phân biệt với nhau thông qua kết quả cắt giới hạn sau PCR và gây đột biến trong vùng đa hình của gen. 18 Trong điều kiện sinh lý bình thường thì acetaldehyde sinh ra trong tế bào sẽ lập tức được chuyển hóa thành acetate là một chất không độc nhờ hoạt tính của ALDH (giai đoạn 2). Tuy nhiên nếu cơ thể tiếp xúc với một lượng chất cồn quá nhiều, trong một khoảng thời gian dài và cùng với những thay đổi trong hoạt tính của ADH, CYP2E1 và ALDH, có thể do đột biến hay do tác động bởi các kiểu gen khác nhau sinh ra từ các SNP, thì lượng acetaldehyde tăng cao và sẽ là nguồn gốc cho sự hình thành và phát triển ung thư[46], [72]. Hình 1.4. Sơ đồ quá trình chuyển hóa ethanol tại gan Rượu được chuyển hóa thành acetaldehyde nhờ hoạt tính enzym của ADH và CYP2E1. Acetaldehyde là một chất có độc tính tiếp tục được chuyển hóa thành một chất không độc acetate nhờ ALDH (hình 1.4). Hiện tượng đa hình thái của ADH và ALDH tạo ra các kiểu gen khác nhau có thể gây tích lũy acetaldehyde và dẫn đến sự phát sinh phát triển ung thư. Gen ALDH2 có các đa hình đơn (SNP) tạo ra các isoenzym có thuộc tính động học khác nhau. Sự thay đổi 2 acid amin tại các vị trí xác định trên gen ALDH2 (exon 12) tạo ra 2 alen đa hình thái là ALDH2*1 và ALDH2*2. Enzym được mã hóa bởi alen ALDH2*1 có Glu ở vị trí 487. Enzym được mã hóa bởi alen ALDH2*2 có Lys ở vị trí 487, là enzym có hoạt tính thấp, gần như bất hoạt trong việc chuyển hoá acetaldehyde thành acetate. Tỷ lệ alen ALDH2*2 bất hoạt phổ biến ở người Trung Quốc, Nhật Bản và Triều Tiên. Tuy nhiên tỷ lệ này rất thấp ở người Châu Âu hoặc Châu Phi[64], [32]. 19 Sự đa hình thái của gen mã hóa cho các enzym ALDH2 làmcho các enzym có hoạt tính thay đổi. Alen ALDH2*1 mã hoá enzyme có khả năng oxy hóa acetaldehyd trong khi alen ALDH2*2 mã hoá enzyme gần như mất hoạt tính. Trong một quần thể hay nhiều quần thể khác nhau, thì tốc độ chuyển hóa rượu của từng cá thể khác nhau tùy thuộc cá thể đó mang kiểu gen và alen ALDH2 nào [9]. Vì vậy, bên cạnh rượu có ảnh hưởng gián tiếp đến tổn thương các tế bào và mô cơ quan trong cơ thể thì yếu tố di truyền là yếu tố nguy cơ quan trọng trong việc hình thành và phát triển ung thư. 1.3.4. Gen ALDH2 và bệnh ung thư Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng sự tác động sự đa hình thái của genALDH2 và lượng rượu tiêu thụ của bệnh nhân có nguy cơ gây ra một số loại ung thư. - Gen ALDH2 và ung thư đại trực tràng(UTĐTT). Hua Zhao và cộng sự (2014) công bố nghiên cứu phân tích tổng hợp nhiều nghiên cứu khác nhau để tìm mối liên quan đa hình thái Glu487Lys của gen ALDH2 với nguy cơ UTĐTT [72]. Kết quả phân tích 11 nghiên cứu bệnh-chứng trên 2909 bệnh nhân và 4093 người thuộc nhóm chứng cho thấy những người có chứa alen ALDH2*2có nguy cơ UTĐTT thấp hơn. - Gen ALDH2 và ung thư thực quản Tác giả Ming Wu và cộng sự (2013) đã so sánh yếu tố nguy cơ của ung thư thực quản liên quan đến mức độ tiêu thụ rượu giữa những người mang kiểu gen ALDH2*1/*1 với người mang kiểu gen dị hợp tử ALDH2*1/*2 và đồng hợp tử ALDH2*2/*2. Kết quả nghiên cứu trên 858 bệnh nhân ung thư thực quản và trên nhóm chứng 1081 người Trung Quốc đã cho thấy người uống rượu trung bình - nhiều và mang gen dị hợp tử ALDH2*1/*2 có nguy cơ mắc ung thư thực quản cao nhất (OR=2,34, 95% CI: 1,52-3,61) so với nhóm người không hoặc uống rượu ít có gen đồng hợp tử ALDH2*1/*1[67]. 20 1.4. Kỹ thuật xác định đa hình đơn gen ALDH2 1.4.1. Hiện tượng đa hình đơn nucleotide (SNP) Hiện tượng SNP hay hiện tượng đa hình đơn Nucleotide là sự khác nhau về trình tự DNA khi một Nucleotide đơn A, C, T hay G trong một chuỗi ADNtương ứng (Hình 1.5) giữa các cá thể của một loài hay giữa các cặp NST của một cá thể.Bộ gen người có 23 cặp NST, trong đó có 22 cặp NST thường và 1 cặp NST giới tính chứa khoảng 3,2 tỷ bp. Kết quả của dự án giải trình tự gen người cho thấy trình tự các nucleotid giống nhau đến 99,9% giữa các cá thể và sự khác nhau ở 0,1% còn lại biểu hiện bằng các đa hình đơn. Chính sự khác nhau này đã quy định đặc điểm riêng của mỗi cá thể, liên quan tính cách, nguy cơ mắc bệnh và sự đáp ứng với điều trị. SNP là hiện tượng phổ biến theo ngân hàng dữ liệu của NCBI tính đến tháng 26/6/2012 có hơn 53 triệu SNPs ở người, xảy ra tần số khá cao từ 1/1000 bp đến 1/100-300 bp. SNP được coi là hậu quả của đột biến điểm thay thế một cặp Nucleotide. SNP xảy ra ở cả vùng mã hóa và vùng không mã hóa của gen. Các SNP tại vùng mã hoá của gen có thể làm thay đổi hoặc không làm thay đổi trình tự các acid amin và cấu trúc phân tử protein mà nó tạo ra. Hầu hết các SNP xảy ra ở vùng không mã hóa và không làm thay đổi cấu trúc của gen, tuy nhiên các SNP có thể nằm ở vùng điều hoà của gen, làm thay đổi mức độ sao chép gen hay ảnh hưởng đến quá trình hoàn thiện RNA thông tin. Dựa vào trình tự acid amin của của phân tử protein do gen tổng hợp có thể chia làm 2 loại - Biến đổi im lặng là những biến đổi không làm thay đổi sản phẩm gen, ví dụ bộ ba mã hóa GAC và GAG đều mã hóa cho acid amin leucine, không

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdf01050003413_1_7601_2002710.pdf
Tài liệu liên quan